WESTERN

BLOTTING
 Pokok Bahasan

1
Definisi Protein 2

Sifat dan Jenis Protein 3

Teknik Isolasi Protein

4
Definisi Westren Blot
5

Teknik Westren Blot

 Definisi Protein

Protein adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul

tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer
asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan
ikatan peptida yang mengandung unsur-unsur C, H, O, N
dan ada pula yang mengandung unsur S dan P.
 Definisi Protein

Protein terletak didalam sel makhul hidup, terutama dalam membran

sel baik itu pada sel hewan maupun pada sel tumbuhan.
 Isolasi Protein

Isolasi protein adalah suatu cara memisahkan protein

dari makromolekul yang lain atau memisahkan
protein dari protein lain yang tidak diinginkan.

Secara sederhana, proses dari isolasi

protein konsepnya sama dengan isolasi
DNA, hanya saja isolasi protein
menggunakan buffer lysis untuk
melisiskan sel.
 Faktor-faktor yang mempengaruhi isolasi
protein

 Suhu
 pH
 Radiasi
 Pelarut Organik
 Ion Logam
 Enzim-enzim
 Perlakuan mekanis
 Penambahan garam
Isolasi Protein Intraseluler
Secara Umum
Sel

Lisis

Sentrifugasi
Pelet Supernatan
 Pelisisan Sel

Metode Pelilisan Sel

1 2
Mekanik Kimiawi

Homogenisasi tingkat tinggi

Larutan buffer
Ekstruksi tekanan tinggi
Detergen
Metode blending
Kelator
Penggerusan
Inhibitor protease
Sonikasi
 Pelisisan Sel
1
Mekanik
Pengerusan

Untuk memecah dinding sel dan memperluas

permukaan sampel agar dapat mempermudah
proses ekstraksi sehingga Interaksi antara
sampel dan pelarut akan semakin luas.
 Pelisisan Sel
2
Kimiawi
Penambahan Larutan
Buffer

Penambahan buffer ekstrak selama

penggerusan bertujuan untuk
mempertahankan agar kondisi
komponen sel tetap optimum seperti
keadaan yang sebenarnya dan tidak
mengalami perubahan.
 Pelisisan Sel
2
Kimiawi
Detergen

H H2 Penambahan detergen selama

H2C C C O P O penggerusan bertujuan Untuk
memecah membran sel yang
O O O
penyusun utamanya fosfolipid
O C C O sehingga akan terjadi reaksi
saponifikasi antara fosfolipid dan
R R Fosfolipid detergen pada sel.
 Pelisisan Sel
2
Kimiawi
Klasifikasi Detergen

a b
Detergen Ionik : dapat Detergen Nonionik : dapat
memecah memecah interaksi lipid-lipid dan
interaksi protein-protein interaksi lipid-protein
 Pelisisan Sel
2
Kelotor Kimiawi

Penambahan kelator selama penggerusan

EDTA (Etilen Diamin Tetraasetat)
bertujuan untuk menghilangkan ion-ion
aktivator enzim protease. Misalkan EDTA
dapat berperan sebagai chelating agent
dalam isolasi protein. EDTA dapat
mengkelat ion Ca2+ yang dapat berperan
sebagai aktivator enzim protease.
 Pelisisan Sel
2
Kimiawi
Inhibitor Enzim protease adalah enzim yang
Protease dapat memutuskan ikatan peptida
antara asam amino satu dengan asam
amino yang lain.

Untuk mencegah
proses pemutusan
ikatan peptida pada
protein, yaitu dengan Pada sel hewan, enzim protease
cara : Isolasi protein berasal dari lisosom.
dilakukan pada Sedangkan, pada sel tumbuhan
temperatur rendah (4 enzim protease berasal dari
o
C) dan penambahan vakuola
inhibitor seperti EDTA
 Sebelum Sentrifuge

Ditambahkan Amonium Sulfat

O
O
NH4+ Untuk presipitasi garam secara salting out, sehingga
S menyebabkan interaksi hidrophobik antar molekul protein.
2 O Interasi hidrophobik antar molekul protein akan mengakibatkan
O kelarutan protein menjadi rendah dan akan mengakibatkan
penggumpalan, sehingga mudah dapat dipisahkan dengan
sentrifuse. Penggunaan amonium sulfat lebih didasarkan pada
sifat kelarutannya yang tinggi, tidak merusak struktur protein.
 Sentrifuge
Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan
substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan
cara memberikan gaya sentrifugal sehingga
substansi yang lebih berat akan berada di dasar,
sedangkan substansi yang lebih ringan akan
Siap untuk di
terletak di atas. deteksi

Supernatan Memiliki bobot lebih rendah

Pelet Memiliki bobot lebih tinggi

 Definisi Western Blot

1. Western blot adalah proses pemindahan

protein dari gel hasil elektroforesis ke
membran
2. Membran ini dapat diperlakukan lebih
fleksibel daripada gel sehingga protein
yang terblot pada membran dapat
dideteksi dengan cara visual maupun
fluoresensi
3. Deteksi ekspresi protein pada organisme
dilakukan dengan prinsip imunologi
menggunakan antibodi primer dan
W. Neal Burnette antibodi sekunder
TujuanWestern Blot

1. Mengetahui keberadaan & berat

Molekul protein sampel pada campuran
2. Membandingkan reaksi silang antar
protein
3. Mempelajari modifikasi protein selama
sintesis
 Teknik Western Blot

1
Elektroforesis Pemisahan protein berdasarkan ukuran molekul
dalam suatu tegangan listrik tertentu

2 Pemindahan protein dari gel poliakrilamid menuju gel transfer

Elektrotransfer menggunakan arus listrik sebagai faktor pendorong

3 Deteksi protein tersebut memanfaatkan interaksi antara antigen

Deteksi dan antibodi yang bersifat spesifik
Teknik Western Blot
 Elektroforesis
1. Dalam elektroforesis, sampel yang
mengandung protein biasanya dicampur
dengan SDS (sodium dodecyl sulfat)
2. Muatan negatif SDS tersebut mengganggu
kestabilan protein, sehingga protein
mengalami denaturasi.
3. Suatu protein multimer juga akan terurai
menjadi monomer penyusunnya
4. Sampel dengan protein rantai polipeptida lurus
tersebut dimasukkan dalam suatu membran
poliakrilamid yang dialiri arus listrik
5. Dalam gel poliakrilamid tersebut akan
terbentuk pita-pita yang merupakan protein-
protein yang telah terpisah berdasarkan berat
molekul
 Elektrotransfer

1 2
Blotting semi kering Blotting basah tidak
menggunakan kertas saring menggunakan kertas saring
yang telah dibasahi dengan diantara gel poliakrilamid dan
buffer transfer gel transfer, tetapi kedua gel
tersebut diimpitkan dan
direndam dalam buffer transfer

Gel transfer yang

umum digunakan pada
WB ada dua, yaitu
nitroselulosa dan nilon.
 Deteksi Protein
Berdasarkan penggunaan antibodi primer dan antibodi sekunder, ada dua
metode deteksi, yaitu:

1 2
Metode langsung menggunakan
antibodi primer yang telah
terkonjugasi dengan
molekulmarker
Metode tidak langsung
menggunakan antibodi primer
dan antibodi sekunder

• Antibodi primer berfunsi mengikat protein target

• Antibodi sekunder berfungsi mengikat antibodi primer dan
terkonjugasi dengan molekul penanda
• Molekul penanda yang umum digunakan diantaranya adalah
enzim alkalin fosfatase (AP), enzim horsedish peroksidase
(HRP), immunogold, dan 125I
Perbedaan Tekhnik Southern, Northern dan
Western Blotting
Southern Blotting Northern Blotting Western Blotting
Deteksi DNA (ds) mRNA (ss) Protein
molekul
Membran Nitroselulosa, Nilon Nitroselulosa , Nitroselulosa , Nilon
Nilon
Elektroforesis Gel agarosa Gel agarosa poliakrilamid
gel formaldehid
Perawatan gel Pemurnian, denaturasi -
dan netralisasi
Metode Transfer melalui kapiler Transfer melalui semikering
blotting kapiler dan basah

Probes DNA (radioaktif dan cDNA, cRNA DNA

nonradioaktif) (radioaktif dan
nonradioaktif)
Sistem deteksi Autoradiography, Autoradiography Colorimetric detection,
Chemiluminescent Chemiluminescent Chemiluminescent,
Terima kasih