“PERBANDINGAN UJI ABTS, DPPH, FRAP, DAN ORAC

UNTUK MEMPERKIRAKAN AKTIVITAS ANTIOKSIDAN

DARI EKSTRAK BUAH JAMBU BIJI”

Kelompok 6:
1. Muhammad Ary Fikriansyah (180332616544)
2. Naufal Syahma (180332616549)
3. Nisa Salsabila (190332722519))

Tim Promosi UM 2020 1

 1

KERANGKA KONSEP PENELITIAN

Tim Promosi UM 2020 2

 Senyawa Bioaktif
Ekstrak Buah Jambu Biji
(Antioksidan)

(dihasilkan) Asam askorbat

Karotenoid Uji Aktivitas Antioksidan

Ekstraksi

Fenolik (diukur dalam)

Buah Jambu Biji Ekstrak Diklorometana Ekstrak Metanol

(Psidium guajava L.) (AOAD) (AOAM)

(Perbandingan)
• Allahabad Safeda (daging putih)

(Perbandingan)
• Fan Retief, Ruby Supreme dan ABTS ABTS
seleksi lanjutan (daging merah
muda) DPPH DPPH

Keterangan: FRAP FRAP

: Mengandung : Diteliti
ORAC
: Tidak diteliti : Diproses

Tim Promosi UM 2020 3

 Antioksidan alami dalam buah-buahan dan sayuran berkaitan dengan tiga kelompok utama yaitu:
vitamin, fenolat, dan karotenoid. Asam askorbat dan fenolat dikenal sebagai antioksidan hidrofilik,
sedangkan karotenoid dikenal sebagai antioksidan lipofilik. (Halliwell, 1996). Buah jambu biji (Psidium
guajava L.) dianggap sebagai buah yang bergizi tinggi karena mengandung asam askorbat tingkat tinggi
(50–300mg/100 g berat segar). Buah jambu biji Indonesia memiliki sumber karotenoid provitamin A yang
sangat baik (Setiawan, dkk). Senyawa fenolik seperti myricetin dan apigenin (Miean dan Mohamed,
2001), asam ellagic, dan antosianin (Misra dan Seshadri, 1968) juga memiliki kadar yang tinggi pada buah
jambu biji. Buah jambu biji yang akan diekstrak dalam penelitian tersebut adalah satu buah berdaging
putih (Allahabad Safeda) dan tiga buah berdaging merah muda (Fan Retief, Ruby Supreme, dan seleksi
lanjutan lainnya). Ekstrak buah jambu biji dianalisis aktivitas antioksidannya diukur dalam ekstrak
metanol (AOAM), aktivitas antioksidan diukur dalam ekstrak diklorometana (AOAD), asam askorbat,
total fenolat, dan kandungan total karotenoid. Tes ABTS, DPPH, dan FRAP digunakan untuk menentukan
AOAM dan AOAD, sedangkan ORAC hanya digunakan untuk menentukan AOAM. Rata-rata AOAM
adalah 31,1, 25,2, 26,1, dan 21,3 sebagaimana ditentukan oleh ABTS, DPPH, FRAP, dan uji ORAC. Rata-
rata AOAD masing-masing adalah 0,44, 0,27, dan 0,16 sebagaimana ditentukan oleh uji ABTS, DPPH,
dan FRAP. AOAM yang ditentukan oleh semua pengujian berkorelasi baik dengan asam askorbat dan total
fenolik tetapi berkorelasi negatif dengan total karotenoid.

Tim Promosi UM 2020 4

 2

PRINSIP TEKNIK UJI AKTIVITAS YANG

DILAKUKAN

Tim Promosi UM 2020 5

 ABTS (2,2’-azino-bis-(3 etilbenzotiazolin)-6 sulfonate acid)
Metode ABTS merupakan metode penentuan aktivitas antioksidan yang diperoleh
dari hasil oksidasi kalium persulfat dengan garam diammonium ABTS. Adanya
aktivitas antioksidan dari sampel ditandai dengan hilangnya warna biru pada
pereaksi ABTS (Molyneux, 2004).

Prinsip:
Prinsip pengujian aktivitas antioksidan dengan metode ABTS adalah penghilangan
warna kation ABTS untuk mengukur kapasitas antioksidan yang langsung bereaksi
dengan radikal kation ABTS. ABTS adalah suatu radikal dengan pusat nitrogen
yang mempunyai karakteristik warna biru-hijau, yang bila tereduksi oleh
antioksidan akan berubah menjadi bentuk non radikal dari berwarna menjadi tidak
berwarna. Metode ABTS sangat sensitif terhadap cahaya, bahkan pembentukan
ABTS memerlukan waktu inkubasi selama 12-16 jam dalam kondisi gelap.
Tim Promosi UM 2020 6
 DPPH (2,2-DIFENIL-1-PIKRILHIDRAZIL)

Metode peredaman radikal bebas DPPH didasarkan pada reduksi dari larutan
methanol radikal bebas DPPH yang berwarna oleh penghambatan radikal bebas.

Prinsip:
Prinsip kerja metode DPPH adalah adanya atom hidrogen dari senyawa
antioksidan yang berikatan dengan elektron bebas pada senyawa radikal sehingga
menyebabkan perubahan dari radikal bebas (diphenylpicrylhydrazyl) menjadi
senyawa non-radikal (diphenylpicrylhydrazine). Hal ini ditandai dengan
perubahan warna dari ungu menjadi kuning (senyawa radikal bebas tereduksi oleh
adanya antioksidan)

Tim Promosi UM 2020 7

 FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power)

Benzie & Strain (1996) mengemukakan bahwa metode FRAP adalah metode yang
digunakan untuk menguji antioksidan dalam tumbuh-tumbuhan. Kelebihan
metode FRAP ini yaitu metodenya murah, reagennya mudah disiapkan dan cukup
sederhana dan cepat.

Prinsip:
Prinsip metode ini dapat menentukan kandungan antioksidan total dari suatu
bahan berdasarkan kemampuan senyawa antioksidan untuk mereduksi ion Fe³⁺-
TPTZ menjadi Fe²⁺-TPTZ sehingga kekuatan antioksidan suatu senyawa
dianalogikan dengan kemampuan mereduksi dari senyawa tersebut (Halvorsen, et
al., 2002). TPTZ sendiri adalah colorants dan Fe(III) merupakan radikal bebas.

Tim Promosi UM 2020 8

 ORAC (oxygen radical absorbance capacity)

ORAC menggunakan pengukuran reaksi antioksidan dengan senyawa radikal

bebas AAPH (2,2’-azobis-2-amidino-propane), dimana antioksidan akan
mentransfer atom hydrogen untuk mereduksi radikal bebas. Aktivitas terjadi
ketika adanya substitusi OH dengan struktur antioksidan yang diteliti.

Prinsip:
Prinsip dari metode ini, ketika suatu alat azo-initiator yaitu alat yang berfungsi
untuk membuat radikal bebas (peroksil) ditambahkan molekul berwarna atau
fluorescent seperti β-phicoerythrin kemudian dipanaskan, azo-initiator akan
menghasilkan radikal bebas peroksil yang merusak β-phicoerythrin sehingga
kehilangan warnanya atau menjadi tidak berwarna

Tim Promosi UM 2020 9

 3

DATA PENGAMATAN DAN ANALIIS DATA

Tim Promosi UM 2020 10

 Jumlah asam askorbat (AA), total fenolik (TPH), dan total karotenoid yang dinyatakan
sebagai b-karoten (BET) secara signifikan berbeda antar klon jambu biji

na = tidak tersedia.
Kandungan asam askorbat, total fenolik, dan total karotenoid dari
empat genotipe jambu biji • a = Fan Retief', 'Ruby Supreme', dan
Advance selection adalah daging merah
muda; 'Allahabad Safeda' adalah daging
putih.
• b = Asam askorbat dinyatakan dalam
mg/100 g massa .
• c = Total kandungan fenolat dinyatakan
dalam mg setara asam galat/100 g massa.
• d = Total kandungan karotenoid
dinyatakan dalam mg b-karoten setara/
100 g massa.
• e = Rata-rata pemisahan dalam kolom
dengan uji jarak berganda Duncan yang
baru
Tim Promosi UM 2020 11
 ANOVA untuk aktivitas antioksidan di antara tiga penentuan ekstrak metanol tunggal
dengan uji ABTS, DPPH, FRAP, dan ORAC dari empat genotipe jambu biji

Aktivitas antioksidan yang diukur dalam ekstrak

metanol yang diperoleh dengan menggunakan
uji ABTS, DPPH, FRAP, dan ORAC dari ekstrak
tunggal diukur tiga kali untuk menguji
reproduktifitas pengujian. Tes DPPH dan FRAP
tidak menunjukkan perbedaan di antara
penentuan, sedangkan tes ABTS dan ORAC
berbeda di antara proses.

Tim Promosi UM 2020 12

 Aktivitas Antioksidan Diukur Dalam Ekstrak Metanol

ANOVA untuk aktivitas antioksidan dengan uji ABTS, DPPH, FRAP,

dan ORAC berdasarkan ekstraksi metanol dari empat genotipe
jambu biji

Genotipe dan pengujian menghasilkan

aktivitas antioksidan yang berbeda yang
diukur dalam ekstrak metanol (AOAM) .

Tim Promosi UM 2020 13

 Aktivitas antioksidan ekstrak metanol buah jambu biji
yang ditentukan dengan uji ABTS, DPPH, FRAP, dan ORAC
dari empat genotipe jambu biji

Klon pulp putih, ‘Allahabad Safeda’, memiliki

nilai AOAM tertinggi (32,25 mM TE/g).

Tim Promosi UM 2020 14

 Aktivitas antioksidan diukur dalam ekstrak diklorometana

ANOVA untuk aktivitas antioksidan dengan uji ABTS, DPPH, dan FRAP
berdasarkan ekstraksi diklorometana dari empat genotipe jambu biji

Hanya tiga tes, ABTS,

DPPH, dan FRAP, yang
digunakan untuk
mengukur AOAD

. Hasil ANOVA menunjukkan bahwa kadar AOAD berbeda secara

signifikan antar uji (P<0,01) tetapi perbedaan tidak signifikan antar
klon jambu biji, dan antara jambu biji dan uji.

Tim Promosi UM 2020 15

 Aktivitas antioksidan ekstrak buah jambu biji yang ditentukan dengan
uji ABTS, DPPH, dan FRAP berdasarkan ekstraksi diklorometana dari
empat genotipe jambu biji

Rerata kadar AOAD dari keempat jambu biji adalah 0,44, 0,27, dan 0,16 mM TE/g sebagaimana ditentukan
oleh uji ABTS, DPPH, dan FRAP . Tingkat AOAD sangat rendah: kurang dari 2% dari total. Rerata kadar AOAD
dari empat jambu biji yang ditentukan oleh ABTS adalah 2 dan 3 kali uji DPPH dan FRAP (Tabel 6)

Tim Promosi UM 2020 16

 Koefisien korelasi Pearson aktivitas antioksidan, asam askorbat, total
fenolat, dan kandungan total karotenoid

TPH = total fenolik, BET = b-karoten, AA= asam askorbat, ABM = aktivitas antioksidan diukur dalam ekstrak metanol
berdasarkan uji ABTS, ABD = aktivitas antioksidan diukur dalam ekstrak diklorometana berdasarkan uji ABTS, DPM =
aktivitas antioksidan diukur dalam ekstrak metanol berdasarkan uji DPPH, DPD = aktivitas antioksidan diukur dalam ekstrak
diklorometana berdasarkan uji DPPH, FRM = aktivitas antioksidan diukur dalam ekstrak metanol berdasarkan uji FRAP, FRD
= aktivitas antioksidan diukur dalam ekstrak diklorometana berdasarkan uji FRAP, dan ORM = aktivitas antioksidan diukur
dalam ekstrak metanol berdasarkan uji ORAC. ns = tidak signifikan dan *,** signifikan masing-masing pada P< 0,05 atau
0,01,

Tim Promosi UM 2020 17

 4

PEMBAHASAN

Tim Promosi UM 2020 18

 PEMBAHASAN
Kandungan Asam Askorbat, Total Fenolik, dan Total Karotenoid

Jumlah asam askorbat (AA), total fenolik (TPH), dan total karotenoid dinyatakan sebagai: B-karoten (BET)
berbeda nyata antar klon jambu biji (Tabel 1).

Luximon-Ramma dkk. (2003) telah melaporkan bahwa jambu biji putih memiliki AA dan TPH yang lebih
tinggi daripada jambu biji merah muda. Kandungan AA: Putih (142,6 mg/100 g) ; merah muda
(72,2mg/100 g). Kandungan TPH: Putih (247,3 mg GAE/100 g) ; merah muda (126,4mg GAE/100 g).

Kandungan AA, TPH, dan BET pada jambu biji sangat tinggi dibandingkan dengan tanaman buah
lainnya. Pada Nektarin (AA: 4,8-13,2; TPH: 14-102; BET: 0,01-0,19 (mg/100 g)), Persik (AA: 3,6-12,6; TPH:
21-111 (mg/100 g)), Plum (AA: 2,5–10,2; TPH: 42-109; BET: 0,01–0,26 (mg/100 g)) (Gil et al., 2002),
Belimbing (AA: 19,0; TPH: 142,9 (mg/100 g)), Nanas (AA: 27,5; TPH: 47,9 (mg/100 g)), Pepaya (AA: 92,9;
TPH: 57,6 (mg/100 g)), Lengkeng (Luximon-Ramma et al., 2003).

Tim Promosi UM 2020 19

 PEMBAHASAN
Reproduksibilitas Pengujian ABTS, DPPH, FRAP, dan ORAC

 Aktivitas antioksidan yang diukur dalam ekstrak metanol menggunakan uji ABTS,
DPPH, FRAP, dan ORAC dari ekstrak tunggal diukur sebanyak tiga kali untuk menguji
reproduktifitas pengujian.
 Semua pengujian ini tidak memiliki interaksi waktu genotipe, artinya semua teknik
memberikan peringkat aktivitas antioksidan yang sebanding di antara klon dalam
setiap waktu pengujian

Tim Promosi UM 2020 20

 PEMBAHASAN
Reproduksibilitas Pengujian ABTS, DPPH, FRAP, dan ORAC
• Uji ABTS menunjukkan hasil yang berbeda nyata pada prosesnya
• Larutan kerja ABTS perlu disimpan dalam gelap selama 12 jam untuk
menghasilkan radikal bebas dari garam ABTS dan kemudian digunakan tidak

ABTS
lebih dari 4 jam
• Larutan kerja ABTS tidak selalu berumur sama, sehingga aktivitas larutan
untuk bereaksi dengan ekstrak jambu biji mungkin berbeda antar waktu
penentuannya\
• Keuntungan: Memerlukan mesin sederhana, seperti spektrofotometer, yang
umumnya tersedia di laboratorium, ekstrak bereaksi cepat dengan ABTS (2
jam)

• Uji ORAC menunjukkan hasil yang berbeda nyata pada prosesnya

• Larutan kerja ORAC digunakan segera setelah proses preparasi

ORAC
• Nilai pembacaan pelat 96well cenderung lebih tinggi pada bagian atas
daripada bagian bawah dan juga kiri lebih besar daripada kanan. Koefisien
varians (CV) yang lebih rendah diperoleh dengan menggunakan format
48well dibandingkan dengan format 96well. Oleh karena itu, lokasi sampel
pada plat menyebabkan peningkatan tingkat kesalahan dalam pengujian
• Kelemahan: Memerlukan penggunaan peralatan yang mahal

Tim Promosi UM 2020 21

 PEMBAHASAN
Reproduksibilitas Pengujian ABTS, DPPH, FRAP, dan ORAC
• Uji DPPH tidak menunjukkan perbedaan dalam proses pengujian
• Uji DPPH dapat digunakan untuk menentukan aktivitas antioksidan pada jambu biji

DPPH
karena menunjukkan reproduktifitas yang tinggi

DPPH
• Larutan kerja DPPH digunakan segera setelah proses preparasi
• Keuntungan: Memerlukan mesin sederhana, seperti spektrofotometer, yang
umumnya tersedia di laboratorium
• Kelemahan: Prosesnya memakan waktu lebih lama dari FRAP dan ABTS (24 jam).

• Uji FRAP tidak menunjukkan perbedaan dalam proses pengujian

• Uji FRAP dapat digunakan untuk menentukan aktivitas antioksidan pada
jambu biji karena menunjukkan reproduktifitas yang tinggi
FRAP • Larutan kerja FRAP digunakan segera setelah proses preparasi
• Keuntungan: Memerlukan mesin sederhana, seperti spektrofotometer, yang
umumnya tersedia di laboratorium, ekstrak bereaksi cepat dengan ion besi
(30 menit)

Tim Promosi UM 2020 22

 PEMBAHASAN
Aktivitas Antioksidan Diukur dalam Ekstrak Metanol
 Genotipe dan pengujian menghasilkan aktivitas antioksidan yang berbeda dalam ekstrak metanol (AOAM) (Tabel 3)
 Tingkat AOAM yang lebih tinggi dalam klon pulp putih ditemukan di semua pengujian dibandingkan dengan klon pulp merah
muda karena kandungan AA dan TPH yang lebih tinggi (Tabel 1).
 Namun tidak dapat digeneralisasikan bahwa jambu biji putih memiliki tingkat aktivitas antioksidan yang lebih tinggi daripada
jambu biji merah muda karena jumlah sampel yang diteliti dalam penelitian ini terbatas, sehingga perlu diteliti lebih banyak
terkait aktivitas antioksidan dari berbagai genotipe semua kelas jambu biji agar diperoleh nilai yang tepat terkait variasi aktivitas
antioksidan berbagai jenis jambu biji.
 Aktivitas antioksidan menggunakan uji ORAC menghasilkan nilai untuk jambu biji sebesar (18,03-32,25 µM TE / g) sebanding
dengan blueberry (13,9–45,9 µM TE/g) yang mengandung aktivitas antioksidan yang sangat tinggi
 Tingkat AOAM yang berbeda pada pengujian mencerminkan perbedaan relatif dalam kemampuan senyawa antioksidan dalam
ekstrak untuk memadamkan radikal peroksil berair dan untuk mengurangi ABTS.d+, radikal bebas DPPH dan besi besi dalam
sistem in vitro. Interaksi jambu biji dalam pengujian, tidak signifikan untuk AOAM ketika menggunakan teknik ORAC. Hal ini
menunjukkan bahwa tiga teknik lainnya menghasilkan hasil yang sebanding antar klon.
Tim Promosi UM 2020 23
 PEMBAHASAN
Aktivitas Antioksidan Diukur dalam Ekstrak Diklorometana

 Hanya tiga uji yang digunakan untuk mengukur AOAD, yaitu ABTS, DPPH, dan FRAP. Hasil uji ANOVA
menunjukkan bahwa tingkat AOAD berbeda secara signifikan di antara tiga teknik pengujian (P<0,01) tetapi
tidak antara klon jambu biji, tanpa interaksi antara jambu biji dan pengujian (Tabel 5).
 Rerata kadar AOAD dari keempat jambu biji adalah 0,44, 0,27, dan 0,16M M TE/g sebagaimana ditentukan
oleh masing’masing uji ABTS, DPPH, dan FRAP (Tabel 6). Tingkat AOAD sangat rendah: kurang dari 2% dari
total.

Tim Promosi UM 2020 24

 PEMBAHASAN
KORELASI

 Korelasi antara AOAM yang diperoleh dari semua pengujian, TPH dan AA memberikan nilai positif tinggi
(0,61≤r≤0,97, P<0,05), terutama antara AOAM berdasarkan uji FRAP dan TPH (R=0,97, P<0,01) dan AA
(R=0,92, P<0,01) (Tabel 7).
 Keempat teknik yang digunakan untuk menentukan aktivitas antioksidan (ABTS, DPPH, FRAP, dan ORAC),
menunjukkan korelasi yang tinggi dengan TPH pada tanaman yang berbeda.
 Korelasi tinggi antara aktivitas antioksidan dengan metode apapun dan AA kemungkinan hanya ditemukan
pada buah-buahan yang mengandung AA tinggi seperti jeruk (Gardner et al., 2000) dan jambu biji (Tabel 6).
 Gil dkk. (2002) menyatakan bahwa tidak ada korelasi antara AA dan aktivitas antioksidan yang di uji DPPH atau
FRAP dalam nektarin, persik, dan plum.

Tim Promosi UM 2020 25

 PEMBAHASAN
KORELASI
 Tingginya korelasi antara AOAM dengan TPH atau AA pada jambu biji menunjukkan bahwa layak untuk menggunakan TPH
atau AA untuk menyaring AOAM. Baik AA dan TPH menunjukkan korelasi positif yang tinggi dengan AOAM sebagaimana
ditentukan oleh semua pengujian, yang menunjukkan bahwa AA dan TPH merupakan kontributor penting untuk aktivitas
antioksidan dalam ekstrak jambu biji.
 AOAM berdasarkan uji ABTS, DPPH, dan FRAP berkorelasi negatif dengan BET. Korelasi antara semua tes AOAM bernilai
positif tinggi (0,68≤r≤0,97, P<0,01) menunjukkan bahwa ekstrak jambu biji memiliki aktivitas yang sebanding di keempat
pengujian. Korelasi tinggi antara keempat teknik ini juga ditemukan pada tanaman lain.
 Tidak ada korelasi yang konsisten antara pengujian AOAM dan AOAD, juga tidak ada korelasi antar pengujian AOAD.
Korelasi antara AOAM berdasarkan tes ABTS, DPPH, FRAP, dan ORAC bernilai positif tinggi dan berkisar antara 0,68 dan 0,97:
korelasi tertinggi antara ABTS dan FRAP (0,97) dan korelasi terendah antara DPPH dan ORAC (0,68).

Tim Promosi UM 2020 26

 5

SIMPULAN

Tim Promosi UM 2020 27

 Simpulan

Uji ABTS, DPPH, FRAP, dan ORAC memberikan hasil yang sebanding untuk aktivitas antioksidan
yang diukur dalam ekstrak metanol ekstrak buah jambu biji. Teknik FRAP menunjukkan
reproduktifitas tinggi, sederhana, dilakukan dengan cepat dan menunjukkan korelasi tertinggi
dengan asam askorbat dan total fenolat. Oleh karena itu, akan menjadi teknik yang tepat untuk
menentukan aktivitas antioksidan dalam ekstrak buah jambu biji. Aktivitas antioksidan yang
diukur dalam ekstrak metanol juga dapat diperkirakan secara tidak langsung dengan
menggunakan asam askorbat atau fenolat total karena menunjukkan korelasi yang tinggi
dengan semua pengujian. Aktivitas antioksidan yang diukur dalam ekstrak diklorometana dalam
ekstrak buah jambu biji rendah (2% dari total) dibandingkan dengan aktivitas antioksidan yang
diukur dalam ekstrak metanol. Asam askorbat dan fenolat merupakan kontributor utama
aktivitas antioksidan pada buah jambu biji.

Tim Promosi UM 2020 28

 Terima Kasih

Tim Promosi UM 2020 29