Okatriani pramiastuti

Fitokimia 2
Harbone, JB. 1987
 Metode analisis tumbuhan
 Metode ekstraksi dan isolasi
 metode pemisahan
  metode identifkasi
 Analisis hasil
  penggunaan
Metode ekstraksi dan
isolasi
 Bahan tumbuhan
 Ideal : jaringan tumbuhan segar
 Cara lain : dikeringkan sebelum diekstraksi
 Telaah Pencemaran
 Identitas botani tumbuhan
 Ekstraksi
Jaringan segar

 Beberapa menit setelah dikumpulkan, bahan

tumbuhan dicemplungkan ke dalam alkohol
mendidih.
 Jika tidak tersedia atau bahan harus diambil
dr pengumpul dr daerah lain : jaringan segar
harus disimpang kering dlm kantong plastik
(aman dalm perjalanan shg bisa dianalisis)
Tumbuhan dikeringkan sebekum
diekstraksi
 Pengeringan dlm keadaan terawasi, utk
mncegah tjdnya perubahan kimia yg terlalu
banyak
 Harus dikeringkan secepat2nya, tanpa suhu
tinggi, ada aliran udara yg baik.
 Dapat disimpan dl wktu lama sblm dianalisis
 Herbarium (kandungan miristin dlm biji pala
perlahan meningkat dlm penyimpanan, sdg β-
pinena yg lebih atsiri menurun dg berjalannya
waktu). Sedang flavanoid dan alkaloid dr
strychnos nuxvomica yg dikumpulkan 1675 ttp
mengandung alkaloid 1-2% dr bobot.
pencemaran

 Tumbuhan tidak berpenyakit, krn bsa

mengubah metabolisme tumbuhan dan
membentuk hasil yg tdk diinginkan
 Bisa tjd sewaktu pengumpulan tumbuhan
rendah (misal jamur yg tumbuh pd pohon,
jaringan pohon hrs tidak ada, dan lumut)
Identitas botani tumbuhan

 Keaslian dibuktikan
 Tdk diragukan
 Ahli taksonomi
 Menyimpan bukti keaslian identitas
ekstraksi
 Tergantung :
 Tekstur dan kandungan air
 Jenis senyawa yang diisolasi
 Membunuh jaringan tumbuhan utk mencegah
oksidasi enzim atau hidrolisis, dengan
mencemplungkan jaringan segar (dipotong) ke dlm
etanol mendidih.
 maserasi
 Alkohol, pelarut serba guna. bisa mengekstraksi
habis. Jika tumbuhan banyak mengandung klorofil,
maka ampas jaringan dimaserasi ulang sampai tidak
berwarna hijau lagi, dianggap senyawa BM rendah
terekstraksi
 Soxhletasi (ekstraksi berkesinambungan) :
gradien pelarut berdasar polaritas (eter, PE dan
kloroform utk lipid dan terpenoid), jaringan
tumbuhan kering ( biji, akar, daun), skala gram,
jarang tjd pemisahan sempurna, dlm beberapa
fraksi.
 Ekstraksi dg penyaringan menggunakan celite
dan pompa air kmdn dipekatkan dlm hampa, di
evaporasi.
Bedasar pengalaman

 Isolasi dr kand hijau, diawal lemakkan sblm pemekatan

dg mencuci ekstrak berulang-ulang dg PE ( biasanya
klorofil dan lipid melekat di dinding labu).
 Bila terbentuk kristal pad ekstrak pekat, ekstrak
disaring dan identifaksi dg KLT
 Biasa kristal msih campuran, shg perlu dilarutkan dg
pelarut yg sesuai dan kandungannya dipisah dg
kromatografi
 Jika senyawa tdpt di cairan induk, harus difraksinasi dg
kromatogarfi
 Ekstrak pekat hrus disimpan dilemari es dan di tambahi
sesepora toluen utk mencegah jamur.
Cara umum ekstraksi dan
fraksinasi
Metode Pemisahan
 Pemisahan dan pemurniankandungan tumbuhan
dapatdilakukan dengan menggunakanteknik
kromatograf"
•kromatografi kertas (KKt)
•kromatografi lapis tipis (KLT)
•Kromatografi gas &air (KGC)
•Kromatografi &air kinerja tinggi (KCKT)
 Elektroforesis
 Ekstraksi cair-cair
Kromatograf kertas
 KKt dapat digunakan terutama bagi
kandungan tumbuhan yang mudah larut
dalam air yaitu KH, asam amino, basa asam
nukleat, asam organik dan senyawa fenolat
 keuntungan utama KKt ialah
 Kemudahan dan kesederhanaan sama pada
pelaksanaan pemisahan
 Keterulangan bilangan Rf yang besar pada
kertas
 pada KKt senyawa terbagi dalam pelarut
alkohol yang sebagian besar tidak bercampur
dengan air misalnya n-butanol dalam air
 Campuran klasik yaitu n-butanol -
asam asetat - air (4:1:5)
 BAA dirancang sebagai sarana untuk
meningkatkan kadar air lapisan n-butanol

Kromatograf lapis tipis
 KLT merupakan metode pilihan untuk
pemisahan semua kandungan yang
larut dalam lipid yaitu lipid, steroid, karotenoid,
kuinon sederhana dan klorofil
 Kelebihan khas dari KLT 
 Keserbaagunaan pada proses pemisahan
 Kecepatan
 kepekaannya

 sejumlah penjerap yang sering digunakan
dalam teknik ini silika gel, alumina oksida,
kalsium hidroksida, magnesium phospat
poliamida, sephadex, selulosa
 pendeteksian senyawa biasanya
menggunakan
•Sinar UV berpanjang gelombang 245 nm
•Penyemprotan pereaksi tertentu"
Kromatografi gas cair
 Lebih canggih dan lebih mahal
 Pemisahan minyak atsiri yi asam lemak, mono- dan
seskuiterpen, hidrokarbon dan syw belerang. M.ats dg titik
didih tinggi diubah jd ester dan/atau eter trimetilsilil.
 Alat : kolom, pemanas/suhu 50 -350 C, aliran gas pembawa,
pendeteksi.
 Dinyatakan dlm Rv ( volume gas pembawa) dan Rt (wktu yg
diperlukan u mengelusi)
 Fase diam dan suhu dapat diubah menurut kepolaran dan
keatsirian senyawa
 Data kualitatif dan kuantitatif (luas daerah peak)
 Bisa dihubungkan dg SM
Kromatografi cair kinerja tinggi
(KCKT)
 Lebih peka secara kualitatif dan kuantitaif,
menggabungkan keefesienan kolom & kec analisis
 Alat lbih canggih dan mahal
 Utk syw dg Kandungan atsiri kecil
 FG boleh dg pelarut campuran (pemisahan isokratik)
 Suhu kamar (tdk ada perlakuan khusus)
 Utk deteksi terpenoid tinggi, senyawa fenol,
alakloid, lipid dan gula. Syw yg bisa dideteksi dg
spektrum UV.
 Kolom partikel silika mikropori (nonpolar) atau
kolom fase balik (C18: polar)
Metode identifikasi

 Umum
 Senyawa harus membentuk bercak tunggal
dlm KLT
 Setelah kandungan diisolasi dan dimurnikan,
tentukan golongannya, tentuka jenis
senyawa.
 Gol senyawa : uji warna, kelarutan, Rf dan ciri
spektrum UV, uji biokimia ( hidrolisis
glukosida)
Identifikasi lengkap
 Dibandingkan dg pustaka
 Titik leleh (padat)
 Titik didih (cairan)
 Putaran optik ( syw aktif optik)
 Rf atau RRt (kondisi baku)
 Ciri spekturm : UV, IR, NMR, MS
 Dibandingkan dg senyawa autentik (bila ada)
 Senyawa baru dg penguraian kimia/sintesis
 Kristalografi (kristal)
Spektroskopi UV dan spekturm
tampak
 Pelarut encer (etanol 96%, smua senywa, air, eter, PE,
heksana, metanol)
 Blanko pelarut
 Senyawa tak berwarna pd panjang gelombang 200-400
nm
 Senyawa berwarna 200-700 nm
 Senyawa harus murni
 Kristal tanpa dik BM dan konsentrasi nya bisa dilihat dr
bilangan absorbansi.
 Senyawa fenol + alkohol dalam alkali, spektrum geser
ke arah panjang gelombang yg lebih besar (batokrom)
dg absorbansi meningkat. Dan sebaliknya (hipsokrom)
Spektroskopi infra merah
 Senyawa dilarutkan dlm kloroform,
karbontetraklorida, 1-5%, bentuk gerusan dalam
minyak nuyol atau padatan dalm KBr
 Menentukan gugus fungsi
 Spektrum > 1200 cm -1 : peak disebabkan o/
getaran ikatan kimia/gugus fungsi/molekul yg
rumit sehigga sering disebut sidik jari dg skala :
kuat, menengah atau lemah
Spektroskopi massa
 Skala mikrogram
 Kemampuan menentukan BM tepat
 Pola fragmentasi rumit tp khas bagi senyawa
 Penguraian syw organik dan perekaman pola
fragmentasi menurut massanya.
 Sistem SM bertekanan rendah, diionkan dg
energi cukup memutus ik kimia. Tbtk ion
muatan positif dlm medan magnet dg
kelimpahan nisbi ion.
Spektroskopi resonansi magnet
inti (RMI)
 H-RMI : menentukan struktur senyawa
organik dg mengukur momen magnet atom
hidrogen, merupakan rekaman sejumlah
atom hidrogen yg berada dlam lingkunagn
yng berlainan.
 13C-RMI : mrpkn RMI pelengkap proton, dan
bisa utk menentuka struktr terpenoid,
alkaloid dan flavanoid, protein,
makromolekul, glikosida
Kriteria untuk identifikasi
fitokimia
elektroforesis

 u/ syw bermuatan; as amino, bbrp alkaloid,

amina, as organik & protein. Gol syw netral
(gula & fenol)
 Menggunakan medan listrik dg mengubah
mjd syw kompleks logam. Ex ; na borat
Ekstraksi cair - cair

 Sederhana
 Untuk karotenoid, syw larut air
 Alat ; alat sebar lawan-arus Craig (terakhir) ;
kromatigrafi lawan-arus (KLAT) u skala
penyiapan
Teknik khusus

 Penyaringan gel sephadex, kromatografi

afinitas dan ultra-pemusingan diferensial
 Pemisahan protein tumbuhan dan as nukleat
Analisis hasil

 Kualitatif : diharapkan ditemukan kandungan

yg strukturnya baru atau tidak biasa.
 Kuantitatif : % dr keseluruhan, yg mrupkan
angka minimum krn byk yg hilang saat
pemurnian. (kadar total gula, nitrogen,
proetein, fenol, tanin dsb)
penggunaan
 Fisiologi tumbuhan : penentuan struktur, asal usul,
biosintesis dan hormon
 Patologi tumbuhan : sifat kimia fitotoksin dan
fitolakesin
 Ekologi tumbuhan : kandungan tumbuhan,
antaraksi tumbuhan-hewan, tumbuhan-tumbuhan
 Paleobotani : tumbuhan fosil
 Genetika tumbuhan : identifikasi tumbuhan
( antosianin, flavon, pigmen karotenoid, hibrida)
 Sistematika tumbuhan : taksonomi, biokimia atau
kemotaksonomi.
Good luck