IDENTIFIKASI SENYAWA

PENDAHULUAN
• Pada identifikasi suatu kandungan tumbuhan, setelah
kandungan itu diisolasi dan dimurnikan, pertama-tama
harus kita tentukan dahulu golongannya, kemudian
barulah ditentukan jenis senyawa dalam golongan
tersebut.
• Sebelum itu, keserbasamaan senyawa tersebut harus
diperiksa dengan cermat, artinya senyawa harus
membentuk bercak tunggal dalam beberapa sistem KLT
dan atau KKt.
PENDAHULUAN
• Golongan senyawa biasanya dapat ditentukan dengan uji
warna, penentuan kelarutan, bilangan RF, dan ciri
spektrum UV
• Uji biokimia dapat bermanfaat juga : adanya glukosida
dapat dipastikan dengan hidrolisis yang menggunakan β–
glukosidase; adanya glukosida minyak amandel dengan
hidrolisis yang menggunakan mirosinase, dan
sebagainya.
• Untuk senyawa pengatur tumbuh, uji biologi merupakan
bagian identifikasi yang penting.
PENDAHULUAN
• Identifikasi lengkap dalam golongan senyawa bergantung
pada pengukuran sifat atau ciri lain, yang kemudian
dibandingkan dengan data dalam pustaka.
• Sifat yang diukur termasuk titik leleh (untuk senyawa
padat), titik didih (untuk cairan), putaran optik (untuk
senyawa aktif optik), dan RFatau RRt (pada kondisi
baku).
PENDAHULUAN
• Tetapi, data mengenai senyawa tumbuhan yang sama
ialah ciri spektrumnya, termasuk pengukuran spektrum
UV, inframerah (IM), resonansi magnet inti (RMI), dan
spektrum massa (SM). Biasanya senyawa yang pernah
diketahui dapat diidentifikasi berdasarkan data diatas.
PENDAHULUAN
• Identifikasi senyawa tumbuhan baru dengan kristalografi
sinar-X sekarang sudah menjadi rutin dan dapat
dilakukan bila senyawa itu cukup jumlahnya dan
berbentuk kristal.
• Cara ini terutama sangat bermanfaat pada kasus
terpenoid rumit karena dengan cara ini dalam sekali kerja
saja kita dapat menentukan sekaligus struktur kimia dan
stereokimia.
Spektroskopi UV dan spektrum tampak
• Spektrum serapan kandungan tumbuhan dapat diukur
dengan larutan yang sangat encer dengan pembanding
blanko pelarut serta menggunakan spektrofotometer yang
merekam otomatis.
• Senyawa berwarna diukur pada jangka 200 sampai 700
nm. Panjang gelombang serapan maksimum dan
minimum pada spektrum serapan yang diperoleh direkam
(dalam nm), demikian juga kekuatan absorbansi
(keterserapan) (atau kerapatan optik) pada maksimal dan
minimal yang khas.
• Bahan yang diperlukan hanya sesepora saja karena sel
spektrofotometri baku (1 x 1 cm) hanya dapat diisi 3 ml
larutan.
• Dengan menggunakan sel khusus hanya diperlukan
sepersepuluh volume tersebut. Pengukuran spektrum
yang demikian itu penting pada identifikasi kandungan
tumbuhan, yaitu untuk memantau eluat dari kolom
kromatografi sewaktu pemurnian dan untuk mendeteksi
golongan senyawa tertentu, misalnya poliasetilena, pada
waktu penjaringan ekstrak kasar tumbuhan.
PELARUT SPEKTROSKOPI UV
• Pelarut yang banyak digunakan untuk spektroskopi UV ialah etanol
95% karena kebanyakan golongan senyawa larut dalam pelarut
tersebut. Alkohol mutlak niaga harus dihindari karena mengandung
benzena yang menyerap di daerah UV pendek.
• Pelarut lain yang sering digunakan ialah air, metanol, heksana, eter
minyak bumi dan eter.
• Pelarut seperti kloroform dan piridina umumnya harus dihindari
karena menyerap kuat di daerah 200 – 260 nm; tetapi sangat cocok
untuk mengukur spektrum pigmen tumbuhan, seperti karotenoid, di
daerah spektrum tampak.
• Bila zat diisolasi sebagai senyawa berbentuk kristal dan bobot
molekulnya diketahui atau dapat ditentukan, maka intensitas
serapan pada panjang gelombang maksimal (λ maks)
dinyatakan sebagai log ϵ, dengan ϵ=A/Cl (A=absorbansi,
C=konsentrasi dalam g mol/l, l=panjang alur sel dalam cm,
biasanya 1).
• Untuk senyawa yang baik konsentrasi maupun bobot
molekulnya tidak diketahui, kita harus menggunakan bilangan
absorbansi.
• Pemurnian merupakan suatu keharusan sebelum kita
melakukan telaah spektrum, dan kandungan tumbuhan
yang menunjukkan ciri serapan yang khas harus diulangi
pemurniannya sampai ciri khas tersebut tidak berubah
lagi.
• Pada pemurnian dengan cara kromatografi kertas, untuk
mengkompensasi cemaran yang berasal dari kertas saring dan
menyerap di daerah UV, maka sebagai pelarut blanko pada
pengukuran spektrum dapat digunakan eluat kertas saring
blanko yang disiapkan bersamaan waktunya dengan
penyiapan cuplikan.
• Prosedur yang serupa harus diikuti juga bila pemurnian
dilakukan dengan plat KLT.
• Kegunaan pengukuran spektrum untuk tujuan identifikasi dapat
ditingkatkan dengan pengukuran berulang dalam larutan netral,
pada jangka pH yang berbeda-beda atau dengan
menambahkan garam anorganik tertentu. Misalnya, bila larutan
senyawa fenol dalam alkohol ditambah alkali, secara khas
spektrum bergeser ke arah panjang gelombang yang lebih
besar (mengalami geser batokrom) dengan absorbansi yang
meningkat.
• Sebaliknya, bila alkali ditambahkan ke dalam larutan netral
asam karboksilat, geseran terjadi ke arah berlawanan, yaitu ke
panjang gelombang yang lebih kecil (geser hipsokrom). Reaksi
kimia, seperti reduksi (dengan natrium borohidrida) atau
hidrolisis enzim, dapat diamati dengan baik dalam kuvet sel
suatu spektrofotometer rekam.
• Pengukuran serapan yang dilakukan pada jangka waktu
tertentu akan menunjukkan apakah nilai reduksi atau hidrolisis
telah berlangsung.
Spektroskopi inframerah (IM)
• Spektrum inframerah senyawa tumbuhan dapat diukur
dengan spektrofotometri inframerah yang merekam
secara otomatis dalam bentuk larutan (dalam kloroform,
karbontetraklorida, 1-5 %), bentuk ge rusan dalam minyak
nuyol, atau bentuk padat yang dicampur dengan kalium
bromida.
Spektroskopi inframerah (IM)
• sprektroskopi IM paling sering digunakan sebagai alat
‘pembuat sidik jari’ untuk membandngkan cuplikan alam
dengan cuplikan sintesis.
• Kerumitan spektrum IM memang sangat cocok untuk tujuan
tersebut, dan perbandingan yang demikian itu sanagat penting
pada identifikasi lengkap berbagai jenis kandungan tumbuhan.
• Misalnya, spektrum IM telah digunakan secara luas untuk
mengidentifikasi komponen minyak atsiri yang sudah dikenal
ketika senyawa itu dipisahkan dengan KGC pada skala
preparatif.
Spektroskopi Massa (SM)
• Pada dasarnya SM adalah penguraian sesepora senyawa organik dan
perekaman pola fragentasi menurut massanya.
• Uap cuplikan berdifusi ke dalam sistem sprektrometer massa yang
bertekanan rendah, lalu diionkan dengan energi yang cukup untuk
memutus ikatan kimia.
• Ion bermuatan positif yang terbentuk dipercepat dalam medan magnet
yang menyebarkan ion tersebut dan memungkinkan pengukuran
kelimpahan nisbi ion yang mempunyai nisbah massa terhadap muatan
tertentu.
• Spektrometri massa berhasil baik hampir untuk semua jenis kandungan
tumbuhan yang berbobot molekul rendah, bahkan alat tersebut telah
digunakan untuk menganalisis peptida
Spektroskopi resonansi magnet inti (RMI)
• Spektroskopi RMI proton pada hakikatnya merupakan sarana
untuk menentukan struktur senyawa otrganik dengan
mengukur momen magnet atom hidrogennya
• Pada kebanyakan senyawa, atom hidrogen terikat pada gugus
yang berlainan (seperti –CH2-, -CH3-CHO, -NH2, -CHOH-, dan
sebagainya) dan spektrum RMI proton merupakan rekaman
sejumlah atom hidrogen yang berada dalam keadaan
lingkungan yang berlainan tersebut.
Kriteria untuk identifikasi fitokimia
• suatu senyawa yang telah dikenal dan diketemukan lagi
di dalam tumbuhan baru, dapat diindentifikasi
berdasarkan perbandingan kromatografi dan spektrum
dengan senyawa asli.
• Pembanding kromatografi harus didasarkan kepada ko-
kromatografi senyawa dengan senyawa asli, tanpa
pemisahan, paling sedikit dalam empat sistem.
Kriteria untuk identifikasi fitokimia
• Bila KLT merupakan dasar utama pembandingan, jelas ada
keuntungannya bila digunakan penjerap yang berlainan
(misalnya selulosa dan silika gel disamping pengembangan
yang berlainan pada satu jenis penjerap.
• Bila mungkin, kita harus membandingkan senyawa tak dikenal
itu dengan senyawa pembanding dengan menggunakan tiga
kriteria kromatografi yang jelas.
Kriteria untuk identifikasi fitokimia
• Kriteria itu misalnya waktu retensi pada KGC, KCKT dan
RF pada KLT; atau RF pada KKt, KLT dan pergerakan
nisbipada elektroforesis, demikian juga untuk pembanding
spektrum harus digunakan dua cara atau lebih.
• Idealnya, semua spektrum UV, IM, dan RMI1H harus
dibandingkan
Kriteria untuk identifikasi fitokimia
• Pada senyawa tumbuhan baru biasanya kita dapat saja menentukan
strukturnya berdasarkan pengukuran spektrum dan kromatografi,
terutama yang bertalian dengan spektrum dan kromatografi senyawa
yang sudah dikenal dalam deret yang sama. Penetapan struktur
dapat dilakukan dengan pengubahan kimia dan menjadikannya
senyawa yang sudah dikenal.
• Pada waktu lampau, tahap penting dalam identifikasi struktur ialah
menentukan rumus molekul dengan cara mikro analisis sekurang-
kurangnya dengan menentukan karbon hidrogen.
Contoh Identifikasi Senyawa Pada
Metabolit Sekunder
• ANALISIS HASIL
• 1. Analisis Kualitatif
• 2. Analisis Kuantitatif
GOLONGAN TERPENOID
• Spektroskopi UV-VIS
• Senyawa golongan terpenoid jarang yang dianalisis menggunakan
spektrofotometer UV-VIS disebabkan karena strukturnya yang tidak
menyerap sinar UV-VIS tetapi spektrum karotenoid sangat khas.
• Spektroskopi IR
• Identifikasi menggunakan IR hanya dapat memberikan sedikit
informasi tentang gugus fungsi yang terdapat dalam struktur
terpenoid karena senyawa golongan terpenoid juga dikenal tidak
terlalu banyak mengandung gugus fungsi, bahkan banyak yang
hanya merupakan senyawa hidrokarbon.
GOLONGAN FLAVONOID
• a. Spektroskopi UV-VIS
• Spektrum flavonoid biasanya diukur dalam larutan
dengan pelarut metanol atau etanol, meski perlu diingat
bahwa spectrum yang dihasilkan dalam etanol kurang
memuaskan.
• Spektrum khas flavonoid terdiri atas dua panjang
gelombang maksimum yang berada pada rentang antara
240-285 nm (pita II) dan 300-550 nm (pita I).
GOLONGAN FLAVONOID
GOLONGAN FLAVONOID
• Beberapa informasi tambahan untuk penentuan struktur flavonoid dapat
diperoleh dengan menambahkan pereaksi geser. Beberapa pereaksi
geser yang biasa dipakai adalah :
• 1) Larutan NaOH 2M
• 2) AlCl3. Kira-kira 5 gram AlCl3 kering ditambahkan dengan hati-hati ke
dalam 100 ml metanol.
• 3) HCl. Sejumlah 50 ml HCl pekat ditambahkan ke dalam 100 ml
aquadest.
• 4) NaOAc. Biasanya digunakan serbuk NaOAc anhidrat.
• 5) H3BO3. Digunakan serbuk asam borat anhidrat.
• 6) Mekanisme reaksi yang terjadi antara flavonoid + AlCl3 dan flavonoid
+ AlCl3 + HCl