USULAN PENELITIAN

PEMBERIAN KRIM EKSTRAK ETANOL BUNGA GEMITIR

(TAGETES ERECTA) MENCEGAH JUMLAH MELANIN DAN
EKSPRESI TIROSINASE KULIT MARMUT (Cavia porcellus)
YANG DIPAPAR ULTRAVIOLET B

ELDION SANADA
188.0711.039

FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
2019
 BAB I
PENDAHULUAN
 
1.1 LATAR BELAKANG
Penuaan dapat terjadi pada setiap manusia dan akan terus
berjalan seiring bertambahnya usia. Penuaan dipengaruhi faktor
internal (radikal bebas, genetik, defisiensi hormon, metilasi,
glikosilasi, apoptosis, dan penurunan sistem imun) dan eksternal
(diet, gaya hidup tidak sehat, polusi, serta stress). Berkembangnya
ilmu pengetahuan khususnya di bidang anti aging medicine dapat
mencegah, menghambat proses penuaan, bahkan usia individu
dapat diperpanjang serta ditingkatkan kualitas hidupnya dengan
terapi anti penuaan. Kulit adalah organ tubuh yang rentan terhadap
proses penuaan dimana faktor eksternal berperan mempengaruhi
kerusakan dibandingkan dengan faktor internal. Pigmen melanin
pada kulit merupakan fotoprotektif karena melanin menyerap radiasi
Ultraviolet dan juga sebagai penahan radikal bebas (Brenner dan
Hearing, 2007).
 Bunga gemitir (Tagetes erecta) telah digunakan
bertahun-tahun sebagai pengobatan tradisional dan
sejak tahun 2008 diakui sebagai produk medikasi
herbal oleh Europian Medicines Agency. Krim
merupakan produk yang mengandung minyak dalam
air (emulsi) dan krim banyak digunakan dalam
penelitian karena sifatnya yang mudah dibersihkan
dengan air dan krim banyak digunakan sebagai
produk kosmetik (Dreher dan Maibach, 2011).
Marmut merupakan hewan dengan banyak
persamaan terhadap manusia secara biologis, oleh
karena itu marmut banyak digunakan pada penelitian.
Selain itu marmut mudah didapat, tidak mahal, dan
mudah penanganannya (Fatchiyah, 2013).
1.2 RUMUSAN MASALAH
 Apakah krim ekstrak etanol bunga
gemitir (Tagetes erecta) dapat
mencegah peningkatan jumlah
melanin kulit marmut (Caviaporcellus)
yang dipapar sinar UVB?
 Apakah krim ekstrak etanol bunga
gemitir (Tagetes erecta) dapat
mencegah peningkatan ekspresi
tirosinase kulit marmut (Cavia
porcellus) yang dipapar sinar UVB?
 
1.3 TUJUAN PENELITIAN
1.3.1 Tujuan Umum
 Untuk mengetahui efektivitas ekstrak etanol bunga gemitir
(Tagetes erecta) dalam mencegah proses hiperpigmentasi
pada kulit marmut yang dipapar sinar UVB.
1.3.2 Tujuan Khusus
 Membuktikan efek pemberian krim ekstrak etanol bunga
gemitir (tagetes erecta) dapat mencegah peningkatan
jumlah melanin kulit marmut (Cavia porcellus) yang dipapar
sinar UVB.
 Membuktikan efek pemberian krim ekstrak etanol bunga
gemitir (tagetes erecta) dapat mencegah peningkatan
ekspresi tirosinase kulit marmut (Cavia porcellus) yang
dipapar sinar UVB.

1.4 MANFAAT PENELITIAN

 Memberikan pengetahuan baru mengenai bahan alami yang
dapat menghambat sintesis melanin kulit yang diambil dari
ekstrak etanol bunga gemitir.
 BAB II
KAJIAN PUSTAKA
2.1.PENUAAN
Penuaan terjadi pada semua manusia dan merupakan proses alami dimana
terjadi penurunan regenerasi sel seiring dengan meningkatnya usia. Faktor
penyebab penuaan dapat digolongkan menjadi dua yaitu faktor internal
dan faktor eksternal dimana faktor internal termasuk radikal bebas,
genetik, defisiensi hormon, metilasi, glikosilasi, apoptosis, dan penurunan
sistem imun. Sedangkan faktor eksternal meliputi diet, gaya hidup tidak
sehat, polusi, serta stres.
 
2.1.1 Teori Penuaan
Teori pakai dan rusak (wear and tear theory)
Teori Neuroendokrin
Teori Kontrol Genetik
Teori Radikal Bebas
 
2.1.2 Gejala Penuaan
Proses penuaan dimulai dengan menurunnya
bahkan terhentinya fungsi berbagai organ
tubuh. Akibat penurunan fungsi tersebut,
maka akan muncul gejala penuaan. Proses
penuaan dapat dibagi menjadi 3 tahap
menurut Pangkahila (2007) :
Tahap subklinik (usia 25-35 tahun)
Tahap transisi (usia 35-45 tahun)
Tahap klinik (usia 45 tahun keatas)
2.2 PENUAAN KULIT
Teori penuaan kulit menurut Yaar dan
Gilchrest (2008) adalah :
Teori programatik, penuaan adalah
proses fisiologis yang disebabkan oleh
program genetik dan bervariasi untuk
setiap spesies.
Penuaan seluler, Penuaan seluler ialah
terbatasnya sel untuk pembelahan sel.
Teori Stochastic, penuaan terjadi
akumulasi kerusakan gen dan protein.
 
2.3 EFEK SINAR MATAHARI
2.3.1 Efek Akut Sinar Matahari
Eritema
Pigmentasi
Penekanan sistem imun
Kerusakan DNA
2.3.2 Efek Kronis Sinar Matahari
Photoaging
Fotokarsinogenesis
2.4 KULIT
Kulit ialah organ tubuh terbesar (sekitar 15% dari total
berat badan). Kulit memiliki banyak fungsi vital,
termasuk perlindungan terhadap fisik, kimia, dan
biologis, serta mencegah penguapan berlebih dari
tubuh dan serta termoregulasi.

Kulit terdiri dari tiga lapisan :

Lapisan Epidermis
Lapisan Dermis
Lapisan Subkutis
 
2.5 MELANIN
Melanin ialah komponen yang
dihasilkan oleh sel melanosit
yang berfungsi penyerap sinar UV
dan penahan radikal bebas
sehingga dapat melindungi kulit
dari kerusakan akibat sinar UV.
Jumlah melanosit akan berkurang
seiring dengan bertambahnya
usia. Melanin terdiri dari dua tipe
yaitu eumelanin, pigmen
berwarna coklat-kehitaman, dan
pheomelanin, pigmen berwarna
kuning-kemerahan.
Distribusi melanin pada epiderm
2.5.1 Produksi Melanin
Melanin disintesis didalam sel melanosit melalui enzim
tirosinase (Scott dan Benion, 2011).
Proses sintesis ini terdiri dari empat tahap yaitu :
Tahap I, premelanosom sedikit aktivitas dari enzim tirosinase.
Tahap II, aktivitas enzim tirosinase meningkat, melanin
disimpan dalam matriks protein.
Tahap III, terdapat peningkatan pembentukan melanin.
Tahap IV, melanin telah terbentuk sempurna dan matang.
2.5.2 Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi
Melanogenesis
Produksi melanin dipengaruhi oleh faktor internal dan
eksternal. Faktor eksternal yang paling sering terjadi
adalah paparan sinar UV dan obat-obatan, sedangkan
dari faktor internal adalah inflamasi dan hormon
(Costin dan Hearing, 2007).

SinarUV Terhadap Melanin

Penuaan Terhadap Melanin
Obat-Obatan Terhadap Melanin
Hormon Terhadap Melanin
2.6 Kelainan 2.7 Faktor – Faktor yang
Pigmentasi Kulit menghambat
2.6.1 Melasma Melanogenesis
2.6.2 Melanoma 2.7.1 Penghambat enzim
Maligna tirosinase
2.6.3 Hiperpigmentasi 2.7.2 Penghambat
Pasca Inflamasi Transfer Melanosom
2.6.4 Okronosis 2.7.3 Agen Sitotoksik
  Terhadap Melanosit
2.7.4 Antioksidan
2.7.1 Penghambat enzim tirosinase
Bahan-bahan penghambat enzim tirosinase menurut Baumann dan
Alleman (2009) antara lain :
1.Hidrokuinon (HQ), merupakan baku emas untuk terapi
hiperpigmentasi. Konsentrasi mulai dari 2% hingga 10%, telah
banyak digunakan untuk melasma dan PIH. Mekanisme kerja HQ
selain menghambat kerja enzim tirosinase, tetapi juga bersifat
toksik terhadap sel melanosit. Hidrokuinon juga menghambat
metabolisme sel secara reversibel dengan mempengaruhi kerja
sintesis riboucleic acid (RNA) dan DNA. Efek yang dihasilkan agen
ini dapat menurunkan lesi hiperpigmentasi hingga 90%.
2.Aloesin, senyawa kimia C-glycosylated chromone ini berasal dari
tanaman aloe vera. Senyawa ini akan menghambat enzim
tirosinase dengan dua cara,yaitu menghambat hidroksilasi tirosin
menjadi DOPA dan oksidasi DOPA menjadi DOPAkinon. Aloesin
memiliki efek inhibisi lebih kuat dibanding arbutin dan asam kojik.
3. Arbutin, senyawa kimia 4-hydroxyphenyl β-D
glucopyranoside merupakan sebuah molekul hidrokuinon
yang berikatan dengan glukosa. Arbutin berasal dari
berbagai tanaman seperti pohon pir, gandum dan
bearberry. Mekanisme kerjanya lebih kepada penghambat
reversibel aktivitas enzim tirosinase di dalam melanosit
daripada penurun sintesis enzim tirosinase itu sendiri.
4. Hidrokumarin, merupakan senyawa kumarin yang bekerja
langsung pada enzim tirosinase sehingga menghambat
melanogenesis dan juga menghambat sintesis glutation.
Kombinasi antara senyawa ini dengan vitamin E dapat
mencegah hiperpigmentasi dengan bekerja sebagai
penetralisir radikal bebas.
5. Asam kojik, merupakan metabolit
jamur seperti Aspergillus,
Acetobacter dan Penicillium.
Mekanisme kerjanya adalah dengan
mengikat copper sehingga aktivitas
enzim tirosinase terhambat.
Keuntungan lain adalah asam kojik
memiliki efek pengawet dan
antibiotik sehingga bahan ini lebih
stabil sebagai produk kosmetik.
 Enzim tirosinase memegang
peranan paling besar diantara
semua enzim yang terlibat dalam
produksi melanin. Proses ini
dimulai oleh hidroksilasi tirosin
menjadi 3,4 dihidroksifenilalanin
(DOPA) oleh enzim tirosinase,
kemudian oksidasi DOPA menjadi
dopakuinon. Dopakuinon
kemudian mengalami salah satu
dari dua tahap berikut, apabila
dopakuinon berikatan dengan
sistein, oksidasi sisteinildopa akan
menghasilkan pheomelanin.
Apabila tidak ada sistein,
dopakuinon secara spontan akan
menjadi dopakrom, kemudian
dopakrom akan mengalami
dekarboksilasi dan tautomerisasi
menjadi eumelanin (Kindred dan
Halder, 2010).
kanisme ekstrak etanol bunga gemitir dalam melanogenesis
Bunga Gemitir (Tagetes erecta)
2.8 BUNGA GEMITIR
Tagetes erecta juga sering disebut
kenikir, ades (Indonesia), tahi kotok
(Sunda), amarello (Filipina), African
Marigold, Astec Marigold, American
Marigold, Big Marigold (Inggris). Tagetes
erecta merupakan anggota keluarga
Asteraceae yang terdiri dari 59 species.
Tanaman ini biasa digunakan sebagai
tanaman pagar dan pembatas.
2.9 Krim
Krim adalah bentuk emulsi minyak dalam air
atau dispersi asam lemak dalam mikrokristal air
atau alkohol yang dapat ditambahkan satu atau
lebih substansi obat terlarut.
2.10 Marmut (Cavia porcellus)
Marmut adalah hewan dengan banyak persamaan
biologis terhadap manusia, oleh karena itu marmut
banyak digunakan sebagai hewan coba. Marmut
memiliki melanin, baik eumelanin maupun pheomelanin

Marmut (Cavia porcellus)

 BAB III
KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN
HIPOTESIS PENELITIAN
 

3.1 Kerangka Berpikir

Penuaan menyebabkan gangguan baik fisik
maupun mental, sehingga diperlukan pencegahan,
perbaikan dan pengobatannya. Perubahan tersebut
disebabkan oleh faktor internal (genetik, hormonal,
radikal bebas dan faktor imun) dan eksternal (paparan
sinar UV dan obat-obatan).
Tidak diberikan Krim Pemberian Krim ekstrak
ekstrak Etanol bunga Etanol bunga gemitir
gemitir (Tagetes erecta) (Tagetes erecta)
3.3 Hipotesis Penelitian
Krim ekstrak etanol bunga gemitir
(Tagetes erecta) mencegah
peningkatan jumlah melanin kulit
marmut (Cavia porcellus) yang dipapar
sinar UVB.
Krim ekstrak etanol bunga gemitir
(Tagetes erecta) mencegah
peningkatan ekspresi tirosinase pada
kulit marmut (Cavia porcellus) yang
dipapar sinar UVB.
 BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1. Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dengan
menggunakan metode post test only control group design
(Federer, 2008)
4.2. Tempat dan Waktu Penelitian

4.2.1 Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan di Unit Laboratorium Biomedik Terpadu
Fakultas Kedokteran Universitas Udayana. Pemeriksaan fitokimia
dilakukan di Departemen Teknologi Pertanian dan Fakultas Teknologi
Pertanian Universitas Udayana. Pemeliharaan marmut dilakukan di
Laboratory Animal Unit Departemen Farmakologi Fakultas Kedokteran
Universitas Udayana. Pemeriksaan histopatologis jaringan kulit
dilakukan di Departemen Histologi Fakultas Kedokteran Universitas
Udayana.

4.2.2. Waktu Penelitian

Waktu penelitian dan pemeriksaan histopatologis dilakukan
selama 5 minggu, September 2019. 1 minggu adaptasi marmut, 2
minggu dipapar sinar UVB, 2 minggu untuk pemeriksaaan dan analisis
data.
4.3. Populasi dan Sampel
4.3.1. Populasi
Populasi dalam penelitian adalah marmut (Cavia porcellus) berusia
3 bulan, berwarna coklat, sehat serta mau makan dan minum.
Marmut diperoleh dari Laboratory Animal Unit Bagian Farmakologi
Fakultas Kedokteran Universitas Udayana.

4.3.2 Kriteria Sampel

4.3.2.1. Kriteria Inklusi
a. Marmut jantan (Cavia porcellus)
b. Strain lokal
c. Umur 3 bulan
d. Berat 300-350 gram
e. Satu hibrid
f. Sehat
g. Mau makan dan
h. Kulit sehat dan tidak ada lesi, trauma pada kulit.

4.3.2.2. Kriteria Drop Out

Kriteria drop out apabila marmut mati pada saat penelitian.
4.4. Besar Sampel dan Cara Pengambilan Sampel

Dengan menggunakan rumus dari Federer (Federer, 2008), maka besarnya

sampel dapat dihitung sebagai berikut :

(n – 1) (t – 1) ≥ 15
(n – 1) (2 – 1) = 15
(n – 1) (1) = 15
n – 1 = 15
n = 16

Keterangan :
n = Banyaknya ulangan
t = Banyaknya perlakuan

Berdasarkan perhitungan dengan rumus di atas maka diperoleh n = 16.

Karena sampel dibagi menjadi 2 kelompok, maka jumlah sampel adalah 32.
Sampel ditambah 10% dari 32 yaitu 3,2 sampel dibulatkan menjadi 36 ekor
untuk menghindari drop out selama penelitian.
4.5. Variabel Penelitian
Variabel dalam penelitian ini terdiri dari variabel bebas, variabel
tergantung, variabel kendali dan variabel kondisi.
4.5.1 Identifikasi Variabel
Variabel yang diukur adalah jumlah melanin dan ekspresi tirosinase yang
diambil dari jaringan kulit marmut secara histopatologis pada kelompok
yang dipapar sinar UVB dengan pemberian krim dasar dan kelompok yang
dipapar sinar UVB dengan pemberian krim ekstrak etanol bunga gemitir.

4.5.2 Klasifikasi Variabel

Variabel bebas adalah krim ekstrak etanol bunga gemitir (Tagetes erecta)
dan krim dasar.
Variabel tergantung adalah jumlah melanin dan ekspresi tirosinase.
Variabel kendali adalah umur, strain marmut, warna, genetik, pakan
marmut, aktivitas marmut, berat badan marmut, kesehatan marmut.
Variabel kondisi adalah paparan sinar UVB.
4.3.3 Definisi Operasional Variabel
Krim ekstrak etanol bunga gemitir (Tagetes erecta) menggunakan bunga
gemitir yang dibeli di pasar Badung di kota Denpasar. Bunga tumbuh di
Desa Belok, Bedugul, Kecamatan Baturiti, Tabanan.
Cara pemberian krim ekstra etanol bunga gemitir selama 20 menit
sebelum paparan sinar UVB dan 1 kali sehari pada setiap paparan.
Paparan UVB 3x seminggu dengan dosis 65 ml/cm2 selama 65 detik.
Pemberian krim ekstrak etanol bunga gemitir 4 jam sesudah paparan sinar
UVB.
Plasebo adalah Krim dasar yang diberikan secara oles dengan cara
pemberian 20 menit sebelum paparan sinar UVB dan 1 kali setiap hari
pada saat tidak mendapat paparan. Paparan UVB 3x seminggu dengan
dosis 65 ml/cm2 selama 65 detik. Pemberian krim ekstrak etanol bunga
gemitir 4 jam sesudah paparan sinar UVB
Jaringan kulit marmut adalah jaringan histologis yang diambil dari kulit
punggung marmut yang dipapar sinar UVB dan pemberian krim, dengan
punch biopsy diameter 4 mm, kedalaman subkutan 2 mm atau sampai
terlihat otot punggung.
 Melanin adalah pigmen yang dihasilkan oleh sel melanosit. Pigmen melanin
ditunjukan oleh luas daerah epidermis yang berwarna hitam pada pewarnaan
immunohistokimia Masson-Fontana. yang dinyatakan dengan ukuran
persentase pixel. Jumlah melanin akan diukur dalam persentase jumlah
melanin ditentukan melalui perhitungan pixel melanin dibagi pixel epidermis
dikalikan 100%

 Ekspresi tirosinase adalah enzim tirosinase yang diekspresikan oleh melanosit

di epidermis yang dideteksi mengunakan immuhistokimia menggunakan kit
antibodi primer anti tyrosinase merk Bioss (USA) dan antibodi sekunder merk
DAKO (Denmark). Enzim tirosinase ditunjukkan dengan sel melanosit inti
berwarna biru dengan sitoplasma berwarna coklat. Ekspresi tirosinase akan
diukur dalam persentase jumlah enzim tirosinase ditentukan melalui
perhitungan pixel tirosinase dibagi pixel epidermis dikalikan 100%.
4.6 Alat, Bahan dan Hewan Percobaan
Alat, bahan dan hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai
berikut :

4.6.1 Alat Penelitian

 Kandang marmut
 Lampu UVB merk Phillips
 Tempat minum merk Onyx
 Punch Biopsy merk Braun
 Timbangan digital merk Tanita
 Alat cukur silet merk Goal
 Penggaris besi merk Joyko
 Peralatan bedah seperti scapel
 Peralatan untuk membuat sediaan histopatologi seperti mikrotom Leica Jung
Histocut 820, gelas objek dan gelas penutup merk Yena.
 Mikroskop merk Olympus Cx4
 Kamera merk Optilab Pro
4.6.2 Bahan Penelitian
Bahan utama untuk penelitian ini adalah bunga gemitir (Tagetes erecta) yang
diekstrak di Laboratorium Pangan, Universitas Udayana.
Bahan untuk pewarnaan melanin adalah Masson-Fontana, pewarnaan akan
dilakukan di Laboratorium Histologi Universitas Udayana.
Bahan untuk pewarnaan ekspresi tirosinase adalah Immunohistokimia tirosinase,
pewarnaan akan dilakukan di Laboratorium Histologi Universitas Udayana.

4.6.3 Hewan Percobaan

Hewan percobaan adalah marmut (Cavia porcellus) jantan berusia 3 bulan, dengan
berat badan 300-350 gram, berwarna coklat diberi makanan ternak diet standar
(HI-GRO 552 dan sayuran). Komposisi makanan marmut terdiri dari lemak 3-4%,
karbohidrat 35-40%, protein 17-20%. Untuk minum menggunakan air matang secara
ad libitum dimana air minum dimasukkan ke dalam botol yang digantung pada
dinding kandang.
4.7 Prosedur Penelitian
4.7.1 Perlakuan Hewan Uji
 Sebanyak 36 ekor marmut diadaptasi selama 1 minggu.
 Secara random marmut dibagi menjadi 2 kelompok dimana
kelompok 1 dipapar sinar UVB dan dioles krim dasar (P0),
kelompok 2 dipapar sinar UVB dan dioles krim ekstrak
etanol bunga gemitir (P1), masing-masing kelompok terdiri
dari 18 ekor marmut.
 Semua marmut dari kelompok kontrol dan perlakuan
dicukur bulu punggungnya.
 Dua puluh menit akan memberikan waktu
penyerapan bahan topikal pada kulit, setelah
aplikasi bahan topikal kemudian diberikan paparan
UVB dan aplikasi bahan topikal diulang 4 jam
kemudian. Aplikasi bahan topikal tetap dilakukan di
hari tanpa penyinaran sebanyak 2 kali sehari.
 Marmut dari kelompok kontrol dan perlakuan
diberikan pajanan UVB sebanyak 3 kali seminggu
yaitu hari Senin, Rabu dan Jum’at untuk
mendapatkan dosis 65 mJ/cm2 selama 65 detik
setiap marmut dipapar dengan lampu UV dengan
jarak 5 cm selama 2 minggu.
 Untuk mengeliminasi akibat penyinaran akut, maka
pengambilan sampel kulit marmut dilakukan 48 jam setelah
penyinaran terakhir. Pada proses pengambilan sampel kulit di
daerah punggung sebelum diambil jaringan kulitnya, dicukur
bulunya, kemudian kulit dipunch biopsy dengan diameter 4
mm sampai terlihat otot punggung. Setelah itu dibuat
sediaan histopatologis dan dihitung jumlah melanin dan
ekspresi tirosinase pada epidermis sebagai data posttest.

 Total sampel yang didapat sebanyak 36 sampel. Sampel

diambil dari jaringan kulit dengan diameter 4 mm dan
kedalaman 2 mm sampai terlihat otot punggung, kemudian
dibuat sediaan histologis
 Pembuatan sediaan histologis
 Tahap fiksasi : Jaringan kulit direndam dalam
larutan formalin buffer fosfat 10% selama 1 hari.
 Tahap dehidrasi : Jaringan kulit direndam
dengan alkohol bertingkat berturut-turut30%,
40%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100% masing-
masing 3 kali selama 25 menit.
 Tahap clearing : Jaringan dimasukkan ke dalam
clearing agent (dengan cairan xylene) selama 2
x 60 menit.
 Tahap embedding : Setelah dilakukan infiltrasi
dengan paraffin murni sebanyak 2 x 60menit,
kemudian jaringan ditanam kedalam paraffin
cair, dibiarkan membentuk blok (± 2jam) agar
mudah diiris dengan mikrotom.
Tahap pemotongan
Pemotongan jaringan dilakukan
dengan mikrotom, tebal 5µm, untuk
dibuat slide dengan pewarnaan
Masson-Fontana, ditempelkan pada
gelas objek yang sudah diolesi
pelekat dan selanjutnya dikeringkan
dengan inkubasi 60oC selama 3 jam.
PEWARNAAN MASSON–FONTANA :
a.Proses deparafinisasi :
Masukkan slide jaringan ke dalam xylene selama 2 x 5 menit.

b. Proses rehidrasi :
Masukan slide jaringan ke dalam alkohol 100%, sebanyak 2 x
5 menit.
Masukan slide jaringan ke dalam alkohol 95%, sebanyak 2 x 2
menit.
Masukan slide jaringan ke dalam alkohol 70%, sebanyak 2 x
2 menit.
Masukan slide jaringan ke dalam air sebanyak 2 x 2 menit.
c. Panaskan dengan silver solution 560C selama 60 menit. Periksa di
bawah mikroskop hingga jaringan positif berwarna hitam.
 Cuci bersih dengan air destilasi (dH2O), sebanyak 4 x 1 menit.
 Masukkan slide jaringan pada 0,2% gold chloride selama 5 menit.
 Cuci bersih dengan air destilasi (dH2O).
 Fiksasi slide jaringan dalam 5% sodium thiosulphate selama 5 menit.
 Cuci dalam air dan 0,1% nuclear fast red selama 5 menit.
 Cuci bersih dengan air destilasi (dH 2O) sebanyak 4 x 1 menit.
 Masukan slide jaringan ke dalam alkohol 95% selama 1 menit.
 Masukan slide jaringan ke dalam alkohol 100% selama 5 menit.
 Masukan slide jaringan ke dalam xylane selama 2 x 5 menit.
 Mounting dengan entellan.
 Tutup dengan cover glass.
PENGAMATAN HASIL
Jumlah melanin dihitung dengan metode analisis
cepat digital, setiap sediaan preparat difoto dengan
menggunakan kamera Optilab Pro dan mikroskop
Olympus Cx41 dengan pembesaran objektif 40 kali,
masing-masing preparat difoto 3 kali, yaitu sisi kiri,
tengah, dan sisi kanan sediaan. Lapang pandang yang
diambil yaitu lapang pandang yang paling banyak
melanin yang ditandai dengan daerah berwarna
hitam. Hasil foto disimpan dalam format JPEG.
4.7.2 Preparasi simplisia

 Bunga gemitir dipilih yang masih segar

selanjutnya cuci bersih dibawah air mengalir.
 Bunga gemitir dipotong kecil-kecil lalu
dikeringkan, setelah kering lalu di masukkan
kedalam oven selama 24 jam
 Bunga gemitir diekstrak dengan ethanol 96%
4.7.3 Ekstraksi

Bunga gemitir (1000 gr) yang telah dipilih kemudian dicuci,

dipotong - potong dan digiling menggunakan dismill sehingga
didapatkan bentuk serbuk, kemudian dimaserasi (diendapkan)
ditambahkan pelarut ethanol 96% dengan perbandingan 1:1
(1000 gr bunga gemitir : 1000 gram ethanol 96%)maserasi 24
jam dalam suhu 4oC dalam botol warna gelap tertutup erat.
Selanjutnya larutan disaring menggunakan Kertas Whatman no
1 dan filtrat dievaporasi selama 20 menit. Hasil evaporasi berupa
ekstrak kental kemudian ditimbang, dilabel serta disimpan dalam
botol berwarna gelap dalam suhu 4oC.
4.7.4 Pembuatan krim
 Formulasi bahan dasar krim: Sepigel 305 sebagai
emulsifier dengan konsentrasi 3% dicampur ke
dalam air selama 5 menit, lalu masukkan lanol 2%,
dimethicon 2% dan phenoxyethanol 0,5%, lanjutkan
pencampuran hingga bahan berbentuk krim.
 Formulasi bahan krim ekstrak bunga gemitir 9%:
ekstrak bunga gemitir, Sepigel 305 sebagai
emulsifier dengan konsentrasi 3% dicampur ke
dalam air selama 5 menit, lalu masukkan lanol 2%,
dimethicon 2%, dan phenoxyethanol 0,5%, lanjutkan
pencampuran hingga bahan berbentuk krim, untuk
mendapatkan konsentrasi 9% krim ekstrak bunga
gemitir diperlukan 10 gram ekstrak dalam campuran
total 100 gram krim.
4.8. Analisis Data
Data yang telah terkumpul diproses dengan
SPSS 17.0 dan dianalisis dengan tahapan
berikut :
Analisis deskriptif yang dinilai adalah
mean,median,simpangan baku, nilai
minimum dan nilai maksimum dilakukan
untuk mengetahui karakteristik data yang
dimiliki.
 Analisis Normalitas dan Homogenitas
a. Uji
normalitas data menggunakan uji
Shapiro-wilk, karena jumlah sampel
kurang dari 50. Data penelitian
berdistribusi normal jika nilai p>0,05.
b. Uji
homogenitas data menggunakan
Levene’s test. Varian data penelitian
homogen jika nilai p>0,05.
 Analisis komparasi
Bila data berdistribusi normal maka
dilakukan uji t independent untuk
mengetahui kemaknaan (signifikansi)
perbedaan antara 2 kelompok. Jika data
tidak berdistribusi normal maka data di
transformasi kembali bila data menjadi
normal maka dipakai uji t independent
Kalau data tidak normal maka data di
transformasi ke uji Mann Whitney
Data dinyatakan terdapat perbedaan
bermakna jika nilai p<0,05.
 BAB V
HASIL PENELITIAN
Subjek yang digunakan berjumlah 36 ekor yang dibagi menjadi 2
kelompok (masing- masing 18 ekor). Kelompok pertama adalah
kelompok kontrol (perlakuan dengan pemberian paparan sinar
ultraviolet B dan krim dasar), kelompok kedua adalah kelompok
perlakuan (perlakuan dengan pemberian paparan sinar ultraviolet B
dan krim ekstrak Bunga Gumitir 9%). Total radiasi UVB diterima
selama 2 minggu adalah 390 mJ/cm2, perlakuan krim dasar dan krim
ekstrak Bunga Gumitir 9% pada masing- masing kelompok diberikan
setiap hari, 20 menit seelum dan 4 jam sesudah radiasi UVB.
5.1 Analisis Deskriptif Data
Variabel Kelompok Rerata SB Median Min. Maks.

Tirosinase (%) Krim Dasar 35,13 6,92 35,14 22,53 49,24

Krim Ekstrak Bunga 12,77 4,30 12,78 7,32 20,42

Gumitir 9%

Melanin (%) Krim Dasar 24,63 4,87 25,35 12,78 31,34

Krim Ekstrak Bunga 6,07 4,53 4,77 0,62 16,88

Gumitir 9%
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekspresi tirosinase pada
kelompok kontrol (perlakuan dengan pemberian paparan sinar
ultraviolet B dan krim dasar) adalah rerata 35,13%, simpangan
baku 6,92, median 35,14%, nilai minimum 22,53%, dan nilai
maksimum 49,24%. Sedangkan pada kelompok perlakuan dengan
sinar UVB krim ekstrak bunga Gumitir 9% ekspresi tirosinase
adalah rerata 12,77%, simpangan baku 4,30, median 12,78%,
nilai minimum 7,32%, dan nilai maksimum 20,42%.
 Hasil Uji Normalitas Data
Uji normalitas bertujuan untuk mengetahui
distribusi data yang didapatkan. Uji normalitas
data pada penelitian ini dilakukan dengan
Shapiro Wilk test karena jumlah sampel per
kelompok ≤ 50. Hasil uji normalitas data
menunjukkan bahwa seluruh data hasil
penelitian ini berdistribusi normal (p>0,05).
5.2 Hasil Uji Normalitas Data
Kelompok p Keterangan

Ekspresi Tyrosinase    
Krim Dasar 0,927 Normal

Krim Ekstrak Bunga Gumitir 9% 0,132 Normal

Jumlah Melanin    
Krim Dasar 0,099 Normal

Krim Ekstrak Bunga Gumitir 9% 0,058 Normal

 Hasil Uji Homogenitas Data
Uji homogenitas bertujuan untuk
mengetahui varian data. Uji homogenitas
data pada penelitian ini dilakukan dengan
Levene’s Test. Hasil uji homogenitas data
menunjukkan bahwa data kadar tirosinase
dan jumlah melanin memiliki varian data
yang homogen (p>0,05).
5.3 Hasil Uji Homogenitas Data

Variabel P Keterangan

Kadar tyrosinase 0,152 Homogen

Jumlah melanin 0,917 Homogen

5.4 Hasil Analisis Komparasi
Data Ekspresi Tyrosinase dan
Jumlah Melanin

Analisis komparasi dilakukan dengan

menggunakan uji parametrik karena
data berdistribusi normal (p<0,05)
5.4 Hasil Uji Komparasi Data

Variabel Kelompok Rerata±SB P

Tirosinase (%) Krim Dasar 35,13±6,92  

<0,001

Krim Ekstrak Bunga Gumitir 9% 12,77±4,30

Melanin (%) Krim Dasar 24,63±4,87 <0,001

Krim Ekstrak bunga gemitir 9% 6,07±4,53
Gambaran Melanin Kulit Marmut
Dengan Pewarnaan IHC
Tyrosinase
A B
 Keterangan gambar : Jaringan histopatologis epidermis
kulit marmut dengan pembesaran 400x. Kelompok
kontrol diberikan krim dasar dan dipapar sinar UVB,
tampak warna coklat yang luas di sitoplasma ditandai
oleh tyrosinase (panah hijau) pada jaringan epidermis
marmut. Kelompok perlakuan, diberikan krim ekstrak
Bunga Gumitir 9% dan dipapar sinar UVB, tampak warna
coklat yang lebih sedikit ditandai oleh tyrosinase (panah
hijau) sedangkan sitoplasma tanpa warna coklat
ditandai oleh tidak adanya tyrosinase (panah merah).
 Hasilanalisis komparasi menunjukkan bahwa
rerata ekspresi tirosinase pada kelompok kontrol
adalah 35,13±6,92% sedangkan pada kelompok
perlakuan adalah 12,77±4,30%. Analisis komparasi
dengan menggunakan independent t- test
menunjukkan bahwa nilai p<0,001. Hal ini
menunjukkan bahwa kadar tirosinase antara
kelompok kontrol dan perlakuan, setelah 2 minggu
perlakuan adalah berbeda bermakna (p<0,05).
Perbandingan Ekspresi
Tirosinase antar Kelompok
Gambaran Histopatologis
Jumlah Melanin Kulit Marmut

 Setelah dua minggu perlakuan,

jaringan kulit punggung marmut
dibiopsi untuk dilakukan
pemeriksaan histopatologis. Melanin
akan berwarna hitam pada
pewarnaan Masson-Fontana
 Gambaran Melanin Kulit Marmut
Dengan Pewarnaan Masson
Fontana
A B
 Keterangan gambar : Jaringan histopatologis epidermis kulit
marmut dengan pembesaran 400x. Kelompok kontrol diberikan
krim dasar dan dipapar sinar UVB, tampak lesi hiperpigmentasi
yang luas ditandai oleh melanin (panah hijau) yang berwarna
coklat/hitam yang padat pada jaringan epidermis marmut.
Kelompok perlakuan, diberikan krim ekstrak Bunga Gumitir 9%
dan dipapar sinar UVB, tampak lesi pigmentasi yang lebih sedikit
ditandai oleh melanin (panah hijau) berwarna hitam sedikit
berkelompok dan sedikit menyebar ke lapisan atas epidermis.

 Selainitu, hasil analisis komparasi
menunjukkan bahwa rerata jumlah melanin
pada kelompok kontrol adalah 24,63±4,87%
sedangkan pada kelompok perlakuan adalah
6,07±4,53%. Analisis komparasi dengan
menggunakan independent t-test
menunjukkan bahwa nilai p<0,001. Hal ini
menunjukkan bahwa jumlah melanin antara
kelompok kontrol dan perlakuan, setelah 2
minggu perlakuan adalah berbeda bermakna
(p<0,05).
Perbandingan Jumlah
Melanin antar Kelompok
 BAB VI
PEMBAHASAN
 6.1 EFEK SINAR UV
Melanin menyerap radiasi ultraviolet di seluruh spektrum
yang luas tetapi sangat efektif menyerap sinar ultraviolet
dengan Panjang gelombang 280-320nm, sedangkan
Panjang gelombang UVC (270-290nm), UVA (320-400nm),
dan UVB (290-320nm), sehingga diketahui bahwa UVB
menyebabkan kerusakan biokemikal paling potensial dan
memberi efek akut dalam hiperpigmentasi. Pada
penelitian ini pemaparan UVB yang dipilih untuk
memberikan efek hiperpigmentasi atas dasar tersebut
 Paparan sinar UVB tersebut menyebabkan
pembentukan ROS yang selanjutnya akan
meningkatkan kadar enzim tyrosinase.
Tirosinase mempunyai peran kunci dalam
pembentukan melanin selama proses
melanogenesis berlangsung. Enzim ini mampu
menghidroksilasi L-tirosin (monofenol) menjadi
L- DOPA (difenol) dan mengoksidasi L-DOPA
menjadi dopaquinon (senyawa kuinon).
Dopaquinon akan bereaksi spontan membentuk
dopakrom yang kemudian menjadi melanin.
 6.2 Efek Pemberian Krim
Ekstrak Etanol Gemitir 9%
 Hambatan pembentukan tirosinase pada kelompok yang
diberikan krim ekstrak etanol bunga gemitir 9% pada
penelitian ini berdampak pula pada hambatan pembentukan
melanin, karena pembentukan melanin membutuhkan
tirosinase. Rerata jumlah melanin pada kelompok kontrol
lebih banyak dibandingkan pada kelompok perlakuan adalah.
Analisis komparasi menunjukkan bahwa nilai p<0,001, yang
berarti bahwa jumlah melanin pada kelompok perlakuan krim
ekstrak etanol bunga gemitir 9% jauh lebih rendah bermakna
dibandingkan kelompok perlakuan krim dasar (p<0,05).
 Hasilpenelitian ini serupa dengan hasil
penelitian sebelumnya pada ekstrak gemitir
genus lainnya calendula officinalis yang telah
membuktikan efek menurunkan produksi
melanin pada sel kultur melanoma yang
diinduksi dengan MSH (Xuan dkk,2019).
 Penelitian ini adalah penelitian in vivo
pertama yang membuktikan efektivitas ekstrak
etanol bunga gemitir (tagetes erecta) sebagai
agen anti- hiperpigmentasi pada kulit marmut
(Cavia porcellus).
6.3 Efektifitas Pemberian Krim Ekstrak Etanol Bunga
Gemitir 9% terhadap kadar enzim tyrosinase dan
jumlah melanin pada Kulit marmut yang dipapar UVB
Dibandingkan dengan Penelitian Lainnya Yang Serupa

 Pada penelitian ini dimana dilakukan

pemberian krim ekstrak etanol bunga gemitir
9% yang dioleskan pada kulit marmut jantan
yang dipapar sinar UVB dan didapatkan hasil
perhitungan rerata kadar enzim tirosinase
pada kelompok yang diberikan perlakuan
ekstrak etanol bunga gemitir 9% sebesar
12,77 lebih rendah 22,36 dibandingkan
kelompok kontrol sebesar 35,13.
 Penelitian lain yang juga dilakukan oleh Putri (2018)
yang menggunakan krim ekstrak daun teh hijau 20%
untuk mencegah peningkatan jumlah melanin pada
marmut jantan yang dipapar sinar UVB didapatkan
didapatkan hasil perhitungan rerata jumlah melanin
pada kelompok yang diberikan perlakuan ekstrak daun
teh hijau sebesar 1,34 lebih rendah 21,86 dibandingkan
kelompok kontrol sebesar 23,20. Hal ini memperlihatkan
terdapat perbedaan bermakna rerata jumlah melanin
antara kelompok kontrol dan kelompok perlakuan yang
diberikan krim ekstrak daun teh hijau 20%.
 BAB VII
SIMPULAN DAN SARAN
7.1 SIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat
disimpulkan beberapa hal sebagai berikut:
Pemberian krim ekstrak etanol bunga gemitir (tagetes erecta)
menghambat peningkatan kadar tirosinase pada marmut (Cavia
porcellus) yang dipapar sinar ultraviolet B (UV B).
Pemberian krim ekstrak etanol bunga gemitir (tagetes erecta)
menghambat peningkatan jumlah melanin pada marmut (Cavia
porcellus) yang dipapar sinar ultraviolet B (UV B).
7.2 SARAN
Perlu dibandingkan efektivitasnya dengan gold
standard terapi hiperpigmentasi seperti
hidrokuinon.
Perlu melakukan penelitian lebih lanjut
seperti indeks keamanan serta clinical trial
sebelum dapat digunakan secara luas pada
manusia
Plasebo Dosis 3%

Dosis 6% Dosis 9%
Plasebo Dosis 6%

Dosis 9% Dosis 3%