PEMBELAJARAN 13

KROMATOGRAFI CAIR
KINERJA TINGGI
(HPLC/KCKT)
OUT LINE
 PERALATAN
 KONSEP HPLC/KCKT
 FASA DIAM & FASA GERAK
 APLIKASI KUALITATIF &

KUANTITATIF
PERALATAN
Keterangan gambar
Prinsip Kerja HPLC
 adalah pemisahan komponen analit berdasarkan
kepolarannya, setiap campuran yang keluar akan
terdeteksi dengan detektor dan direkam dalam
bentuk kromatogram.

 Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut : dengan

bantuan pompa fasa gerak cair dor.
Cuplikan dialirkan melalui kolom ke detektor.
Cuplikan dimasukkan ke dalam fasa gerak dengan
cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi
pemisahan komponen-komponen
campuran.Karena perbedaan kekuatan interaksi
antara solut-solut terhadap fasa diam.
Detektor
Pemilihan Fase Didasarkan Pada
Syarat eluen yang baik
JENIS KCKT BERDASARKAN FASE
KCKT ADSORPSI
KCKT PARTISI
KCKT EKSKLUSI
KCKT PENUKAR ION
KCKT ADSORPSI
 Kromatografi adsorbsi sangat cocok untuk pemisahan
senyawa yang agak polar. Partikel-partikel silica atau
alumina biasanya digunakan sebagai adsorben. Gugus polar
silanol pada permukaan silica dan gugus polar aluminol
pada permukaan alumina bertindak sebagi tempat-tempat
adsorbsi untuk molekul-molekul polar. Jenis kromatografi
ini menggunakan fasa gerak nonpolar seperti heksana dan
jenis kromatografi ini disebut juga kromatografi fasa
normal. Untuk mengontrol restensi solut, biasanya
ditambahkan sedikit senyawa polar kepada fasa gerak,
misalnya propanol atau air sebagai modifier. Modifier ini
bersaing dengan molekul-molekul solut untuk merebut
tempat adsorbsi. Waktu retensi dapat diperpendek dengan
menaikkan kosentrasi modifier.
KCKT PARTISI
 Retensi solut dalam kromatografi partisi analog dengan proses
ekstrasi cair-cair. Kosentrasi solut dalam masing-masing fasa cair
dinyatakan dengan koefisien partisi. Biasanya fasa gerak lebih polar
daripada fasa diam (kebalikan kromatografi adsrobsi) sehinggga
jenis kromatografi ini disebut kromatografi fasa terbalik (reserved
phase chromatography) untuk menjelaskan proses. Kromatografi
partisi merupakan salah satu kromatografi fasa terbalik. Oleh karena
itu fasa diam non piolar hanya dilapiskan fasa gerak haruk tidak
bercampur dengan fasa diam, kemudian fasa gerak harus di
jenuhkna dengan zat cair fasa diam untuk mengurangi erosi lapisan
fasa diam. Pemisahan senyawa-senyawa nonpolar dapat dilakukan
dengan kromatografi partisi ini. Salah satu kendala jenis
kromatografi ini adalah keterbatasan selektivitas sebagai akibat
ketidakcampuran kedua fasa. Kedua cairan (fasa gerak dan fasa
diam) berbeda dengan beberapa senyawa sangat kuat terikat dalam
salh satu fasa. Dengan demikian beberapa senyawa tertahan kuat
atau tidak tertahan sama sekali pada fasa diam. Oleh karena
keterbatasan ini maka jenis kromatografi partisi tidak digunakan lagi
sebagai teknik analisis rutin.
KCKT EKSKLUSI
 Ukuran molekul merupakan kriteria utama dalam pemisahan dengan
kromatografi eksklusi ukuran. Teknik ini berbeda dengan kromatografi
lainnya karena disini hampir tidak ada fasa diam. Interaksi polar dan
nonpolar antara solut dan fasa diam pada dasarnya tidak diharapkan karena
hal itu mempersulit retensi. Pemisahan terjadi karena solut-solut berdifusi
masuk dan keluar pori-pori material paking kolom. Jelas sekali bahwa ukuran
masing-masing molekul mengontrol seberapa jauh molekul dapat menembus
pori-pori paking kolom. Molekul-molekul yang lebih besar dari diameter
pori-pori akan melewati kolom secara cepat dan dikenal dengan istilah
volume tereksklusi. Sebaliknya molekul-molekul kecil menempati volume
pori dan tertahan lebih lama. Retensi maksimum terjadi ketika molekul yang
cukup kecil menggunakan semua volume pori. Molekul-molekul tersebut
terelusi dalam volume permeasi, volume tereksklusi ditambah volume pori.
Tidak seperti teknik kromatografi lainnya, komposisi sedikit atau tidak
berpengaruh terhadap retensi solut. Parameter pemisahan dikontrol terutama
oleh pilihan dan material paking kolom. Material paking mempunyai berbagai
ukuran pori dan material paking dengan tidak terlalu bervariasi ukuran pori
akan memberikan resolusi yang baik tapi hanya berguna untuk rentang berat
molekul tertentu. Akan tetapi, kromatografi eksklusi ukuran merupakan
teknik yang berguna untuk mengkarakterisasi distribusi berat molekul
polimer, pemurnian cuplikan biologis, dan pemisahan senyawa-senyawa
dengan berat molekul 2000 atau lebih.

KCKT PENUKAR ION
 Kromatografi penukar ion merupakan teknik
pemisahan campuran ion-ion atau molekul-
molekul yang dapat di-ion-kan. Ion-ion bersaing
dengan ikon-ion fasa gerak untuk memperebutkan
tempat berikatan pada fasa diam. Jelas, muatan ion
sangat penting dan pH fasa gerak dapat
divariasikan untuk mengontrol derajat ionisasi.
Terdapat duan jenis penukar ion : anionic (-NH4+X-)
dan kationik (-SO3-A+). Suatu anion akan tertahan
pada kolom penukar anion tapi sangat terelusi
pada kolom penukar kation. Dasar pemisahan
berasal dari perbedaab afinitas senyawa bermuatan
terhadap permukaan penukar ion.
Uji kesesuaian sistem
sambungan
sambungan
APLIKASI
 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) merupakan
suatu metoda pemisahan canggih dalam analisis
farrnasi yang dapat digunakan sebagai uji identitas, uji
kemumian dan penetapan kadar. Titik beratnya adalah
untuk analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah
menguap dan tidak stabil pada suhu tinggi, yang tidak
bisa dianalisis dengan Kromatografi Gas. Banyak
senyawa yang dapat dianalisis, dengan KCKT mulai dari
senyawa ion anorganik sampai senyawa organik
makromolekul. Untuk analisis dan pemisahan obat atau
bahan obat campuran rasemis optis aktif dikembangkan
suatu fase pemisahan kiral (chirale Trennphasen) yang
mampu menentukan rasemis dan isomer aktif.
EVALUASI
1. BPOM akan melakukan uji logam pada kosmetik
yang beredar dipasaran, instrumen yang
digunakan adalah:
A. HPLC
B. LC-MS
C. AAS
D. ESI-MS
E. UFLC
2. Industri farmasi melakukan verifikasi metode PK
kaplet amoxilin dan asam klavulunat dengan
metode KCKT. Diperoleh waktu retensi 4,2 dan 2,
luas area puncak 1,5 dan 0,5. Hitung resolusinya?
A. 1,1 B. 2,2 C.3,3 D. 4,4 E. 5,5
Lanjutan evaluasi
3).Apoteker di Industri sedang
mengembangkan sediaan sirup Paracetamol
dan Ibuprofen dengan KCKT. Diperlukan
analisis penentuan kadar dengan uji
kesesuaian sistem. Parameter yang
diperlukan
A. Faktor kapasitas
B. Luas kurva baku
C. Panjang gelombang maksimum
D. Resolusi
E. Tilling factor
Sambungan evaluasi
4). Bagian R & D akan mengembangkan produk
sirup campuran PCT dan Ibuprofen. Untuk
menguji kadarnya secara simultan dilakukan
dengan KCKT. Apa parameter
pengukurannya?
A. Luas kurva baku
B. Luas area maksimum
C. Waktu Retenjsi
D. Resolusi
E. Panjang gelombang
Sambungan evaluasi
 5). Bagian riset dan pengembangan di Industri
Farmasi melakukan pengembangan metode
analisis penetapan kadar zat aktif paracetamol
dan ibuprofen dalam sirup secara simultan
menggunakan KCKT. Agar memastikan bahwa
analit yang terukur adalah paracetamol dan
ibuprofen, maka metode analisis harus
memenuhi syarat parameter tertentu. Parameter
tersebut adalah:
A. Akurasi
B. Batas detekisi
C. Linieritas
D. Presisi
E. Spesifitas
Essay Test
 Senyawa A dan B memiliki waqktu retensi
masing-masing 16,40 dan 17,63 menit pada
kolom 30,0 cm. Spesies yang tidak
dipertahankan melewati kolom dalam 1,30
menit. Lebar puncak untuk A dan B adalah 1,11
dan 1,21menit. Hitunglah:
A. Resolusi kolom
B. Jumlah rata-rata pelat di kolom tersebut
C. Tinggi pelat
D. Panjang kolom yang dibutuhkan untuk
mencapai resolusi 1,5
E. Waktu yang dibutuhkan untuk mengelusi zat B
pada kolom yang lebih panjang