TEKNIK DASAR

HISTOKIMIA
dr. Fadhilah Arsyil
PENDAHULUAN
Identifikasi, lokalisasi, dan kuantifikasi dalam sel
dan jaringan dengan uji kimia atau fisik menggunakan
substansi / zat tertentu yang reaktif, dan memiliki
aktivitas yang dikatalisis enzim.
PRINSIP DASAR
Histokimia menggabungkan metode histologi
dengan metode kimia atau biokimia, untuk
mengungkapkan komposisi biokimia jaringan dan sel di
luar distribusi asam-basa yang ditunjukkan oleh
metode pewarnaan standar (H & E), tanpa
mengganggu distribusi normal bahan kimia
TUJUAN
1. Penyajian distribusi kimia normal
2. Penyajian komposisi kimia normal
3. Kekhasan reaksi
4. Deteksi produk reaksi
PENGAPLIKASIAN
• Identifikasi, kuantifikasi, dan lokalisasi
1. zat kimia
2. ekspresi gen
3. struktur biologis, organel
4. tipe sel spesifik
• Memperjelas struktur dan morfologi sel dan jaringan
• Menetukan batas fungsional
PEWARNAAN HISTOKIMIA
RUTIN
 Karbohidrat
 Asam Nukleat
 Lipid
 Amiloid
 Pewarnaan untuk Mikroorganisme
 Pewarnaan jaringan ikat
 Pigmen dan mineral
 PEWARNAAN KARBOHIDRAT
• Periodic acid schiff (PAS)
• Alcian blue
• Kombinasi teknik Alcian blue – PAS
• Teknik Mucicarmine
• Teknik Colloidal iron
• Pewarnaan Metachromatic
• Pewarnaan Iodine untuk glycogen
• Teknik digesti enzymatic :
1. Digesti Diastase
2. Digesti Sialidase
3. Digesti Hyaluronidase
 PERIODIC ACID SCHIFF (PAS)

Digunakan untuk menunjukkan zat-zat berikut :

1) Polisakarida :
Makromolekul ini terdiri dari unit monosakarida yang bergabung dengan ikatan
kovalen. Polisakarida utama yang diidentifikasi melalui pewarnaan histologi
adalah glikogen, yang terdapat di banyak jaringan, termasuk otot rangka, otot
jantung, hati, dan ginjal
2) Zat / substansi mucus netral :
PAS juga biasa digunakan untuk mewarnai dan mengidentifikasi glikoprotein,
glikolipid, dan mucin netral, yang diproduksi oleh sel-sel epitel di organ yang
berbeda
Digunakan untuk menunjukkan zat-zat berikut :
3)Membran dasar jaringan :
Lapisan tipis jaringan ikat retikuler, epitel dan endotelium sampai ke
lapisan bawah jaringan ikat menunjukkan posistif PAS
4)Jamur :
Dinding sel beberapa organisme jamur hidup mengandung kadar
karbohidrat yang tinggi, dan juga menunjukkan positif dengan
pewarnaan PAS
 FUNGSI PEWARNAAN PAS

Membantu mendiagnosis :
1)Glycogen storage diseases :
Ini adalah kondisi di mana jumlah glikogen yang berlebihan disimpan
di hati, otot, atau ginjal. PAS sering digunakan secara rutin di klinik
untuk menunjukkan akumulasi glikogen dalam biopsi jaringan ini.
2)Tumor :
Granula glikogen juga dapat ditemukan pada beberapa tumor,
termasuk beberapa yang muncul di jaringan seperti pankreas, paru-
paru, dan kandung kemih
Membantu mendiagnosis :
3) Infeksi jamur :
PAS dapat digunakan untuk memvisualisasikan beberapa organisme
jamur di bagian jaringan
4) Membran dasar :
PAS dapat digunakan untuk menyoroti abnormalitas membran
dasar, seperti pada penyakit glomerulus di ginjal

Gambar : Pewarnaan PAS (ginjal)
Result :
Glycogen & mucin netral = merah / magenta
Nukleus = biru
Pewarnaan PAS terutama digunakan untuk
struktur pewarnaan yang mengandung
proporsi karbohidrat yang tinggi seperti
glikogen, glikoprotein, proteoglikan yang
biasanya ditemukan di jaringan ikat, mucus
dan membran basement. Sering digunakan
untuk mewarnai biopsi ginjal, biopsi hati,
Glycogen storage diseases pada otot lurik
dan dugaan infeksi jamur
Alcian Blue biasanya disiapkan pada pH 2,5 Gambar : Pewarnaan Alcian Blue (kolon)
dan digunakan untuk mengidentifikasi
mucopolysaccharides asam dan mucin asam. Result :
Jumlah berlebih dari mukosida asam non-sulfat Sulfomucin, sialomucin, proteoglycans,
terlihat di mesothelioma, jumlah tertentu terjadi Hyaluronic acid = biru
secara normal di dinding pembuluh darah Nukleus = merah
tetapi peningkatan lesi awal aterosklerosis
 • Menunjukkan keberadaan mucin
Gambar : Alcian Blue & PAS (usus)
• Membedakan mucin asam & mucin netral
• Mucin asam terwarnai biru dengan Alcian
blue
• Mucin asam pada PAS (+) tidak akan
terwarnai pada reaksi PAS
• Hanya mucin netral yang terwarnai
(magenta)
 PEWARNAAN LIPID
• Lipid di jaringan dapat memiliki kepentingan diagnosis pada
beberapa kondisi
• Misalnya: endapan lemak pada radang xanthomatosa, emboli
kolesterol pada mikroinfark, lemak sitoplasmik pada sel tumor
sebaseus, dan sebagainya
Gambar : Sudan Black B

Result :
Produksi pigmen hitam dan granular
menunjukkan reaksi positif
 PEWARNAAN PIGMEN & MINERAL

• Terdapat sejumlah mineral dan pigmen di jaringan yang memiliki relevansi

patologik. Contoh: besi, tembaga, melanin, kalsium, asam urat, dan pigmen
bilirubin
• Besi dalam jaringan biasanya berada dalam bentuk ion ferat
• Endapan tembaga dapat ditemukan pada kondisi gangguan metabolism
herediter, yaitu penyakit Wilson
• Melanin: senyawa yang mengandung tirosin dan dihasilkan oleh melanosit
• Kalsium dapat ditemukan pada kalsinosis kutis dan pseudoxanthoma elasticum
• Endapan asam urat dapat ditemukan pada tophi akibat gout di berbagai organ
• Pigmen bilirubin dapat ditemukan di berbagai jaringan pada kondisi gagal hati
Reaksi terjadi antara potongan bagian jaringan Gambar : Perl’s prussian blue
dengan larutan asam ferrocyanide. Setiap ion
besi (Fe3+) dalam jaringan bergabung dengan Result :
ferrocyanide dan menghasilkan pembentukan Ferric ion (Fe3+) = biru
pigmen biru terang yang disebut "prussian Nukleus = merah
blue" atau ferric ferrocyanide Background / counter stain = pink
 Gambar : Von Kossa

Pewarnaan Von Kossa menunjukkan banyak

Result :
deposit kalsium hitam dalam mukosa
Kalsium = hitam
skuamosa dan eksudat fibrinopurulen
Nukleus = merah
Sitoplasma = pink terang
Pewarnaan Fontana Masson berfungsi untuk
mewarnai pigmen melanin dan sel argentaffin
dalam warna hitam.

Melanin secara fisiologis terletak di kulit,

mata, substansia nigra otak dan folikel
rambut. Studi kuantitatif dari produksinya
dapat diterapkan untuk melakukan tes
validasi aktivitas produk dermo-kosmetik.
Dalam kondisi patologis seperti itu, melanin
juga dapat ditemukan dalam tumor sel-sel
saraf atau melanoma.

Gambar : Fontana Masson (kulit)

Pewarnaan Fontana Masson umumnya
diterapkan pada kulit dan semua jaringan yang
mengandung folikel rambut. Ini juga dapat Result :
diterapkan dalam jaringan seperti usus kecil Melanin = hitam
yang mengandung sel argentaffin. Nukleus = merah
 AMYLOID

• Merupakan substansi jaringan yang khusus akibat suatu kondisi yang

patologik
• Protein ini berbentuk fibriler yang membentuk batang dengan
panjang bervariasi dengan diameter 7,5-10 nm
• Menumpuk di ekstraseluler seperti benang kusut
• Sebagian kecil komponen amiloid adalah sulfoproteoglikan → sifat
kimia mirip dengan polisakarida dan substansi mukoid tertentu
 Gambar : Congo Red
• Congo red positif pada glomerulonefritis
fibrillary.
Result : • Amiloidosis, glomerulonefritis fibrillary
Amyloid = merah (FGN), ditandai oleh endapan ginjal
Nukleus = biru dengan substruktur terorganisir di bawah
mikroskop elektron daya tinggi.
 MIKROORGANISME
• Umumnya, teknik pewarnaan memanfaatkan konstituen kimia pada dinding bakteri.
• Pewarnaan umum bakteria adalah menggunakan metode Gram dan Giemsa
• Beberapa pewarnaan khusus misalnya Ziehl Nielsen untuk Mycobacterium
tuberculosis dan Fite Faraco untuk Mycobacterium leprae

• Pendekatan pewarnaan fungi dgn memanfaatkan kandungan polisakarida

(glikoprotein) pada dinding organisme. Pewarnaan yang umum digunakan adalah
PAS atau impregnasi perak
• Chromoblastomycosis dan phaeohyphomycosis disebabkan oleh jamur berpigmen.
Kandungan pigmen yang mirip dengan melanin menunjukkan positivitas dengan
Fontana-Masson
• Cryptococcus neoformans mengandung glikoprotein kompleks pada bagian kapsul
yang terwarna dengan baik menggunakan teknik mucicarmine dan alcian blue
Teknik pewarnaan Ziehl-Neelsen adalah
pewarnaan bakteriologis khusus
Gambar : Ziehl Neelsen

Result :
Organisme BTA = merah
Organisme non BTA= biru
 *Grocott’s Mod Gomori Chromic Acid
Gambar : GMS*
Methanamine Silver Nitrat untuk pewarnaan
fungi
Result :
Fungi = hitam
 JARINGAN KONEKTIF (IKAT)

• Adalah salah satu dari empat jenis jaringan yang ditemukan dalam
tubuh
• Istilah yang berasal dari bahasa Latin 'connectere' yang berarti
mengikat
• Fungsi utamanya adalah untuk terhubung bersama dan memberikan
dukungan ke jaringan lain
• Sebagian besar jenis jaringan ikat terdiri dari tiga elemen: sel, fiber
dan substansi dasar amorf yang dihasilkan sel
Pewarnaan serat reticulin hitam gelap
(arrawhead) dengan pewarna reticulin.
Serabut kolagen berwarna cokelat (arraw),
nuklei merah dan background berwarna
abu-abu atau merah muda muda. Struktur
lingkaran putih lainnya di dekat serat
reticulin adalah gumpalan lemak (*)

Pewarnaan reticulin berguna untuk Gambar : Retikulin

menunjukkan bentuk arsitektur liver;
nekrosis hepatosit dan regenerasi
hepatosit. Result :
Retikulin = hitam
 Pewarnaan Trichrome pada jaringan fibrosa.
Sitoplasma hepatosit berwarna merah. Nuklei
dapat dilihat sebagai struktur merah gelap
sampai hitam di dalam sel. Kolagen dalam
jaringan fibrosa berwarna biru atau hijau
sangat terang.

Pewarnaan trichrome digunakan untuk menilai

Gambar : Trichrome fibrosis, yang memberikan informasi penting
tentang tahap dan perkembangan penyakit.
Hasil pewarnaan digunakan untuk membuat
keputusan treatment; digunakan untuk menilai
efek terapi, obat-obatan dalam uji klinis dan
diperlukan untuk semua spesimen biopsi hati.
 PEMBUATAN SEDIAAN HISTOKIMIA

1. Administrasi
2. Proses Potong Blok Parafin
3. Proses Deparafinasi
4. Proses Pewarnaan
 ADMINISTRASI

• Ada dua jenis alur penerimaan sampel/spesimen di laboratorium

histokimia. Pertama, jalur masuk sampel sama dengan laboratorium
histopatologi (pemeriksaan histokimia rutin) dan kedua, sampel yang
diterima berasal dari dr.Sp.PA yang meminta untuk dilakukan
pewarnaan khusus (pewarnaan lanjutan) pada jaringan yang dicurigai
setelah hasil pengamatan pewarnaan HE.
• Warna kaset yang diterima untuk pemeriksaan rutin histokimia
berbeda dengan histopatologi, biasanya berwarna hijau. Jenis
jaringan yang dimasukkan ke dalam kaset hijau yaitu: gaster, antrum
corpus, ginjal, hati, dan sum sum tulang.
Formulir permintaan pewarnaan
histokimia
 PROSES POTONG BLOK PARAFIN
• Proses potong blok parafin untuk sampel pemeriksaan histokimia sama seperti
pemeriksaan di laboratorium histopatologi, kecuali pada potong tipis blok
jaringan biopsi hati dan biopsi ginjal dimana ukuran ketebalan jaringan yang
dipotong adalah 1µm.
• Teknik potong tipis 1µm sedikit berbeda dengan teknik potong dengan ukuran
yang lebih tebal, dikarenakan hasil potongannya yang sangat tipis maka untuk
menghindari lipatan dan kerutan pada hasil potong sebelum potongan
diletakkan dalam waterbath terlebih dahulu dimasukkan dalam larutan air
biasa yang dicampur dengan larutan alkohol (air 70mL + alkohol 30mL).
• Hal ini berguna untuk membentuk potongan jaringan lebih kencang dan halus
tanpa lipatan dan kerutan kemudian angkat dan letakkan di dalam waterbath.
PROSES DEPARAFINASI

Cuci air
Xilol I mengalir
(5 menit) sampai sisa
alkohol hilang

Xilol II Alkohol 70%

(5 menit) (5 menit)

Xilol III Alkohol 96%

(5 menit) (5 menit)
 PROSES PEWARNAAN

• Ada pewarnaan rutin dan pewarnaan khusus lanjutan

tergantung atas permintaan dr.Sp.PA.
• Hasil pewarnaan histokimia berguna untuk memperkuat
penegakkan diagnosis dr.Sp.PA.
 PROSES PEWARNAAN

• Beberapa pewarnaan rutin yang dilakukan di laboratorium histokimia, yaitu:

1. Sampel gaster dan antrum corpus, pewarnaan meliputi: HE, Giemsa.
2. Sampel hati, pewarnaan meliputi: HE, Retikulin, Trichrom.
3. Sampel ginjal, pewarnaan meliputi: HE, PAS, Retikulin, Trichrom, Silver-
Trichrom.
4. Sampel sum-sum tulang, pewarnaan meliputi: HE, PAS, Retikulin, Trichrom.
5. Sedangkan pewarnaan khusus lanjutan yang biasanya dilakukan adalah Ziehl
Neelsen (BTA), Biru Berlin/Iyzer, Fontana Masson, Grocott’s Mod Gomori
Chromic Acid Methanamine Silver Nitrat (GMS).
Proses Pewarnaan Histokimia
PROSES PEWARNAAN HISTOKIMIA
PROSES PEWARNAAN HISTOKIMIA
TERIMA
KASIH