STUDI TERAPI DIABETES MELLITUS TIPE 1 PADA

TIKUS HASIL INDUKSI STREPTOZOTOCIN

TERHADAP KADAR MALONDIALDEHIDA
DAN GAMBARAN HISTOPATOLOGI
GINJAL YANG DIBERI EKSTRAK
DAUN PLETEKAN
(Ruellia tuberossa L)

SKRIPSI

Oleh
ZULFIKAR SAFRULLOH
105130101111036

Program Studi Pendidikan Dokter Hewan

Program Kedokteran Hewan
Universitas Brawijaya
Malang
2014

STUDI TERAPI DIABETES MELLITUS TIPE 1 PADA

TIKUS HASIL INDUKSI STREPTOZOTOCIN
TERHADAP KADAR MALONDIALDEHIDA
DAN GAMBARAN HISTOPATOLOGI
GINJAL YANG DIBERI EKSTRAK
DAUN PLETEKAN
(Ruellia tuberossa L)

SKRIPSI

Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar

Sarjana Kedokteran Hewan
Oleh
ZULFIKAR SAFRULLOH
105130101111036

Program Studi Pendidikan Dokter Hewan

Program Kedokteran Hewan
Universitas Brawijaya
Malang
2014

LEMBAR PERNYATAAN
Saya yang bertanda tangan di bawah ini:
Nama : Zulfikar Safrulloh
NIM :.105130101111036
Program Studi : Program Kedokteran Hewan
Penulis Skripsi berjudul:
Studi Terapi Diabetes Mellitus Tipe 1 pada Tikus Hasil Induksi
Streptozotosin terhadap Kadar Malondialdehida dan Gambaran Histopatologi
Ginjal yang Diberi Estrak Daun Pletekan (Ruellia tuberossa L)
Dengan ini menyatakan bahwa:
1. Isi dari skripsi yang saya buat adalah benar-benar karya saya sendiri dan tidak
menjiplak karya orang lain, selain nama-nama yang termaktub di isi dan tertulis di
daftar pustaka dalam skripsi ini.
2. Apabila dikemudian hari ternyata skripsi yang saya tulis terbukti hasil jiplakan,
maka saya akan bersedia menanggung segala resiko yang akan saya terima.
Demikian pernyataan ini dibuat dengan segala kesadaran.

Malang,
Desember 2014
Yang menyatakan,

( Zulfikar Safrulloh )
NIM.105130101111036

Studi Terapi Diabetes Mellitus Tipe 1 pada Tikus Hasil

Induksi Streptozotosin terhadap Kadar Malondialdehida
dan Gambaran Histopatologi Ginjal yang Diberi Estrak
Daun Pletekan (Ruellia tuberossa L)
ABSTRAK

Diabetes mellitus merupakan penyakit degeneratif yang prevalensinya

meningkat setiap tahun. Diabetes ditandai dengan hiperglikemia yang
berhubungan dengan abnormalitas metabolism karbohidrat, lemak dan protein
yang disebabkan oleh defisiensi insulin. Hiperglikemia dapat menyebabkan
terbentuknya reactive oxygen species (ROS) sehingga terbentuk biomarker
kerusakan jaringan berupa malondialdehida. Tujuan penelitian ini adalah untuk
mengetahui pengaruh terapi ekstrak daun pletekan (Ruellia tuberose) terhadap
kadar MDA dan gambaran histopatologi ginjal pada tikus model diabetes.
Penelitian ini menggunakan tikus (Rattus norvegicus) jantan strain Wistar yang
dibagi menjadi 3 kelompok yakni kelompok kontrol, kelompok hiperglikemia, dan
kelompok terapi (dosis tunggal 450 mg/kg BB). Pembuatan hiperglikemia dengan
cara induksi streptozotosin dosis rendah selama 5 hari berturut-turut secara
intraperitonial. Pemberian ekstrak pletekan dilakukan dengan cara dilarutkan
dalam minyak jagung. Gambaran histopatologi diamati secara deskriptif
menggunakan metode Hematoksilin-Eosin (HE) dan pengamatan kadar MDA
menggunakan metode Thiobarbituric Acid (TBA).

Kata kunci: Diabetes, Histopatologi ginjal, malondialdehida (MDA), Pletekan.

DAFTAR ISI
4

Halaman
HALAMAN JUDUL....................................................................................... ii
LEMBAR PERNYATAAN............................................................................. iii
ABSTRAK....................................................................................................... iv
DAFTAR ISI.................................................................................................... v
DAFTAR GAMBAR....................................................................................... vi
DAFTAR LAMPIRAN................................................................................... vii
DAFTAR ISTILAH DAN LAMBANG......................................................... viii
BAB 1 PENDAHULUAN............................................................................... 1
1.1 Latar Belakang.................................................................................. 1
1.2 Rumusan Masalah............................................................................. 4
1.3 Batasan Masalah................................................................................ 4
1.4 Tujuan Penelitian............................................................................... 5
1.5 Manfaat.............................................................................................. 6
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA...................................................................... 7
2.1 Diabetes Mellitus............................................................................... 7
2.1.1 Definisi.................................................................................... 7
2.1.2 Patofisiologi............................................................................ 8
2.2 Hewan Coba Tikus (Rattus norvegicus)............................................ 9
2.3 Pletekan (Ruellia tuberosa L)............................................................ 12
2.4 Kandungan Pletekan (Ruella tuberose L)......................................... 13
2.5 Struktur dan Fungsi Ginjal................................................................ 14
2.6 Hubungan Diabetes Mellitus dengan Kadar Malondialdehida......... 16
2.7 Histopatologi Ginjal pada Diabetes Mellitus.................................... 18
BAB 3 KERANGKA KONSEPTUAL.......................................................... 20
3.1 Kerangka Penelitian.......................................................................... 20
3.2 Hipotesis Penelitian........................................................................... 22
BAB 4 METODE PENELITIAN................................................................... 24
4.1 Waktu dan Tempat Penelitian.....................................................................
4.2 Alat dan Bahan Penelitian..........................................................................
4.2.1 Alat Penelitian.................................................................................
4.2.2 Bahan Penelitian..............................................................................
4.3 Tahapan Penelitian.....................................................................................
4.4 Prosedur Kerja...........................................................................................
4.4.1 Rancangan dan Variabel Penelitian..................................................
4.4.2 Pembuatan Ekstrak Ruellia tuberosa L............................................
4.4.3 Penentuan Kadar Glukosa Darah dengan Glukometer.....................
4.4.4 Pembuatan Larutan STZ dan Induksi pada Hewan Coba.................
4.4.5 Terapi Hewan Coba DM dengan Ekstrak Ruallia tuberose L...........
4.4.6 Pengamatan Gula Darah pada Tikus DM Terapi..............................
4.4.7 Pembedahan Hewan Coba dan Pengambilan Organ Ginjal.............
4.4.8 Pengukuran Kadar MDA (Malondialdehida)...................................
4.4.8.1 Pembuatan Kurva Standar MDA........................................
4.4.8.2 Pengukuran Kadar MDA Menggunakan Uji TBA..............
4.4.9 Pembuatan dan Pewarnaan Preparat Ginjal dengan Metode
HE..................................................................................................
4.4.10 Analisis Data..................................................................................

24
24
24
24
25
25
25
27
27
28
29
29
30
30
30
31
31
33

DAFTAR PUSTAKA...................................................................................... 34
DAFTAR GAMBAR
5

Gambar

Halaman

2.1 Tikus Putih Strain Wistar (Rattus norvegicus)............................................

2.2 Tanaman Ruellia tuberose L.......................................................................
2.3 Struktur Anatomi Ginjal.............................................................................
2.4 Glomerulus, Tubulu proksimal, Tubulus distal...........................................
2.5 Mekanisme Pembentukan MDA.................................................................
2.6 Glomerulus normal dan abnormal..............................................................
3.1 Kerangka Konseptual..................................................................................

09
13
14
15
17
19
20

DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Halaman

Skema Kerja Penelitian................................................................................

Pembuatan Senyawa Bioaktif Ekstrak Ruellia tuberose L...........................
Diagram Kerja Penelitian.............................................................................
Pewarnaan Hematoksilin-Eosin (HE)..........................................................
Pengukuran MDA........................................................................................
Penghitungan Dosis dan Pengenceran Ekstrak Pletekan.............................

DAFTAR ISTILAH DAN LAMBANG

38
39
40
42
43
44

AGE
DM
g
HE
MDA
mg/dL
mg/Kg BB
mL
mLD
OHO
ROS
STZ
TBA
UPHP
VEGR

Advanced Glycosylation End Prodects

Diabetes Mellitus
Gram
Hematoxylin-Eosin
Malondialdehida
Miligram per Desi Liter
Miligram per Kilogram Berat Badan
Mililiter
Multi Low Dose
Obat Hipoglikemik Oral
Reactive Oxygen Species
Streptozotosin
Thiobarbituric Acid
Unit PengembanganHewan Percobaan
Vascular Endothelial Growth Factor
Alfa
Beta
Mikroliter

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Diabetes mellitus (DM) merupakan salah satu penyakit degeneratif yang
prevalensinya terus meningkat setiap tahunnya. Menurut data WHO, prevalensi
DM di seluruh dunia diprediksikan meningkat dari 2.8% pada tahun 2000 menjadi
4,4% pada tahun 2030 dan jumlah tersebut diperkirakan masih akan terus
meningkat (Wild et al., 2004). Diabetes ditandai dengan meningkatnya glukosa
darah (hiperglikemia) yang disebabkan karena sel beta dalam pulau langerhans
tidak dapat menghasilkan insulin atau mengalami defisiensi insulin. Defisiensi
insulin akan menyebakan gangguan proses biokimia di dalam tubuh seperti
penurunan jumlah glukosa yang diserap oleh sel dan peningkatan pelepasan
glukosa dari hati ke sirkulasi darah (El-Soud et al., 2007).
Diabetes memicu terjadinya kelainan metabolisme karbohidrat, protein,
lemak dan dapat menyebabkan timbulnya komplikasi berupa kebutaan, penyakit
jantung iskemik, dan stroke. (Matthews, 2002). Selain pada manusia, diabetes
juga terjadi pada hewan peliharaan seperti anjing dan kucing. Dalam sebuah
penelitian di Swedia, tercatat 860 anjing menderita diabetes, 616 dari populasi
tersebut merupakan anjing betina (Fall et al., 2007). Diabetes pada anjing banyak
ditemukan pada anjing yang telah

tua disebabkan karena sel yang tidak

responsif sehingga produksi insulin tidak maksimal. Pada kucing, diabetes dapat
disebabkan oleh beberapa faktor seperti umur, kegemukan, sterilisasi dan jenis
kelamin (Hoenig, 2002).

Hiperglikemia pada diabetes mellitus dapat menyebabkan terjadinya

kenaikan radikal bebas karena proses autooksidasi. Radikal bebas membuat
membran sel menjadi rusak, menjadi lipid peroksida atau Malondialdehyde
(MDA) dan mengakibatkan kerusakan system membrane sel dan kematian sel
(Yasa dkk., 2009).
Produksi radikal bebas atau

Reactive Oxygen Species (ROS) yang

meningkat akan memicu terjadinya stres oksidatif akibat jumlah radikal bebas
dalam tubuh lebih tinggi daripada antioksidan. Stres oksidatif adalah peristiwa
dimana radikal bebas yang berupa molekul reaktif muncul melalui suatu reaksi
biokimiawi dari sel normal yang merusak membran sel dan menyebabkan
gangguan fungsi tubuh, terutama sel pankreas yang diperantarai melalui
mekanisme cellular mediated autoimmune dan disertai dengan meningkatnya
peroksidasi lipid berupa malondialdehida (MDA). Adanya MDA pada sel dapat
digunakan sebagai indikator pengkuran radikal bebas dalam tubuh (Adji, 2008).
Hiperglikemia dapat menyebabkan terjadinya komplikasi pada hati, ginjal
dan pembuluh darah. Hiperglikemia memicu terjadinya kerusakan ginjal melalui
perubahan metabolisme dan haemodinamik. Hiperglikemi akan menyebabkan
terjadinya aktivasi protein kinase C, meningkatkan produksi Advanced
glycosylation end Products (AGEs), diasilgliserol, dan meningkatkan produksi
radikal oksigen spesies (ROS) (Maitra and Abbas, 2010). Aktivasi protein kinase
C dan menempelnya AGE pada reseptor akan menyebabkan terjadinya perubahan
sinyal-sinyal intra dan interseluler sehingga menyebabkan terjadinya peningkatan
proliferasi sel-sel yang mengekspresikan vascular endothelial growth factor
(VEGFR-1) dan VEGFR-2. Proliferasi sel-sel ini menyebabkan ukuran gelung

glomerulus (glomerulus-tuft) meningkat. Peningkatan ukuran glomerulus-tuft ini

akan menyebabkan hipertrofi glomerulus dan hipertrofi ginjal secara keseluruhan
(Susilorini dkk., 2013)
Diabetes yang tidak terkontrol dapat menimbulkan komplikasi akut dan
kronis (Direktorat Bina Farmasi Komunitas dan Klinik, 2005).

Obat-obat

antidiabetik yang digunakan saat ini selain memberikan kontribusi yang besar,
juga memilik efek samping seperti hipoglikemia, peningkatan berat badan dan
ketidakmampuan untuk mencegah degenerasi pankreas atau komplikasi diabetes
yang disebabkan oleh stres oksidatif (Baynes, 1991).
Obat antidiabetik diantaranya adalah glibenclamid dan metformin.
Glibenclamid merupakan obat hipoglikemik oral (OHO) golongan sulfonylurea
yang menstimulasi sel beta pankreas untuk melepas insulin yang tersimpan. Efek
samping OHO golongan sulfonylurea umumnya ringan dan dan frekuensinya
rendah, seperti gangguan saluran cerna, gangguan susunan syaraf pusat serta
cenderung meningkatkan berat badan (Soegondo, 2004). Metformin merupakan
obatantidiabetika oral golongan biguanid dengan mekanisme kerja tidak melalui
perangsangan sekresi insulin tetapi langsung terhadap organ sasaran. Biguanid
merangsang glikolisis anaerob, dan anaerobiosis ini dapat mengakibatkan lebih
banyaknya glukosa memasuki otot (Handoko dan Suharto, 2004). Terapi ideal
diabetes sebaiknya merupakan obat yang tidak hanya memiliki efek anti
hiperglikemik, tetapi juga meningkatakan atau melindungi system pertahanan
antioksidan (Erejuwa et al., 2011).
Salah satu tanaman yang berpotensi sebagai anti diabetes adalah Ruellia
tuberosa L. (Pletekan). Ruellia tuberosa L. secara tradisional biasa digunakan

pada pengobatan diuresis, antidiabetes, antipiretik, antihipertensi dan bahan

antidote. Di Indonesia sendiri, penggunaan tanaman ini masih belum banyak
digunakan, dan lebih sering dianggap sebagai gulma, oleh karena itu perlu
dilakukan kajian ilmiah lebih lanjut untuk mengetahui aktivitas biologi atau
farmakologi tanaman ini. Ruellia tuberosa diketahui memiliki senyawa mayor
berupa flavonoid. Ruellia tuberosa juga dilaporkan memliki fungsi sebagai anti
inflamasi, antiurolitik, antioksidan dan hipoglikemik (Chwan-Fwu Lin et al.,
2006).
Berdasar latar belakang diatas, penelitian ini dilakukan untuk mengetahui
pengaruh pemberian ekstrak R.tuberosa sebagai upaya terapi Diabetes Mellitus
ditinjau dari kadar MDA dan gambaran histopatologi ginjal.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang tersebut, maka bisa dirumuskan beberapa
permasalahan yang akan dipecahkan dalam penelitian ini:
1) Apakah pemberian ekstrak daun Ruellia tuberosa L (Pletekan) dapat
menurunkan MDA (Malondialdehida) pada ginjal tikus model diabetes
mellitus yang di induksi dengan STZ?
2) Apakah pemberian ekstrak daun Ruellia tuberosa L (Pletekan) dapat mengubah
gambaran histopatologi ginjal pada tikus model diabetes mellitus yang di
induksi dengan STZ?
1.3 Batasan Masalah
Berdasar latar belakang yang telah dirumuskan di atas, penelitian ini
dibatasi pada:

1) Hewan model yang digunakan adalah tikus putih (Rattus norvegicus) jantan
strain wistar yang diperoleh dari Unit Penngembangan Hewan Percobaan
(UPHP) Universitas Gadjah Mada Yogyakarta dengan umur 2-3 bulan dengan
berat rata-rata 130-150 g. Penggunaan hewan coba sedang dalam proses
pengajuan persetujuan laik etik.
2) Pembuatan keadaan diabetes mellitus pada hewan coba dilakukan dengan cara
injeksi intraperitonial. Dosis mLD-STZ yang digunakan adalah 20 mg/kg BB
per hari selama 5 hari berturut-turut (Lukiati dkk., 2012).
3) Ekstrak pletekan disiapkan dengan cara maserasi menggunakan ekstrak
methanol, kemudian diberikan pada tikus dengan konsentrasi 450 mg/kg BB
yang dilarutkan dengan minyak jagung selama 10 hari.
4) Variabel yang diamati dalam penelitian ini adalah kadar MDA yang diukur
dengan menggunakan metode thiobarbituratacid (TBA) dan gambaran
histopatologi ginjal tikus Rattus norvegicus yang diamati secara mikroskopis
dengan perbesaran 400 kali.
1.4 Tujuan Penelitian
1) Mengetahui pengaruh pemberian ekstrak daun Ruellia tuberosa L dalam
menurunkan kadar MDA pada ginjal tikus diabetes mellitus yang diinduksi
menggunakan STZ.
2) Mengetahui pengaruh pemberian ekstrak daun Ruellia tuberosa L terhadap
gambaran histopatologi ginjal tikus diabetes mellitus yang diinduksi
menggunakan STZ.
1.5 Manfaat
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang manfaat
ekstrak Ruellia tuberosa L sebagai salah satu produk herbal alternatif penyakit
diabetes mellitus pada manusia maupun hewan, sehingga dapat digunakan sebagai
dasar pembuatan obat untuk menurunkan penurunan kadar glukosa dalam darah.

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Diabetes mellitus (DM)

2.1.1 Definisi
Diabetes merupakan penyakit metabolik yang ditandai oleh hiperglikemia
akibat adanya gangguan pada sekresi insulin, kerja insulin, atau keduanya (ADA,
2011). Menurut American Diabetes Association (2011) diabetes dapat dibedakan
menjadi DM tipe 1 (DM-1) atau insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM), DM
tipe 2 (DM-2) atau noninsulin-dependent diabetes mellitus (NIDDM), diabetes
gestational dan diabetes mellitus tipe khusus :
1) Diabetes mellitus tipe 1 (IDDM)
Diabetes tipe 1 merupakan diabetes yang disebabkan oleh proses autoimun
sel- T (autoimmune T-Cell attack) yang menghancurkan sel- sel beta pankreas
yang dalam keadaan normal menghasilkan hormon insulin, sehingga insulin
tidak terbentuk dan mengakibatkan penumpukan glukosa dalam darah. DM
tipe 1 ini sering juga disebut dengan diabetes juvenile karena sering terjadi di
usia 30 tahun ke bawah.

Pasien dengan diabetes tipe 1 membutuhkan

penyuntikan insulin untuk mengendalikan kadar glukosa darah.

2) Diabetes mellitus tipe 2 (NIDDM)
Diabetes mellitus tipe 2 adalah diabetes mellitus yang tidak tergantung
dengan insulin. Diabetes mellitus ini terjadi karena pankreas tidak dapat
menghasilkan insulin yang cukup atau tubuh tidak mampu menggunakan
insulin secara efektif sehingga terjadi kelebihan gula dalam darah. Diabetes

mellitus tipe 2 dapat terjadi pada usia pertengahan dan kebanyakan penderita
memiliki kelebihan berat badan.
3) Diabetes mellitus gestational (diabetes kehamilan)
Diabetes gestastional adalah diabetes yang terjadi pada masa kehamilan dan
mempengaruhi 4% dari semua kehamilan. Diabetes gestastional disebabkan
karena peningkatan sekresi berbagai hormon yang mempunyai efek metabolik
terhadap toleransi glukosa. Diabetes gastastional dapat hilang setelah proses
persalinan selesai
4) Diabetes mellitus tipe khusus atau tipe lain
Diabetes jenis ini disebabkan oleh faktor-faktor lain seperti pengaruh genetik
pada fungsi sel beta pankreas pada kerja insulin, penyakit pankreas eksokrin,
infeksi akibat virus, akibat penggunaan obat-obatan, dan endokrinopati.
2.1.2 Patofisiologi
Diabetes tipe 1 (IDDM) disebabkan oleh pankreas yang tidak mampu
menghasilkan insulin karena sel-sel beta pulau langerhans hancur sehingga kadar
gula dalam darah menjadi tinggi. Menurut Hussain (2002) kadar glukosa tikus
model diabetes > 300 mg/dL, sedang kadar gula normal pada tikus putih berkisar
antara 60-150 mg/dL. (Butler, 1995)
Tingginya konsentrasi glukosa dalam darah, akan menyebabkan
glukosuria dan disertai pengeluaran cairan dan elektrolit yang berlebihan (diuresis
osmotic) yang mengakibatkan pasien mengalami peningkatan jumlah urin
(poliuria) dan rasa haus yang tinggi (polidipsi) (Corwin, 2000). Defisiensi insulin
juga dapat mengganggu metabolisme protein dan lemak sehingga terjadi
penurunan berat badan yang merangsang tubuh untuk meningkatkan selera makan
(polipagi). Selain poliuri, polidipsi dan polipagi, IDDM dapat mengakibatkan
terjadinya glikogenolisis (pemecahan cadangan glukosa) dan glukoneogenesis

yang berujung pada pemecahan lemak dan peningkatan keton yang mengganggu
keseimbangan asam basa sehingga terjadi ketoasidosis (Corwin, 2000).

2.2 Hewan Coba Tikus (Rattus norvegicus) Model Diabetes Mellitus

Hewan percobaan adalah setiap hewan yang dipergunakan pada sebuah
penelitian yang dipilih berdasar syarat atau standar yang diperlukan dalam
penelitian tersebut. Tikus yang biasa digunakan dalam penelitian adalah tikus
putih strain Wistar dan Sprague-Dawley (Ridwan, 2013). Tikus putih banyak
digunakan pada penelitian-penelitian toksikologi, metabolisme lemak, obat-obatan
maupun mekanisme penyakit infeksius. Tikus putih baik digunakan dalam
penelitian karena mudah dipelihara, mudah berkembang biak sehingga cepat
mendapatkan hewan coba yang seragam dan mudah dikelola di laboratorium.
Penelitian tentang obat-obatan dan keracunan banyak menggunakan hewan coba
tikus dan mencit, karena mudah diperiksa melalui organ-organ utama yang
berperan yaitu hati dan ginjal (Leickteig, et al., 2007).

Gambar 2.1 Tikus Putih Strain Wistar (Rattus norvegicus) (Estina, 2010)
Tikus yang digunakan sebagai hewan model dalam penelitian ini adalah
jenis Rattus norvegicus strain Wistar dengan klasifikasi seperti berikut (Armitage,
2004):

Kingdom

: Animalia

Filum

: Chordata

Kelas

: Mamalia

Ordo

: Rodensia

Subordo

: Sciurognathi

Famili

: Muridae

Sub-Famili : Murinae
Genus

: Rattus

Spesies

: Rattus norvegicus

Tikus Rattus norvegicus dikembangkan di Institut Wistar pada tahun

1906 untuk kepentingan penelitian medis. Galur tikus Sprague dawley dan Longevans dikembangkan dari tikus galur wistar (Estina, 2010). Tikus Rattus
norvegicus biasa digunakan sebagai hewan percobaan karena hewan ini mudah
diperoleh dalam jumlah banyak, memiliki respon yang cepat terhadap perlakuan
yang diberikan, memberi gambaran secara ilmiah yang mungkin terjadi pada
manusia, serta harganya relatif lebih murah (Sihombing dan Tuminah, 2011).
Pembuatan hewan model diabetes mellitus dilakukan dengan pemberian
diabetogenik. Diabetogenik yang sering digunakan adalah alloxan, streptozotosin,
dithizone, 8-hidroksikuinolon dan vacor (Rees and Alcolado, 2005). Hewan yang
diberi diabetogenik akan mengalami gejala seperti glikosuria sebagai tanda telah
mengalami diabetes. Phlorizin yang di injeksikan melalui subkutan akan mengikat
transporter glukosa/Na+ dalam tubulus proksimal ginjal dan menghambat
reabsorpsi glukosa. Hal ini menyebabkan glukosa, yang secara normal saat

10

melintasi ginjal tereabsorpsi sempurna dapat lolos dan tereksresikan bersama urin
(glikosuria) (Rees and Alcolado, 2005).
Streptozotosin memiliki aktivitas anti-neoplasma dan antibiotic spectrum
luas. Strptozotosin dapat secara langsung merusak sel langerhans atau
menimbulkan proses autoimun terhadap sel sehingga lebih banyak digunakan
dalam pembuatan hewan uji DM. treptozotosin menembus sel langerhans
melalui transporter glukosa GLUT 2. Aksi STZ intraseluler akan menyebabkan
perubahan DNA pada sel pankreas. Alkilasi DNA oleh STZ mengakibatkan
kerusakan sel pankreas lewat gugus nitrosourea. Nitric Oxide (NO) berperan
terhadap kerusakan tersebut melalui peningkatan aktivitas guanili siklase dan
terbentuknya

cGMP. Pembentukan

NO

terjadi

ketika

STZ mengalami

metabolisme dalam sel sehingga membangkitkan oksigen reaktif yang berperan

dalam kerusakan sel pankreas. Pembentukan anion superoksida oleh STZ dalam
mitokondria dan peningkatan xantin oksidase menurunkan konsumsi oksigen
mitokondria. Produksi ATP mitokondria yang terbatas akan mengakibatkan
pengurangan nukleotida sel pankreas secara drastis (Szkudelski, 2001).
Aloksan merupakan senyawa hidrofilik dan tidak stabil yang diperantarai
oleh oksidasi senyawa dengan gugus SH, penghambatan glukokinase,
pembangkiran radikal bebas dan gangguan homestatis ion kalsium intraseluler
(Nugroho, 2006).

2.3 Pletekan (Ruellia Tuberossa L)

11

Ruellia tuberosa L merupakan salah satu tanaman yang sering digunakan

sebagai obat tradisional oleh masyarakat Indonesia. Ruellia tuberosa L yang
sering dikenal dengan sebutan pletekan ini

merupakan tanaman tropis yang

banyak ditemukan di Asia Tenggara. Ruellia tuberosa L memiliki tinggi 0,4-0,9

m, batang tegak berwarna hijau, dengan panjang bunga 3,5-5 cm. Daun berwarna
hijau dengan panjang 6-18 cm, lebar 3-9 cm, permukaan licin, bentuk pertulangan
daun menyirip, tepi daun bergerigi, ujung membulat dan pangkal daun meruncing
(Novi, 2012). Kelopak bunga memiliki tinggi 2-3 dan berwarna ungu. Buah
berbentuk lonjong, panjang 2-3 cm, kering, dan berbiji banyak. Biji berbetuk bulat
kecil dan berwarna coklat. Berkas akar berwarna coklat berbentuk umbi yang
memanjang (Van Steenis, 1975). Klasifikasi R.tuberosa L. yakni (Novi, 2012) :
Kingdom

: Plantae (Tumbuhan)

Subkingdom

: Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh)

Super Divisio

: Spermatophyta (Menghasilkan biji)

Divisio

: Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga)

Class

: Magnoliopsida (berkeping dua / dikotil)

Subclass

: Asteridae

Ordo

: Scrophulariales

Famili

: Acanthaceae

Genus

: Ruellia

Spesies

: Ruellia tuberosa L.

12

Gambar 2.2 Tanaman Ruellia tuberosa L (Van Steenis, 1975)

2.4 Kandungan Pletekan ( Ruellia tuberosa L)

Tanaman R. tuberosa L mengandung senyawa kimia seperti betulin, fenol
(0,43 mg/g), tannin (10 mg/g), indol-3-karboksilat, asam vanilat dan senyawa
golongan flavonoid seperti malvidin, apigenin, antosianidin,

kirsimaritin,

kirsimarin, kirsiliol 4-glikosida, sorbifolin dan pedalitin ( Manikandan dan Doss,

2010 ; Chwan-Fwu Lin et al.,, 2006). Menurut Shahwar (2011) ekstrak etanol
daun pletekan (100 mg/Kg berat badan) mengandung fraksi etil asetat dengan
aktivitas hipoglikemi yang sangat tinggi, dan fraksi n-heksan dari eksrak etanol
(150 mg/Kg berat badan) juga memiliki aktivitas hipoglikemi. Studi fitokimia
pada fraksi etil asetat menunjukkan bahwa terdapat senyawa triterpenoid dan
flavonoid, dan pada fraksi n-heksan terdapat senyawa fitosterol pada R.tuberosa.
Kandungan nutrisi pada ekstrak 50% hidroetanol daun R.tuberosa L.
yaitu asam askorbat (0,44), likopen (0,896), karotenoid (0,046), tokoferol
(0,187mg/g), lemak (1,32), protein (4,3), karbohidrat (56,4) serat (2,7), dan kadar
air (5,2%). Kandungan mineral yakni kadar abu 6.2% (Manikandan dan Doss,
2010)

13

2.5 Struktur dan Fungsi Ginjal

Ginjal merupakan salah satu organ eksresi

yang berbentuk seperti

kacang, berwarna coklat kemerahan dan terletak di rongga retroperitoneal bagian

posterior dari abdomen. Permukaan ginjal bagian luar halus dan licin, diselubungi
oleh capsula yang dilingkupi oleh fascia gerota dan jaringan lemak perinefrik.
Pada sisi medial ginjal terdapat cekungan yang disebut hilus yang dilewati oleh
arteri dan vena renalis, nodul limfatikus, dan ureter (Drake et al., 2010).

Gambar 2.3 Struktur Anatomi Ginjal (Drake et al., 2010)

Ginjal yang dipotong secara memanjang akan memperlihatkan dua
daerah yang berbeda warnanya. Daerah perifer yang berwarna gelap disebut
korteks, dan daerah yang berwarna lebih terang disebut medulla dengan bentuk
pyramid terbalik. Pada bagian medula berwarna lebih cerah dan tampak adanya
jalur-jalur yang disebabkan oleh buluh-buluh kemih yang lurus dan pembuluh
darahnya (Hartono, 1992). Darah dari tubuh yang mengalir menuju ginjal
normalnya sekitar 22% dari jantung. Arteri renalis memasuki ginjal melewati
hilum dan menuju ke kapiler glomerulus. Ujung distal kapiler pada setiap
glomerulus menyatu membentuk arteriol eferen yang menuju ke kapiler
peritubular yang mengelilingi tubulus ginjal (Guyton dan Hall, 2006)

14

Fungsi utama ginjal dibagi menjadi dua, yakni fungsi eksresi dan
nonsekresi. Fungsi eksresi yakni mempertahankan pH plasma, mempertahankan
osmolalitas plasma, jalur ekstretori sebagian besar obat, mengeksresikan produk
akhir nitrogen, mempertahankan volume cairan ekstraseluler dan tekanan darah,
serta mempertahankan konsentrasi plasma masing-masing elektrolit individu.
Sedangkan fungsi noneksresi berfungsi untuk mensintesis dan mengaktifkan
hormone seperti rennin, insulin, glucagon, prolaktin, dan mendegradasi hormone
polipeptida.
Secara histologis, ginjal terdiri dari tiga unsur utama yaitu (1)
glomerulus, merupakan gelung pembuluh darah kapiler yang masuk melalui arteri
aferen, (2) Tubuli sebagai parenkim yang bekerja bersama glomerulus membentuk
nefron, suatu unit fungsional terkecil dari ginjal, dan (3) Interstisium yang
merupakan pembuluh-pembuluh darah, limfe dan syaraf (Nabib, 1987; Junquiera
dan Carneiro, 2007).

Gambar 2.4 Glomerulus (G), Tubulus Proksimal (P), Tubulus Distal (D)
(Junqueira, 2007)
Epitel ginjal adalah bagian yang sensitif terhadap bahan-bahan toksik.
Kerusakan pada ginjal dapat terjadi apabila bahan toksik masuk melalui aliran

15

darah dan menyebabkan perubahan pada ginjal berupa cloudy swelling, degenerasi
hyaline, degenerasi lemak, dan nekrosa. Tingkat perubahan organ ginjal tersebut
tergantung dari sifat toksik (Smith and Hunt, 1974).

2.6 Hubungan Diabetes Mellitus dengan Kadar Malodialdehid (MDA)

Malondialdehidaa (MDA) merupakan senyawa organik dan termasuk
dalam golongan senyawa aldehida yang sangat reaktif dan dapat bersifat toksik.
MDA dapat bersifat mutagenik bagi sel manusia karena menyebabkan modifikasi
struktur DNA (Niedernhofer et al., 2003). Malondialdehida dalam sel dihasilkan
dari proses peroksidasi lipid oleh radikal bebas dan biosintesis prostalglandin.
Meningkatnya kadar malondialdehida dipengaruhi oleh peningkatan produksi
ROS sehingga MDA digunakan sebagai salah satu marker untuk mengetahui stres
oksidatif dalam sel (Bruch and Janet, 2002).
Diabetes mellitus yang tidak dikontrol dengan baik dapat menyebabkan
stres oksidatif, dimana produksi radikal bebas (oksidan) yang melebihi
kemampuan antioksidan tubuh untuk meredamnya. Sumber stres oksidasi pada
diabetes diantaranya perpindahan keseimbangan reaksi redoks karena perubahan
metabolisme karbohidrat dan lipid yang akan meningkatkan pembentukan ROS
dari reaksi glikasi dan oksidasi lipid sehingga menurunkan sistem pertahanan
antioksidan (Widowati, 2008). ROS akan meningkatkan pembentukan ekspresi
Tumour necrosis factor- (TNF-) dan memperparah stres oksidatif. TNF- dapat
mengakibatkan resistensi insulin melalui penurunan autofosforilasi (autophosphorylation) dari reseptor insulin, perubahan reseptor insulin substrat1
menjadi inhibitor insuline receptor tyrosine kinase activity, penurunan insuline-

16

sensitive glucose transporter (GLUT-4), meningkatkan sirkulasi asam lemak,

merubah fungsi sel , meningkatkan kadar trigliserida dan menurunkan kadar
HDL (Nugroho, 2006).
Stres oksidatif pada penderita diabetes akan meningkatkan pembentukan
ROS di dalam mitokondria yang akan mengakibatkan berbagai kerusakan
oksidatif berupa komplikasi diabetes dan akan memperparah kondisi penderita
diabetes. Jumlah radikal bebas yang berlebih mengakibatkan peningkatan proses
peroksidasi lipid sehingga produksi MDA juga meningkat. Oleh karena itu,
kelompok tikus sakit

mengalami peningkatan kadar MDA (Nugroho, 2006).

Menurut Aulanniam dkk (2013) mekanisme pembentukan MDA melalui

peroksidasi lipid diawali dengan penghilangan atom hidrogen dari molekul lipid
tak jenuh rantai panjang oleh gugus radikal hidroksil, sehingga lipid bersifat
radikal. Kemudian radikal lipid ini bereaksi dengan atom oksigen membentuk
radikal peroksil, yang selanjutnya menghasilkan MDA (dengan ikatan tak jenuh
lebih dari tiga).

Gambar 2.5 Mekanisme Pembentukan MDA (Aulanniam, 2013)

17

2.7 Histopatologi Ginjal pada Diabetes Mellitus

Diabetes merupakan suatu keadaan gangguan metabolism karbohidrat
yang dapat menyebabkan komplikasi berupa kerusakan terhadap organ-organ
tertentu seperti jantung, otak, pembuluh darah dan ginjal. Kerusakan pembuluh
darah kecil (mikroangiopati) pada ginjal dapat menyebabkan terjadinya nefropati
diabetic. Nefropati diabetik (ND) merupakan komplikasi penyakit diabetes
mellitus yang termasuk dalam komplikasi mikrovaskular, yaitu komplikasi yang
terjadi pada pembuluh darah halus (kecil). Hal ini dikarenakan terjadi kerusakan
pada pembuluh darah halus di ginjal. Kerusakan pembuluh darah menimbulkan
kerusakan glomerulus yang berfungsi sebagai penyaring darah dan menjadi
glomerulosklerosis. Tingginya kadar gula dalam darah akan membuat struktur
ginjal berubah sehingga fungsinya juga terganggu. Dalam keadaan normal protein
tidak tersaring dan tidak melewati glomerolus karena ukuran protein yang besar
tidak dapat melewati lubang-lubang glomerulus yang kecil. Namun, karena
kerusakan glomerolus, protein (albumin) dapat melewati glomerolus sehingga
dapat ditemukan dalam urin yang disebut dengan mikroalbuminuria (Ritz et al.,
1996).
Mikroalbuminaria disebabkan oleh peningkatan aliran albumin pada
kapiler glomerulus karena terjadi perubahan struktur endotel glomerulus akibat
disfungsi endotel. Sel endotel menghasilkan beberapa proteoglikan, hyaluronan
dan kondroitin sulfat yang berperan dalam menjaga selektifitas muatan listrik
pada

membran

filtrasi

glomerulus.

Penurunan

produksi

heparin-sulfat

proteoglikan dapat menyebabkan terjadinya perubahan fungsi membran filtrasi

glomerulus, hipertropi glomerulus, penebalan membrane basal glomerulus,

18

(Brownlee, 2001). Meningkatnya stres oksidatif akan menyebabkan terjadinya

perubahan histopatologi jaringan ginjal tikus baik pada glomerulus maupun
tubulus. Secara umum, perubahan yang ditemukan pada glomerulus berupa
hipertrofi sel-sel pada glomerulus yang mengakibatkan terjadinya penyempitan
pada urinary space dan pada tubulus berupa kerusakan sel epitel tubulus sehingga
batas antara tubulus yang tampak tidak jelas, serta adanya nekrosis pada inti sel
tubulus yang ditandai dengan inti sel piknotik. Kumar dalam Sulistiyowati (2013)
mengatakan

bahwa glomerulus dalam keadaan normal secara keseluruhan

tertutup oleh kapsula bowman yang berbentuk mangkok dan dilapisi oleh
endotelium berlubang berpori-pori yang terletak pada membrana basalis dan
dibagian luar membrana basalis adalah sel epitel viseral (podosit).

Gambar 2.6 (a) Glomerulus normal, (b) Glomerulus abnormal

(Sulistyowati, 2013)

BAB 3 KERANGKA KONSEPTUAL

3.1 Kerangka Penelitian

Tikus

Streptozotocin

Ekstrak pletekan

ROS

Kerusakan sel pankreas

Stres Oksidatif

Sintesis dan sekresi insulin

Peroksidasi Lipid

Glukosa darah

MDA

Mikroangiopati ginjal

Perubahan glomerulus
Gambar 3.1 Kerangka Kerja Penelitian
Keterangan :
Induksi streptozotocin

Terapi ekstrak pletekan :

Aktivitas meningkat

Aktivitas menurun

Menghambat

Variabel bebas

Variabel tergantung

20

21

Diabetes adalah penyakit metabolik yang ditandai dengan hiperglikemia.

Hiperglikemia adalah kondisi dimana kadar glukosa dalam tubuh lebih tinggi dari
batas normal. Hiperglikemia secara normal terjadi akibat gangguan sel pankreas
atau terganggunya reseptor sel insulin. Pembuatan hiperglikemia secara buatan
dapat dilakukan dengan memberikan zat diabetogenik seperti STZ. STZ
merupakan senyawa yang dapat membangkitkan radikal bebas (ROS) dalam
tubuh. Timbulnya radikal bebas (ROS) yang tinggi dalam tubuh akan memicu
terjadinya gangguan pada sel pankreas, sehingga terjadi penghambatan sekresi
dan sintesis insulin yang menyebabkan tikus model mengalami diabetes mellitus
tipe 1. Tikus model diabetes mellitus tipe 1 akan menghasilkan kadar glukosa
yang tinggi dan memicu terjadinya gangguan mikrovaskuler (kerusakan pada
pembuluh darah kecil) pada beberapa organ seperti ginjal sehingga ginjal
mengalami mikroangiopati (penyempitan pembuluh darah).
Mikroangipati pada ginjal akan menyebabkan terjadinya perubahan pada
glomerulus. Perubahan terjadi pada membran basalis glomerulus dengan
proliferasi

dari

sel-sel

mesangium.

Keadaan

ini

akan

menyebabkan

glomerulosklerosis dan berkurangnya aliran darah, sehingga terjadi perubahanperubahan pada permeabilitas membran basalis glomerulus. Selain itu perubahan
yang ditemukan pada glomerulus berupa hipertrofi sel-sel pada glomerulus yang
mengakibatkan terjadinya penyempitan pada urinary space dan pada tubulus
berupa kerusakan sel epitel tubulus sehingga batas antara tubulus yang tampak
tidak jelas, serta adanya nekrosis pada inti sel tubulus yang ditandai dengan inti
sel piknotik. Peningkatan kadar radikal bebas akan mengakibatkan stres oksidatif
dan memicu proses peroksidasi lipd sehingga menghasilkan MDA.

22

Ekstrak yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak pletekan

(Ruallia tuberose L.) yang mengandung senyawa flavonoid. Flavonoid merupakan
bahan aktif yang memiliki fungsi sebagai antioksidan, antiinflamasi dan
antihiperlipidemi. Senyawa polifenol terutama flavanoid diduga berperan dalam
penghambatan peroksidasi lipid karena senyawa tersebut memiliki kemampuan
menangkap radikal bebas. Flavonoid mendonasikan sebuah atom (H) dari gugus
hidroksil (OH) fenolik pada saat bereaksi dengan radikal bebas.
Kemampuan flavonoid sebagai antioksidan disebabkan karena flavonoid
bertindak sebagai scavenger radikal bebas. Menurut Aulanniam (2012)
Berdasarkan struktur kimia flavonoid sebagai scavenger radikal bebas. Terjadi
abstraksi atom hidrogen sebagai radikal bebas sehingga dapat menghasilkan
radikal fenoksil flavonoid yang memiliki reaktifitas lebih rendah. Radikal fenoksil
flavonoid dapat diserang kembali sehingga terbentuk fenoksil flavonoid kedua.
Radikal fenoksil flavonoid memiliki ikatan rangkap terkonjugasi sehingga dapat
menstabilkan strukturnya dengan delokalisasi electron ataupun resonansi untuk
menghilangkan efek radikal bebas

3.2 Hipotesis Penelitian

Berdasar rumusan masalah di yang telah ada,

hipotesis yang dapat

diajukan adalah:
1. Terapi ekstrak daun pletekan (Ruellia tuberose L) dapat menurunkan kadar
malondialdehida (MDA) pada tikus Rattus norvegicus diabetes mellitus.
2. Pemberian ekstrak daun pletekan (Ruellia tuberose L) dapat memperbaiki
kondisi glomerulus ginjal pada tikus Rattus norvegicus diabetes mellitus
yang diamati berdasarkan histopatologinya.

23

BAB 4 METODE PENELITIAN

4.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan Agustus 2014 - selesai di
Laboratorium Biokimia dan Laboratorium Biologi Molekuler Jurusan Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Brawijaya, Malang.
4.2 Alat dan Bahan Penlitian
4.2.1. Alat Penelitian
Peralatan yang dipergunakan dalam penelitian ini, antara lain bak
pemeliharaan hewan coba, seperangkat alat bedah, gelas objek, gelas kimia (50
mL, 250 mL, 500 mL, 1000 mL), labu takar (10 mL, 100 mL, 500 mL, 1000 mL),
pipet tetes, gelas ukur 100 mL, pengaduk kaca, mikro pipet (10 L, 20 L, 200
L, 1000 L), rak tabung reaksi, penangas air, waterbath, stirer, eppendorf, tabung
polipropilen, lemari pendingin, pH meter digital, penjepit, seperangkat alat
sentrifugasi, inkubator, vortex, spektrofotometri UV, mikroskop cahaya,
autoclave, stirer, plastik klip, blue tip, yellow tip, sarung tangan, oven, spuit.
4.2.2. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih (Rattus
norvegicus), minyak jagung, PBS-Azida, PFA 37%, KCl, KH2PO4, NaCl,
Na2HPO4.H2O, NaOH, PBS-Tween : PMSF (Poly Methyl Sulfonyl Fluoride) 1:9,
pasir kwarsa, Etanol 70%, Etanol 80%, Etanol 90%, Etanol 95%, air hangat,
obyek glass, Tris-HCl, kasein, tirosin, buffer fosfat pH 7, parafin, akuades steril,
Tri Chloro acetic Acid (TCA), Na-Thio 1%, PFA 4%, alkohol 70%,

24

25

alkohol 80%, alkohol 90%, alkohol 95%, larutan PBS, PFA 4%, 3% H2O2, Fetal
Bovine Serum (FBS), Mayer Hematoxylen, Eosin, Entellan, dan Xylol, larutan
baku MDA.
4.3. Tahapan Penelitian
Skema kerja pada penelitian ini dapat dilihat dengan tahapan penelitian
sebagai berikut :
1. Rancangan penelitian dan persiapan hewan coba
2. Pembuatan ekstrak Ruellia tuberossa L
4. Penentuan kadar glukosa darah dengan glukometer
5. Persiapan larutan Strepzotocin (STZ) dan injeksi intraperitonial (IP) pada
hewan coba
6. Terapi hewan coba dengan ekstrak Ruellia tuberossa L secara oral
7. Pengamatan gula darah pada tikus DM terapi
8. Pembedahan hewan coba dan isolasi organ ginjal.
9. Pembuatan dan pengamatan preparat histopatologi ginjal
10. Pengukuran kadar MDA
11. Analisis data
4.4 Prosedur Kerja
4.4.1 Rancangan dan Variabel Penelitian
Penelitian ini bersifat eksperimental menggunakan Rancangan Acak
Lengkap (RAL). Tikus putih jantan (Rattus norvegicus) strain wistar yang
digunakan mempunyai berat badan 130-150 g dengan umur 2,5 bulan
sebanyak 18 ekor. Hewan coba dibagi menjadi tiga kelompok perlakuan,
yaitu kelompok (I) tikus kontrol negatif yaitu kelompok tikus tanpa perlakuan

26

kelompok (II) tikus kontrol positif yaitu kelompok tikus diabetes mellitus 1
tanpa diberi terapi ekstrak pletekan, dan kelompok (III) tikus diabetes
mellitus 1 diterapi ekstrak pletekan dengan dosis 450 mg/ Kg BB. Masing
masing kelompok perlakuan terdiri dari enam ekor tikus sebagai ulangan.
Adapun variabel yang diamati dalam penelitian ini adalah :
Variabel bebas

: Induksi streptozotocin dan terapi ekstrak metanol

batang dan daun pletekan

Variabel tergantung

: Kadar malondialdehida dan histopatologi ginjal

Variabel kendali

: Berat badan tikus, umur tikus, dan jenis kelamin

tikus, suhu, pakan.

Penelitian ini digunakan adalah 3 kelompok perlakuan, sehingga jumlah
sampel tikus masing-masing kelompok dapat dihitung berdasarkan rumus
(Notoatmojo, 2002):
n=( 15+ p ) : p
Keterangan: n = jumlah sampel, dan p = kelompok perlakuan. Tiap kelompok
digunakan 6 tikus. Adapun ketiga kelompok perlakuan yaitu:
1. Kelompok I, kelompok kontrol tikus normal
2. Kelompok II, kelompok tikus DM, diinjeksi MLD-STZ dosis 20 mg/Kg
B.B sebanyak 5 kali yang dilakukan berturut-turut
3. Kelompok III, kelompok tikus DM dengan treatment ekstrak metanol
batang dan daun pletekan dosis 450 mg/Kg B.B./hari selama 10 hari.
Pada penyiapan hewan coba, tikus yang digunakan mempunyai berat badan
130-150 g dengan umur 2,5 bulan sebanyak 18 ekor yang dibagi dalam tiga
kelompok. Kondisi tikus dalam keadaan sehat yang ditandai oleh gerakan
aktif, dan mata cemerlang. Tikus dipelihara dalam kandang di laboratorium

27

Biologi Molekuler. Kandang diberi alas agar kandang tidak lembab. Sebelum
percobaan, tikus diaklimatisasi selama 1 minggu. Selama percobaan, tikus
ditangani sesuai etical guidelines yang dikeluarkan oleh komite etik.
4.4.2 Pembuatan ekstrak Ruellia tuberossa L
Diambil 4 pucuk daun teratas beserta batang pletekan yang diperoleh
di sekitar kecamatan Lawang-Malang, kemudian diidentifikasi di jurusan
Biologi Universitas Brawijaya. Daun dibersihkan, setelah itu dikeringkan
pada suhu ruang dengan menghindari panas matahari langsung (dried in
shade) selama 5 hari atau sampai kering. Daun pletekan yang telah kering
kemudian diblender untuk memperkecil ukurannya.
Serbuk pletekan kering ( 500 g) diekstraksi menggunakan pelarut
metanol (3 L x 3) selama 72 jam. Ekstrak metanol dipekatkan menggunakan
rotary evaporator pada tekanan rendah. Ekstrak metanol pekat ditimbang dan
dicatat. Ekstrak metanol kental dilarutkan dalam air dan dipartisi dengan nheksan (1:1) menggunakan corong pisah. Fraksi n-heksan diambil, dipekatkan
dengan vakum rotary evaporator dan di catat beratnya. Kandungan betulin
dari fraksi n-heksan di konfirmasi dengan LC-MS. Ekstrak kental dari fraksi
n-heksan dapat disimpan pada botol coklat pada temperature 4C untuk
pengujian selanjutnya.

4.4.3 Penentuan kadar glukosa darah dengan glukometer

Proses pengukuran kadar glukosa darah dilakukan sebanyak 3x, yaitu
sebelum injeksi Multiple Low Dose-Streptozotocin (MLD-STZ) sebagai data
kadar glukosa darah awal, setelah injeksi MLD-STZ bagi kelompok tikus DM

28

(B) dan DM-terapi (C) sebagai data glukosa darah untuk memastikan bahwa
hewan coba telah mengalami DM, setelah terapi ekstrak Ruelia tuberossa L,
atau sebelum pembedahan sebagai data kadar glukosa akhir. Darah tikus putih
yang akan diukur glukosa darahnya didapat dari pemotongan ujung ekor
(vena lateralis). Pengukuran glukosa darah mengggunakan kit glucometer.
Alat di set kodenya sesuai dengan kode glucostick yang digunakan,
selanjutnya darah yang didapatkan diteteskan pada stick yang terhubung
dengan glucometer dibiarkan selama 60 detik dan dibaca skala yang terlihat
pada layar, skala pengukuran yang terbaca dalam satuan mg/dL. Pengukuran
glukosa darah dilakukan setelah tikus dipuasakan 12 jam. Uji dilakukan pada
hari ke-0, hari ke-1, hari ke-5 dan hari ke- 10 selama periode terapi.
4.4.4 Pembuatan larutan Strepzotocin (STZ) dan induksi pada hewan
coba.
Streptozotocin (STZ) sebanyak 100 mg dilarutkan pada 3 ml buffer
sitrat pH 4.5 kemudian divortex hingga homogen. Larutan STZ stok disimpan
pada suhu 4C. Larutan STZ stok digunakan untuk injeksi dengan dosis
volume pengambilan yang disesuaikan dengan berat badan tikus. Campuran
larutan dimasukkan dalam tabung eppendorf dan siap untuk diinjeksikan.
Digunakan dosis 20 mg/kg BB sebanyak 5 kali yang dilakukan
berturut-turut. Tikus diposisikan menghadap kearah ventral hingga terlihat
bagian abdomenya. Pada bagian atas abdomen tikus disemprot dengan
ethanol 70%, kulit dicubit hingga terasa bagian ototnya, spuit dimasukkan
pada bagian abdomen dan dicoba digerakkan, apabila terasa berat maka sudah
masuk pada daerah intraperitonial. Setelah yakin pada daerah intraperitonial

29

maka STZ segera dimasukkan secara perlahan. Selanjutnya abdomen tikus di

semprot dengan etanol 70% kembali. Setelah dilakukan injeksi 5 hari
berturut-turut, dilakukan inkubasi selama 7-14 hari dalam kandang, dan
dilakukan pengukuran kadar glukosa darah setelah injeksi. Tikus dinyatakan
DM apabila kadar glukosa darahnya diatas 200 mg/dL.
4.4.5 Terapi hewan coba DM dengan ekstrak Ruellia tuberossa L
Setelah kelompok tikus kelompok II, dan III dinyatakan DM, maka
tikus diterapi. Tikus kelompok I dan II diberi minyak jagung sebanyak 2 ml.
Tikus DM kelompok III diterapi dengan fraksi n-heksan ekstrak metanol
sebanyak 2 ml (dengan dosis 450mg / Kg BB) yang telah dilarutkan dengan
minyak jagung selama 10 hari (10 hari berturut-turut dosis tunggal).
Pemberian terapi dilakukan dengan cara oral (sonde). Volume agen terapi
yang diinjeksikan sebanyak 2 ml berdasarkan ukuran rata-rata lambung tikus
putih.
4.4.6 Pengamatan gula darah pada tikus DM terapi
Pengukuran gula darah dilakukan untuk mengetahui perkembangan
gula darah pada tikus DM terapi dengan cara pemotongan ujung ekor (vena
lateralis). Pengukuran glukosa darah mengggunakan kit glucometer. Alat di
set kodenya sesuai dengan kode glucostick yang diguanakan,selanjutnya
darah yang didapatkan diteteskan pada stick yang terhubung dengan
glucometer dibiarkan selama 60 detik dan dibaca skala yang terlihat pada
layar, skala pengukuran yang terbaca dalam satuan mg/dL.

4.4.7 Pembedahan hewan coba dan pengambilan organ ginjal

30

Sebelum dilakukan pembedahan tikus dibunuh dengan cara dislokasi

leher. Skalpel dan alat bedah disiapkan untuk membantu mengambil organ
usus. Setelah tikus mati, hewan coba diletakkan pada nampan bedah dan ditata
pada posisi ventral diatas. Diambil ginjal kemudian dicuci dengan NaCl
fisiologis dan direndam dalam PBS-azida dan diberi label kemudian disimpan
dalam suhu 4oC.
4.4.8 Pengukuran Kadar MDA (Malondialdehida)
4.4.8.1 Pembuatan Kurva STandar MDA
Larutan stok MDA dengan konsentrasi 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 dan 8 g/ml
masing-masing diambil 100 L, dimasukkan dalam tabung reaksi yang
berbeda. Setelah itu ditambahkan 550 l aquades. Masing-masing tabung
yang berisi 650 l larutan standar ditambahkan 100 l TCA 100%, 250 L
HCl 1 N dan 100 L Na-Thio 1%, kemudian dihomogenkan dengan vortex
mixer, setelah itu disentrifugasi dengan kecepatan 500 rpm selama 10 menit
dan dihasilkan supernatan dan homogenat. Supernatan diambil lalu diinkubasi
dengan penangas air dengan suhu 100C selama 30 menit kemudian
didinginkan pada suhu ruang. Selanjutnya MDA dengan konsentrasi 4 g/ml
diukur absorbansinya pada range panjang gelombang 500-600 nm untuk
menentukan panjang gelombang maksimum MDA. Kemudian dibuat kurva
standar MDA dengan dibaca absorbansinya pada variasi konsentrasi (1, 2, 3,
4, 5, 6, 7 dan 8 g/ml) pada panjang gelombang maksimumnya (Amin, dkk.,
2009).
4.4.8.2 Pengukuran Kadar MDA Menggunakan Uji Thiobarbituric Acid
(TBA)

31

Jaringan ginjal dari setiap kelompok masing-masing diambil sebanyak

0,1 g dipotong kecil-kecil lalu digerus dalam mortar dingin yang diletakkan
di atas balok es. Ditambahkan 1 ml NaCl 0,9%, kemudian homogenat
dipindah ke dalam microtube dan disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm
selama 20 menit dan diambil supernatannya. Setelah itu diambil 100 L
supernatan bronkus ditambah 550 L akuades. Lalu ditambahkan 100 L
TCA, 250 L HCl 1N, dan 100 L Na-Thio. Setiap penambahan reagen
larutan dihomogenkan dengan vortex. Sentrifugasi dilakukan kembali dengan
kecepatan 500 rpm selama 15 menit, setelah itu supernatan dipisahkan dan
dipindahkan pada microtube baru. Kemudian larutan diinkubasi dalam
waterbath pada suhu 100C selama 30 menit, selanjutnya dibiarkan pada suhu
ruang. Sampel diukur absorbansinya pada max (532 nm) untuk uji TBA dan
diplotkan pada kurva standar yang telah dibuat untuk menghitung konsentrasi
sampel (Amin, dkk., 2009).
4.4.9 Pembuatan dan Pewarnaan Preparat Ginjal dengan Metode HE
Fiksasi dilakukan untuk mencegah kerusakan pada jaringan,
menghentikan proses metabolisme, mengawetkan komponen sitologi dan
histologi, dan mengeraskan materi yang lunak agar jaringan dapat diwarnai.
Fiksasi dilakukan dengan cara memasukkan jaringan dalam larutan PFA 4%.
Dehidrasi dilakukan untuk mengeluarkan air dari jaringan agar
jaringan tersebut dapat diisi oleh parafin sehingga jaringan dapat diiris tipis.
Proses dehidrasi menggunakan alkohol bertingkat mulai dari 70%, 80%, 90%,
95% dan 100%.

32

Tahap penjernihan dilakukan mulai pemindahan jaringan dari alkohol

absolut III ke larutan penjernihan yaitu xylol I (1 jam), xylol II, dan Xylol III
(30 menit pada suhu kamar dan 30 menit pada inkubator). Proses infiltrasi
kemudian dilakukan dalam parafin cair yang ditempatkan dalam inkubator
bersuhu 58-60C (Junquiera dan Carneiro, 2007).
Embedding dilakukan dengan cetakan yang didalamnya diisi paraffin
cair, setelah membeku cetakan tersebut dipotong-potong dan ditempelkan
pada blok kayu. Blok tersebut dipasang pada mikrotom dan diatur agar
posisinya sejajar dengan posisi pisau. Blok parafin dipotong dengan ketebalan
4 m. Awal pemotongan dilakukan trimming karena jaringan yang terpotong
masih belum sempurna. Sediaan disimpan pada inkubator dengan suhu 37C
selama semalam lalu siap diwarnai dengan HE.
Pewarnaan HE dilakukan dengan menggunakan zat pewarna
hematoksilin untuk memberi warna pada inti sel dan memberi warna biru
(basofilik). Eosin yang merupakan counterstaining hematoksilin untuk
memulas sitoplasma sel dan jaringan penyambung dan memberi warna merah
muda. Diawali dengan proses deparafinasi dengan menggunakan xylol lalu
dilanjutkan dengan proses rehidrasi dengan menggunkan alkohol absolut I, II
dan III masing-masing 3 menit, alkohol 95%, 90%, 80% dan 70% secara
berurutan selama 3 menit. Sediaan dicuci dengan air mengalir selama 10
menit dan dilanjutkan dengan air akuades selama 5 menit. Sediaan diwarnai
dengan pewarna hematoksilin selama 1 menit, kemudian dicuci dengan air
mengalir selama 10 menit dan air akuades selama 5 menit. Sediaan kemudian
dapat diwarnai dengan pewarna eosin selama 5 menit dan dicuci kembali

33

dengan air mengalir selama 10 menit dan air akuades selama 5 menit. Setelah
sediaan terwarnai dilakukan dehidrasi dengan alkohol bertingkat 70%, 80%,
90% dan 95% masing-masing selama beberapa detik lalu dilanjutkan dengan
alkohol proses clearing dengan xylol I, II dan III selama 3 menit kemudian
dikering anginkan, selanjutnya dilakukan mounting (perekatan) dengan
entellan (Suntoro, 1983).
4.4.10 Analisa Data
Pada percobaan ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL)
yang mana tikus diberi enam perlakuan dan masing masing perlakuan dengan
tiga ulangan. Analisa data histopatologi dilakukan secara kualitatif deksriptif
sedangkan

untuk

kadar

MDA dilakukan

secara

kuantitatif

dengan

menggunakan ANOVA dan apabila terdapat perbedaan perlakuan nyata, maka

perbedaan nilai tengah diuji dengan pembandingan berganda uji Tukey atau
Beda Nyata Jujur (BNJ) = 5%.