No Dokumen

INSTRUKSI
KERJA

IK-LKI-PR.HPLC-01
Tanggal Terbit
06 Februari 2015

PENENTUAN KADAR PARASETAMOL DAN

KAFEIN
DENGAN TEKNIK HPLC

Revisi :
00

Hal: 1 dari
6

1. Tujuan
1.1 Mahasiswa memahami cara kerja instrumen HPLC
1.2 Mahasiswa dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat , serta
dapat mengikuti manual pengoperasian HPLC.
1.3 Mahasiswa dapat menentukan/menghitung kadar parasetamol dan
kafein dalam sampel obat.
2. Pelaksana
Dosen pengampu mata kuliah praktikum.
Penanggung jawab instrument
Operator instrument
Mahasiswa Praktikan
3. Prinsip Dasar
Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair-cair, yang dapat
digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif.
Analisis

kuantitatif

dengan

teknik

HPLC

didasarkan

pada

pengukuran

luas/area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas/area

standar. Pada prakteknya, pembandingan
akurat

bila

hanya

melibatkan

satu

kurang menghasilkan data yang

standar.

Oleh

karena

itu,

maka

pembandingaan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi.

Parasetamol dan kafein pada umumnya terdapat bersama sama dalam
satu tablet obat yang memiliki sifat kepolaran berbeda. Gugus kromofor yang
dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karaktersitik
senyawa ini memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom
nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar campuran beberapa pelarut.
4. Alat dan Bahan
4.1
Alat
Perangkat HPLC
Lumpang & alu
Spatula
Labu ukur 25 mL dan 10 mL (6 buah)
Neraca analitik terkalibrasi
Corong pendek
Pipet tetes
Gelas kimia 500 mL

No Dokumen

INSTRUKSI
KERJA

IK-LKI-PR.HPLC-01
Tanggal Terbit
06 Februari 2015

PENENTUAN KADAR PARASETAMOL DAN

KAFEIN
DENGAN TEKNIK HPLC

Revisi :
00

Hal: 2 dari
6

Ultrasonic vibrator

4.2
Bahan
Parasetamol p.a
Kafein
Asetonitril, KH2PO4 dan iso propil alkohol
Sampel obat
Aquades
Membran PTFE/selulosa nitrat
Kertas saring
5. Langkah Kerja
5.1
Pembuatan fasa gerak (Pelarut).
Sebanyak 420 mL KH2PO4- 0,01 M, ditambahkan metanol 20 mL,
ditambahkan asetonitril 30 mL, ditambahkan isopropil alkohol 30 mL,
disaring

menggunakan

membran

whatman

filter

PTFE

0,2

m,

disonikasi selama 30 menit.

5.2 Pembuatan larutan induk parasetamol
Ditimbang seksama sejumlah 25 mg Parasetamol p.a dan 12,5

mg kafein p.a dimasukkan kedalam labu 50 mL

Tambahkan pelarut sebanyak 20 mL, disonikasi selama 15

menit, diencerkan dengan pelarut hingga garis tanda batas.

Lakukan penyaringan dengan membran dan sonikasi.
Hitunglah konsentrasi larutan induk untuk parasetamol dan
kafein

5.3 Pembuatan deret larutan standar parasetamol

Pipet

larutan

induk

parasetamol

dan

kafein

masing-masing

sebanyak 1 ; 2 ; 3 ; 4 ;5 dan 6 mL, masukkan ke dalam labu ukur 10

mL.

Tambahkan pelarut hingga tanda batas

Saring masing-masing larutan dengan membran whatman PTFE 0,2

m, pindahkan ke botol vial

Lakukan sonikasi selama 5 menit.

No Dokumen

INSTRUKSI
KERJA

IK-LKI-PR.HPLC-01
Tanggal Terbit
06 Februari 2015

PENENTUAN KADAR PARASETAMOL DAN

KAFEIN
DENGAN TEKNIK HPLC

Revisi :
00

Hal: 3 dari
6

Injeksikan ke sistem HPLC dengan volume penyuntikan 20 l

Selanjutnya dibuat kurva kalibrasi

5.4. Pembuatan larutan sampel parasetamol

Timbanglah 20 tablet catat hasilnya tentukan berat rerata tablet
Geruslah seluruh tablet dalam lumpang serta alu hingga homogen.
Ambillah sejumlah 25 mg, dimasukkan kedalam labu ukur 25 mL,

ditambahkan 1 mL pelarut, disonikasi selama 10 menit,

Encerkan dengan pelarut hingga garis tanda dikocok lalu disaring
melalui penyaringan kering (buanglah 1 mL filtrat pertama dan

ditampung filtrat selanjutnya).

Pipet 1 mL sampel yang telah disaring masukkan ke dalam labu ukur

10 mL , tambahkan pelarut hingga garis tanda

Saringlah dengan membran whatman PTFE 0,2 m atau lalu disonikasi

selama 5 menit.
Injeksikan sampel L ke dalam HPLC.

5.5.
Penyiapan Instrumen HPLC
Kondisi Analisis parasetamol dan kafein
Fasa gerak
: KH2PO4 0,01 M 420mL, 20 ml metanol, 30
asetonitril 30 mL isopropil alkohol
Kolom (fasa diam)
: C-18 (15 cm)
Panjang gelombang
: 215 nm
Laju alir
: 1 mL/menit
Volume injeksi
: 20 L
Pastikan kabel penghubung listrik telah tersambung dengan benar.
Tekan tombol ON pada sakelar listrik.
Isi botol fasa gerak dengan volume yang memadai dan kosongkan
botol penampung.
Tekan tombol ON pada alat, berturut-turut untuk power, detektor dan
pompa.
Lakukan pemrograman alat dengan computer.Ikuti langkahnya sesuai
instruksi dalam komputer.
Pilihlah mode yang akan digunakan sesuai dengan parameter kondisi
instrumen.
Alirkan fasa gerak.
Apabila respon kromatogram tidak muncul lagi, artinya alat telah
menunjukkan base line yang mendatar, maka instrumen siap
digunakan.

No Dokumen

INSTRUKSI
KERJA

IK-LKI-PR.HPLC-01
Tanggal Terbit
06 Februari 2015

PENENTUAN KADAR PARASETAMOL DAN

KAFEIN
DENGAN TEKNIK HPLC

Revisi :
00

Hal: 4 dari
6

Injeksikan berturut-turut larutan standar (mulai dari konsentrasi

terendah), dan terakhir larutan sampel
Cetak hasil pengukuran, catat kondisi percobaannya.
Setelah selesai digunakan, matikan pompa dengan menyoroti tanda
pompa dalam computer.
Tutup file sesuai petunjuk, lalu matikan computer.
Untuk mematikan, tekan tombol Of pada pompa, detector dan power
secara berurutan. Putuskan sambungan listrik.

5.6.
Perhitungan hasil analisis
Dari hasil operasi instrumen akan diperoleh kurva kalibrasi. Bila kurva
kalibrasi diperoleh dengan koefisien regresi > 0,997 anda boleh
melanjutkan perhitungan kadar parasetamol dalam sampel. Hitunglah
kadarnya dalam satuan % b/b. Bila tidak diperoleh kurva yang linier,
maka lakukan diskusi untuk mencari penyebabnya.
6. Rekaman Mutu
6.1. CM-LKI-PR-05-01
6.2. CM LKI-PR-04-04
6.3. CM-LKI-PR-04-03
7. Dokumen terkait
7.1. Manual instrument HPLC
7.2. Buku sumber :