Uji kualitatif dan kuantitaif vitamin B12 (sianokobalamin)Sianokobalamin,

C63H88O14N14Pco, merupakan senyawakompleks dengan kordinat kobalt berberat molekul

1355,4. Kristal vitaminB12 cepat menyerab lembab udara. Sianokobalamin bersifat netral
danmengandung gugus sian. Gugus ini dapat diganti dengan berbagai ionuntuk menghasilkan
senyawa baru seperti klorokobalamin danhidroksokobalamin. Bila sianokobalamin
dihidrolisis dengan asam makaakan menghasilkan 5,6-dimetilbenzimdazol. Metode
penetapan kadarvitamin (sianokobalamin)

Metode spektrofotometri B12Sianokobalamin dalam air menunjukkan absorbansi maksimun

( maks) pada 278 1nm, 361 nm dan 550 2 nm. Metode
spektrofotometri tidak spesifik untuk sianokobalamina karena
senyawa bewarna merah dan pseudosiokobalamin menunjukkanspektra absorbansi yang
serupa. Metode yang paling sederhana adalahdengan menetapkan pada 550 nm, tetapi metode
ini hanya dapatdigunakan terhadap sianokobalamin yang bebas senyawa pengganggu.Metode
yang lebih peka ialah dengan melakukan penetapan
pada panjang gelombang 361 nm. Prosedur penetapan kadarsianokobalamin secara
spekrofotometri:Lebih kurang 2 mg sianokobalamin yang ditimbang saksama,dilarutkan
dalam akuades secukupnya dan diencerkan hingga 50,0mL. Larutan diukur absorbansinya
dengan kuvet 1 cm pada panjanggelombang 361 nm. Harga E1cm1% pada 361 nm
adalah 207.

Metode kromatografiMetode KCKT telah sukses digunakan untuk pemisahan dananalisis

kuantitatif vitamin B1, B2, dan campuran-campurannya
dalam bebagai macam bahan makanan. Berbagai macam isomer vitaminB12(sianokobalamin
) yang ada dalam berbagai macam susu juga
telah dipisahkan dengan menggunakan metode KCKT fase terbalik .
Sianokobalamin diekstraksi dari sampel dengan mencampur 25mL susu
dengan 2-4 mL HCL 0,1 M pH 4,6. Campuran dipanaskan pada suhu 1200C
selama 10 menit dan selanjtnya disaring. pH filtratdiatur 5,5 dengan
natrium hidroksida 0,1 M dan diencerkan denganakuades sampai 50mL.
Sianokobalamin selanjutnya dipekatkan padacartridge oktadesil silan yang
telah dikondisikan dengan 2 mLasetonitril dan dicuci dengan 6 mL
akuades. Filtrat selanjutnyadilewatkan melalui cartridge dan selanjutnya
cartridge dicuci dengan12 mL air. Sianokobalamain dengan asetonitril:
iar(1:1 v/v) dandipisahkan dengan kolom oktil silika. Elusi gradien dimulai
denganasetonitril: larutan amonium fosfat pH 3,0 (5:95) lalu
konsentrasiasetonitril ditingkatkan samapi 30% selama 16 menit.
Konsentrasivitamin B12 selanjutnya dengan metode radioassay