Isolation and Characterization of Collagen and Antioxidant Collagen Peptides from

Scales of Croceine Croaker (Pseudosciaena crocea)

Sisik Ikan Croaker Kuning (Pseudosciaena crocea) Mengandung Peptida Kolagen Sebagai
Antioksidan yang Mampu Menangkal Radikal Bebas, Obat untuk Penyakit Stres, dan untuk
Mengurangi Oksidasi Makanan Selama Penyimpanan.

Pendahuluan
Oksidasi biomolekul telah diidentifikasi sebagai proses yang disebabkan radikal
bebas, yang menghasilkan banyak dampak yang tidak menguntungkan pada makanan dan
sistem biologis. Generasi radikal bebas yang tidak terkontrol menyebabkan malapetaka dalam
sistem biologis dengan merusak semua kelompok utama biomolekul (DNA, protein, lipid dan
molekul seluler kecil), yang pada gilirannya menyebabkan jantung dan penyakit
neurodegenerative. Dalam makanan, rasa tengik dan terdapatnya senyawa kimia yang tidak
diinginkan adalah hasil oksidasi yang disebabkan radikal bebas dari asam lemak dan lipid.
Selain itu, oksidasi lipid makanan menyebabkan penurunan kualitas makanan dan
memperpendek masa simpan. Oleh karena itu, antioksidan berperan penting pada sistem
makanan serta dalam tubuh manusia untuk mengurangi proses oksidasi. Saat ini, butylated
hydroxytoluene (BHT) dan butylated hydroxyanisole (BHA) secara luas digunakan sebagai
antioksidan untuk mengurangi kerusakan yang disebabkan oleh radikal bebas. Namun,
kemungkinan toksisitas dan juga penolakan konsumen pada umumnya menyebabkan
penurunan penggunaan antioksidan sintetis ini. Oleh karena itu, muncul keinginan untuk
mengidentifikasi antioksidan dari sumber alami termasuk beberapa makanan yang
mengandung protein.
Dilaporkan bahwa protein memiliki aktivitas antioksidan yang signifikan karena bisa
menonaktifkan ROS, mengikat radikal bebas, mengurangi hidroperoksida, dan secara
enzimatik menghilangkan oksida spesifik. Kolagen adalah protein utama jaringan ikat pada
hewan dan protein yang paling melimpah di mamalia, yaitu sekitar 30% dari total protein
dalam tubuh hewan. Saat ini, kolagen dan peptida kolagen telah banyak dimanfaatkan sebagai
bahan tambahan makanan, kosmetik, bahan biomedis dan farmasi karena biocompatibilitiesnya yang sangat baik. Baru-baru ini, olahan produk ikan, seperti kulit, tulang, sisik dan sirip,
digunakan sebagai alternatif pengganti dari kulit binatang darat untuk menyediakan kolagen

karena ketersediaannya yang tinggi, dan tidak adanya resiko penularan penyakit dan masalah
agama.
Sekitar 49.000 ton sisik per tahun, yang merupakan sekitar dua persen dari berat ikan,
dihasilkan selama proses pembuangan sisik ikan. Sisik ikan terdiri dari protein jaringan ikat,
kolagen, ditutupi dengan garam kalsium. Jumlah protein berkisar antara 41% sampai 84%
dan sisanya adalah kalsium fosfat dan kalsium karbonat. Kolagen dan peptida kolagen dari
sisik ikan Croaker Kuning dapat diperoleh dengan cara isolasi menggunakan tes radikal dan
uji lipid penghambatan peroksida.
Sisik dari ikan Croaker Kuning mengandung kolagen 20,33 gram, protein tinggi 93,56
gram, kadar air rendah 4,52 gram, dan lemak 0,43 gram. Komposisi asam amino dalam
kolagen dari sisik ikan Croaker Kuning (ASC-C) dan kolagen tipe I dari kulit sapi (CSC)
ditunjukkan pada Tabel 1. ASC-C memiliki Gly sebagai asam amino paling banyak (347,1
residu). Kandungan rendah di Cys (3,2 residu), sedangkan Trp tidak terdeteksi. Gly adalah
asam amino yang paling dominan dalam kolagen.
Tabel 1. Komposisi asam amino ASC-C dan CSC (residu/1000 residu).

Kandungan asam amino dari ASC-C adalah 189,4 residu, yang mirip dengan kolagen dari
sisik ikan mas (192 residu) dan ikan sarden (197 residu).
Hubungan antara Aktivitas Antioksidan dan Komposisi Asam Amino Peptida:
Dalam tes, empat jenis tes radikal dan peroksidasi lipid uji inhibisi digunakan untuk
mengevaluasi aktivitas antioksidan ACH-P1, P2-ACH, dan ACH-P3.
a. Hydroxyl Radical Scavenging Activity
b. DPPH Radical Scavenging Activity
c. Superoxide Anion Radical Scavenging Activity
d. ABTS Radical Scavenging Activity

Hidrolisis enzimatik merupakan salah satu cara efektif untuk mendapatkan peptida
antioksidan dari sumber protein. Selama hidrolisis, berbagai peptida yang lebih kecil
dihasilkan, tergantung pada spesifikasi enzim dan waktu hidrolisis. Perubahan ukuran, tingkat
dan komposisi asam amino bebas mempengaruhi kegiatan antioksidan peptida.
Dalam tes, ACH-P1, P2-ACH, dan ACH-P3, terutama ACH-P3, menunjukkan
aktivitas antioksidan yang baik pada tes radikal dan uji penghambatan peroksidasi lipid, dan
hasilnya terlihat dengan temuan umum bahwa peptida pendek dengan 2-10 asam amino
diberikan potensi antioksidan yang lebih besar dan sifat bioaktif lainnya yang lebih besar
daripada induk protein asli mereka atau polipeptida besar. Penemuan ini diharapkan untuk
sebuah kemungkinan lebih tinggi dari molekul antioksidan yang lebih kecil untuk
berinteraksi lebih efektif dengan radikal bebas dan menghambat siklus propagasi peroksidasi
lipid.
Penelitian
Siapkan ikan Croaker Kuning beku (Pseudosciaena crocea) dengan berat tubuh ratarata 300-350 gram. Untuk mempersiapkan sisik guna ekstraksi kolagen, sampel ikan beku
dicairkan dengan air keran sampai suhu ikan mencapai 10C. Sisik dilepas secara manual
dengan pisau fillet, dicuci dengan air dingin dan disimpan pada -20C sebelum mengekstraksi
kolagen.
Semua prosedur persiapan dilakukan pada suhu 4C. Untuk membuang protein nonkolagen, sisik yang sudah siap dicampur 0,1 M NaOH dalam wadah dan dimasukkan larutan
alkali dengan perbandingan 1:10 dan diaduk selama 6 jam menggunakan pengaduk mekanik
dengan kecepatan 300 rpm. Larutan alkali diganti setiap 3 jam. Kemudian sisik dicuci dengan
air dingin sampai pH netral. Kemudian sisik demineralisasi secara terus-menerus diaduk
dengan 20 volume air keran dingin selama 10 menit dan pencucian dilakukan sebanyak 3
kali.
Kemudian sisik direndam dalam asam asetat 0,5 M dengan perbandingan pelarut 1:15
selama 48 jam dengan pengadukan secara terus menerus. Campuran disaring dengan dua
lapisan kain tipis. Kolagen pada filtrat diendapkan dengan menambahkan NaCl ke
konsentrasi akhir 2,5 M pada 0,05 M Tris (hidroksimetil) aminomethane, pH 7,0. Resultan
endapan dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 20.000g pada 4C selama 60 menit
menggunakan centrifuge dingin CR21G. Pelet dilarutkan dalam volume minimal 0,5 M asam
asetat dan didialisis dengan 25 volume asam asetat 0,1 M selama 12 jam. Setelah itu,

didialisis dengan 25 volume air suling selama 48 jam. Dialisat yang dihasilkan berbentuk
beku-kering dan disebut sebagai "acid soluble collagen (kolagen larut asam), ASC", dan ASC
dari sisik ikan Croaker Kuning disebut sebagai ASC-C.
Kolagen adalah protein yang di dalamnya terdapat zat antioksidan. Peptida Kolagen
adalah zat antioksidan tersebut. Untuk mendapatkannya, Peptida Kolagen harus dipisah
(isolasi) dari kolagen sisik ikan Croaker Kuning. Isolasi Peptida Kolagen dari ASC-C adalah
sebagai berikut:
a. Hidrolisis double-enzim dan penyusunan hidolisat ASC-C (ACH)
b. Fraksinasi ACH dengan filtrasi ultra
c. Kromatografi filtrasi gel ACH-III
d. Isolasi peptida dari ACH-III-3 dengan RP-HPLC
Kolagen larut asam/acid soluble collagen (ASC) dari sisik ikan Croaker Kuning
(ASC-C) berhasil dipisahkan (isolasi) dengan hasil 0,37% (0,08% berat kering). Hidrolisat
antioksidan ASC-C (ACH) dibuat melalui dua tahap pencernaan in vitro (4-h tripsin diikuti
oleh 4-h pepsin), dan tiga peptida antioksidan (ACH-P1, ACH-P2, dan ACH-P3) yang
diisolasi dari ACH menggunakan filtrasi ultra, kromatografi gel, dan RP-HPLC, dan urutan
asam aminonya diidentifikasi sebagai ACH-P1, ACH-P2, dan ACH-P3. ACH-P1, ACH-P2,
dan ACH-P3 menunjukkan aktivitas penangkalan yang baik pada radikal hidroksil, radikal
DPHH, radikal superoksida, dan radikal ABTS. Peptida kolagen ini dapat digunakan sebagai
antioksidan untuk terapi penyakit yang berhubungan dengan stres oksidatif, atau mengurangi
perubahan oksidatif selama penyimpanan.
Kesimpulan
Dalam penelitian ini, kolagen larut asam/acid soluble collagen (ASC) dari sisik ikan
Croaker Kuning (ASC-C) berhasil dipisahkan (isolasi) dengan hasil 0,37% (0,08% berat
kering). ASC-C secara lebih lanjut dihidrolisis dengan menggunakan enzim ganda (tripsin +
pepsin), dan tiga peptida antioksidan (ACH-P1, ACH-P2, dan ACH-P3) yang dipisahkan dari
ACH dengan filtrasi ultra, kromatografi gel, dan RP-HPLC, dan urutannya diidentifikasi
sebagai ACH-P1, ACH-P2, dan ACH-P3. Tiga peptida antioksidan menunjukkan aktivitas
penangkalan radikal secara baik dan kemampuan menghambat autooksidasi pada sistem
model asam linoleat. Penelitian ini mungkin berkontribusi terhadap dasar rasional untuk
penerapan peptida kolagen sebagai bahan yang cocok sebagai fungsional makanan/obat untuk

terapi penyakit yang berhubungan dengan stres oksidatif, atau sebagai bahan fungsional
dalam sistem pangan untuk mengurangi perubahan oksidatif selama penyimpanan.