ASAM ASKORBAT

Oksigen sangat penting bagi kelangsungan hidup makhluk hidup. Sekitar 5% oksigen dari bagian yang dihirup akan dikonversikan menjadi spesies oksigen reaktif (ROS), seperti [O2-]- dan H2O2 melalui reduksi bervalensi. ROS juga dapat diproduksi melalui paparan sinar matahari, sinar X, polusi, asap tembakau, dan reaksi fisiologis lainnya. Kehadiran elektron yang tidak berpasangan di orbit luar yang sangat reaktif dan tidak stabil ini berpotensi untuk merusak asam nukleat, protein, dan lipid sehingga dapat mempengaruhi fungsi kekebalan tubuh dan menyebabkan penyakit degeneratif. Antioksidan dikenal sebagai penangkal radikal bebas dan mengurangi resiko yang diakibatkan oleh ROS. Pada tingkat seluler dan molekuler, antioksidan dapat menginaktifkan ROS atau menghambat reaksi oksidasi. Antioksidan terkandung dalam berbagai makanan seperti buah-buahan, sayuran, dan biji-bijian. Antioksidan dapat dibagi menjadi antioksidan sintetik dan antioksidan alami. Pada antioksidan alami diklasifikasikan menjadi in vitro dan in vivo. Sedangkan menurut fungsinya antioksidan alami ini dibagi menjadi empat, yaitu antioksidan preventif yang menghambat radikal bebas, antioksidan yang menekan rantai inisiasi, antioksidan yang menghentikan propagasi rantai peroksida, dan antioksidan adaptasi. Di alam, tersedia banyak antioksidan alami. Diantara nya yaitu karotenoid, tokoferol, asam laktat, polifenol, flavonoid, fenol, dan asam askorbat. Asam askorbat atau yang dikenal dengan vitamin C terdiri dari cincin lactone 6karbon dengan 2,3-enediol. Asam askorbat adalah antioksidan dominan yang memiliki efek anti kanker. Asam askorbat akan berubah menjadi asam semi-dehidroaskorbic dengan melepas satu hidrogen dan elektron, kemudian diikuti oleh konversi menjadi asam Ldehydroascrobic dengan melepas atom hidrogen kedua. Asam L-askorbat dan asam Ldehidroaskorbat inilah yang mempertahankan aktifitas vitamin C. Asam askorbat dapat mengurangi kerusakan oksidatif. Pada kasus radikal bebas akibat rokok, asam askorbat menginduksi stres oksidatif dari berbagai senyawa radikal bebas dalam fase gas sehingga memberikan efek antioksidan lebih baik pada non-perokok daripada perokok. Selain itu asam askorbat merupakan penentu penting redoks intraseluler dan mempercepat dekomposisi Snitrosoglutathione (GSNO), yaitu suatu adisi endogen nitrat okside (NO).

Gambar1. (4.1) asam askorbat (4.2) asam semi-dehydroascorbic (4.3) radikal semidehydroaskorbat (4.2) asam dehidroaskorbic

Asam askorbat merupakan antioksidan larut air yang penting bagi kesehatan. Seperti diungkap di referernsi harian AS bahwa terjadi peningkatan konsumsi asam askorbat sebanyak 75 mg/d untuk perempuan, 90 mg/d untuk laki-laki dan direkomendasikan tambahan 35 mg/d untuk perokok. Dari kebutuhan akan vitamin C inilah perlu diadakan nya pengukuran terhadap kandungan asam askorbat pada beberapa buah dan sayur. Salah satu metode yang digunakan untuk mengukur asam askorbat adalah metode FRASC (Ferric Reducing-antioxidant power and Ascorbic acid). FRASC merupakan modifikasi dari metode uji FRAP. Melalui metode FRASC, dapat diketahui jumlah asam askorbat dan aktivitas antioksidan lainnya dalam beberapa buah dan sayur segar. Dalam metode FRASC, terdapat 17 varietas buah dan sayur yang diuji. Untuk setiap jenis digunakan 3 sampel dan setiap sampel akan diuji sebanyak tiga kali. Ekstrak buah dan sayur dipersiapkan dengan menghomogenkan 5g buah dan sayur segar yang telah dicuci ke 100ml air distilasi selama 30menit. Larutan homogen difiltrasi. Selanjutnya, konsentrasi antioksidan total dan asam askorbat dihitung tiga kali. Hasil dari uji ini ditunjukkan pada tabel berikut.

Tabel1. Antioksidan total dan asam askorbat dalam ekstrak cair buah-buahan

Tabel2. Antioksidan total dan asam askorbat dalam ekstrak sayuran dalam air dan buffer asetat (pH 3,6)

Dari tabel di atas, dapat diketahui kadar asam askorbat berkisar antara 1-73% dalam buah-buahan dan 1-59% dalam sayuran. Berdasarkan tabel, stroberi kaya akan kandungan asam askorbat dan antioksidannya. Buah kiwi mengandung asam askorbat terbanyak diantara buah lainnya. Sedangkan pada uji untuk sayuran, choy sum (sayur cina berdaun hijau yang mirip dengan kangkung) mengandung antioksidan tertinggi dan selada mengandung antioksidan terendah. Terdapat asam askorbat yang cukup signifikan pada bunga kol, pada beberapa sayur cina (choy shum, pak choy, wombok) dan daun bawang. Selain itu, hasil uji pada sayuran menunjukkan bahwa ekstrak dalam asam lebih tinggi dibandingkan ekstrak dalam air. Selain menggunakan metode FRASC untuk menganalisis asam askorbat, dapat juga digunakan metode yang lain. Bahan yang digunakan adalah jeruk varietas valencia dan buah plum segar. Bahan dipotong dan dihaluskan, ditimbang sebanyak 1 gram kemudian diekstraksi dengan 10ml pelarut (air suling, 96% etil alkohol dan aseton) selama 1 jam pada suhu kamar. Ekstrak yang telah diperoleh disaring dan dianalisis pada beberapa variabel. Setiap sampel ditentukan kandungan vitamin C nya dan dievaluasi aktivitas antioksidannya menggunakan metode DPPH radikal bebas. Untuk menentukan kandungan vitamin C, digunakan metode idiometrik. Kuantifikasi vitamin C dilakukan sesuai relasi : 1ml 0,1N potasium dikromate ekuivalen dengan 0,008806g vitamin. Penentuan vitamin C dilakukan sebanyak tiga kali kemudian hasilnya dijumlah dan dirata-rata. Sedangkan untuk menentukan aktivitas antioksidan digunakan metode DPPH menggunakan 1mM larutan DPPH (2,2diphenyl-1-picrylhydrazyl) dalam etanol 96%, aseton, dan air suling. Kemudian diukur absorbansi nya menggunakan spektrofotometer. Untuk mengukur kecepatan aktivitas antioksidan ditentukan dengan rasio antara konsentrasi DPPH dan fungsi waktu yang ditulis ke dalam persamaan : v = c/t . Apabila kecepatan reaksi dari ekstrak yang dianalisis lebih besar, maka aktivitas antioksidan nya lebih baik. Hasil dari uji tersebut dapat dilihat pada tabel berikut. Dapat dilihat bahwa kedua bahan kaya akan vitamin C. Kandungan vitamin C pada jeruk varietas valencia lebih tinggi dibandingkan kandungan vitamin C pada plum. Konsentrasi asam askorbat terbanyak ditunjukkan oleh ekstrak jeruk dalam aseton (52,84 mg/100ml) dan konsentrasi asam askorbat terendah terdapat pada ekstrak jeruk dalam alkohol.

Tabel3. Kandungan vitamin C pada jeruk dan buah plum Untuk hasil pada analisis aktivitas antioksidan, dapat dilihat pada tabel berikut. Pada ekstrak jeruk dalam aseton, yang memiliki kandungan asam askorbat terbanyak, aktivitas antioksidannya tertinggi (v= 3,886 M/s). Sedangkan ekstrak jeruk dalam alkohol memiliki aktivitas antioksidan terendah (v= 2,007 M/s). Dari uji di atas dapat disimpulkan bahwa kandungan asam askorbat berbanding lurus terhadap aktivitas antioksidan dari suatu bahan.

Tabel4. Kecepatan rata-rata DPPH pada sampel yang dianalisis Cara lain untuk mengukur asam askorbat dalam suatu bahan adalah menggunakan metode penentuan spektofotometri. Metode ini dapat diaplikasikan untuk menentukan asam askorbat dalam buah, minuman dan obat-obatan. Peralatan yang digunakan adalah VISspectrophotomete tipe-106 yang berfungsi untuk mengukur absorbansi dan pH meter model 331 yang berfungsi untuk mengukur pH. Bahan yang digunakan adalah reagen analitik. Stok zat terlarut standar yang segar mengandung 1000g/ml asam askorbat dipersiapkan dengan cara pelarutan asam askorbat dalam air distilasi dua kali dalam termos volumetrik 1 liter. Zat terlarut dipersiapkan dengan pengenceran stok zat terlarut secara tepat. Kemudian dipersiapkan 100g/ml larutan stok tembaga dengan cara melarutkan CuSO4 dalam 0,01M H2SO4 dan disimpan dalam botol PVC. 30g/ml larutan tembaga dipersiapkan dengan mengencerkan larutan stok. Larutan 0.1%, w/v 2,9-dimethyl-1,10-phenathroline (neucoproine) dipersiapkan dalam 90%, v/v ethyl alcohol. Larutan buffer dengan pH 8 digunakan untuk pengukuran pH. Larutan 0.2%, w/v N-phenylbenzimidoylthiourea (PBITU) dalam kloroform digunakan untuk ekstraksi Cu+ (neucoproine) kompleks. Prosedur yang dilakukan adalah sebagai berikut, larutan standar yang mengandung 1,0-4,0 g/ml asam askorbat diletakkan dalam corong pisah 125ml, ditambahkan 2ml larutan

buffer dan 1 ml larutan neucoproine. Setelah itu fase cair dilarutkan dalam 10ml air distilasi. Selanjutnya larutan kompleks di ekstraksi kloroform selama 2 menit. Warna dari ekstrak diukur absorbansinya dan konsentrasi asam askorbat dievaluasi dengan kurva kalibrasi. Untuk menentukan asam askorbat dalam buah, bahan yang digunakan adalah 5g dari masingmasing beberapa sampel buah seperti jeruk, lemon, mangga, apel. Sari buah nya dipisahkan menggunakan press mekanik dan disentrifuge. Sari buah disaring menggunakan kertas saring nomor 41 dan larutan dibuat sesuai dengan asam askorbat yang terdapat dalam sampel. Untuk menentukan asam askorbat dalam minuman, seperti pepsi, coca cola, limpca dan mirinda yang mengandung karbonat, dikelurkan gasnya terlebih dahulu. 1 ml sampel cukup untuk menentukan asam askorbat. Sedangkan untuk menentukan asam askorbat dalam obat, 0,5g tablet atau kapsul yang mengandung asam askorbat ditimbang, dihaluskan menjadi serbuk dan dilarutkan dalam 50 ml air distilasi kemudian diaduk selama 2-3menit. Lalu disaring menggunakan kertas saring Whatmann no.41.selanjutnya, 1ml larutan sampel dianalisis asam askorbat nya. Hasil dari analisis asam askorbat menggunakan metode spektofotometri dapat dilihat dalam tabel berikut.

Tabel5. Kandungan asam askorbat dalam buah

Tabel6. Kandungan asam askorbat dalam obat

Tabel7. Kandungan asam askorbat dalam minuman Metode spektofotometri ini merupakan metode yang sederhana, selektif, cepat, dan dapat digunakan untuk metode rutin. Metode ini dapat digunakan untuk analisis asam askorbat dalam buah, minuman, dan produk-produk farmasi. Metode ini juga bebas dari gangguan yang terdapat pada sampel. Batas deteksi asam askorbat dalam metode ini adalah 40g/L. Selain pada buah,sayur, minuman dan obat-obatan, vitamin C juga terkandung pada ikan dan udang. Vitamin C berperan untuk pembentukan tulang rawan dan tulang dan meningkatkan ketahananan ikan terhadap stres dan penyakit menular. Untuk menentukan asam askorbat pada organisme laut dilakukan analisis Liquid Chromatography (LC) dengan deteksi kimia dan standardisasi internal menggunakan isoascorbic acid (IAA). Reagen yang digunakan antara lain asam askorbat, asam isoaskorbat (IAA), dehydroascrobic acid (DHAA), dan Dodecyltriethylammonium phosphate (DTAP). Sampel yang digunakan adalah organisme laut yaitu Artemia larvae dan Brachionus, beberapa species ikan (turbot, Europan sea bass, dan milkfish), dan postlarva udang putih. Sampel diekstraksi dengan cara sebagai berikut, 100mg sampel dihomogenisasi pada 1,5ml dengan pengekstraki Potter-Elvehjem tube atau Polytron mixer. Ekstraktan yang digunakan adalah 5% MPA-0,54mM EDTA, 1% Hac-0,1% MPA-1mM EDTA, 1% Hac-1mM EDTA, 2mM homocystein-1mM EDTA dan air-metanol (70:30) yang mengandung 0,7mM EDTA. IAA ditambahkan sebagai standar internal. Setelah disentrifugasi selama 2 menit, supernatan diisolasi dan residu di homogenisasi kembali dalam 1,5ml ekstraktan. Campuran disentrifugasi selama 5 menit dan dilewatkan pada Bond Elut C 1 8 cartdridge. Apabila larutan akhir yang diperoleh keruh, maka disaring dengan filter. Untuk menentukan asam askorbat, sampel diambil dan

dikeringkan pada suhu 60oC selama 24jam di wadah alumunium dan didinginkan dalam dessicator, kemudian ditimbang kembali dan kadar air nya dihitung. Selanjutnya,asam askorbat dianalisi menggunakan sistem HPLC. Dengan metode Liquid Chromatography (LC) menggunakan sistem HPLC, dapat diketahui bahwa asam askorbat dan dehydroascrobic acid (DHAA) terkandung dalam Artemia, Brachionus, beberapa spesies ikan (turbot, European sea bass, dan milkfish), dan postlarva udang putih.