Tanggal

Praktikum
Praktikum

23,April 2014
IDENTIFIKASI
MIKROORGANISME

DAN

KARAKTERISASI

1. Sebutkan dan jelaskan jenis-jenis metode identifikasi mikroorganisme!

a) Identifikasi bakteri dapat dilakukan secara FENOTIPIK (morfologi, fisiologi,
biokimia) dan GENOTIPIK. Identifikasi secara fenotipik hanya dapat dilakukan
untuk bakteri yang dapat dikulturkan (culturable), sedangkan identifikasi genotipik
dapat dilakukan untuk bakteri yang dapat maupun tidak dapat dikulturkan
(unculturable).
b) Morfologi koloni bakteri meliputi bentuk, warna dan bau koloni dapat digunakan
untuk identifikasi bakteri patogen tumbuhan. Pigmen yang dihasilkan merupakan
hal penting dalam identifikasi awal bakteri.
c) Morfologi sel. Bakteri patogen tumbuhan umumnya gram negatif dengan bentuk
batang. Namun adapula yang gram positif dengan bentuk filamen.
d) Karakteriasi fisiologi. Beberapa uji fisiologi yang dilakukan adalah kemampuan
tumbuh pada kisaran suhu tertentu (40 atau 37C),
e) Karakterisasi biokimia dapat menguji ekspresi genetik dari bakteri pada media uji,
misalnya sumber C dan N, sifat oksidatif/fermentatif (OF), LOPAT, dan produksi
enzim tertentu.
f) Identifikasi secara genotipik tekniknya sama dengan deteksi dengan molekuler,
yaitu menggunakan PCR seperti rep-PCR, BOX PCR, Nested PCR, RFLP, RAPD,
AFLP, dsb. Masing-masing teknik PCR ini memiliki kespesifikan tersendiri. Untuk
identifikasi yang lebih akurat dapat digunakan primer spesifik dan perunutan DNA
(DNA sequencing). Semakin miripan sekuen DNA berarti semakin dekat hubungan
kekerabatannya (tingkat keakuratan identifikasi).( Pelczar,2005)

2. Sebutkan tahapan pewarnaan dalam pengecatan Gram, beserta reagen yang

digunakan dan fungsinya!

Langkah-langkah utama dalam teknik pewarnaan gram antara lain:

Pewarnaan gram pada praktikum ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu:
a. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
b. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin.
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
Reagen-reagen yang digunakan dalam pengecatan gram adalah:
1. Larutan violet kristal hucker sebagai cat utama yang akan diikat oleh peptidoglikan
bakteri = Gram A
2. Iodin sebagai mordan untuk mengintensifkan cat utama = Gram B
3. Ethanol 95% sebagai bahan peluntur untukk melunturkan cat utama = Gram C
4. Safranin sebagai cat penutup untuk mewarnai kembali sel-sel yang sudah kehilangan
warna cat utamanya = Gram D
(lay,2004)

3. Apa yang dimaksud dengan Bakteri Gram (-) dan Gram (+) ? Jelaskan dan
beri contoh (masing-masing 2 bakteri)!

Bakteri Gram-positif adalah bakteri yang Mempertahankan zat warna kristal violet sewaktu
proses pewarnaan Gram sehingga akan berwarna biru atau ungu di
bawah mikroskop.Bakteri gram positif seperti Staphylococcusaureus (bakteri patogen yang
umum pada manusia) hanya mempunyai membran plasma tunggal yang dikelilingi dinding
sel tebal berupa peptidoglikan. Contoh bakteri Gram positif yaitu Neisseria gonorrhoe,
Treponema pallidum, Vibrio cholerae, dan Bacillus subtilis.( Waluyo,2008)
Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang
tidak
mempertahankan zat
warna kristal
violet sewaktu proses pewarnaan Gram sehingga akan berwarna merah bila diamati
dengan mikroskop. bakteri gram negatif (seperti E. coli) memiliki sistem membran ganda
di mana membran pasmanya diselimuti oleh membran luar permeabel. Bakteri ini
mempunyai dinding sel tebal berupa peptidoglikan, yang terletak di antara membran dalam
dan membran luarnya.
Contoh bakteri gram negatif yaitu Escherichia coli, Streptococcus mutans, dan
Staphylococcus aureus .( Waluyo,2008)
4. Mengapa diperlukan fiksasi panas dalam pengecatan bakteri ? Jelaskan!

fiksasi adalah proses pengawetan dan pelekatan atau penempelan struktur sel
mikroorganisme pada suatu posisi. Selain itu fiksasi juga berfungsi untuk menonaktifkan
enzim lytic sehingga bakteri tidak mengalami lisis dan berubah bentuk pada saat diamati.
Tujuan fiksasi panas adalah pelekatan bakteri supaya pada saat pencucian, bakteri tersebut
tidak ikut hilang tercuci. Fiksasi panas dilakukan dengan cara melewatkan kaca preparat di
atas api. Fiksasi dilakukan sampai kaca preparat terasa hangat apabila ditempelkan pada
punggung tangan. Fiksasi yang dilakukan tidak boleh terlalu panas dan lama, karena
bakteri yang ada pada preparat bisa hangus terpanggang dan terjadi perubahan bentuk dan
penyusutan sel.( Sandjaja,2003)
5. Apa larutan yang digunakan dalam pengamatan kapang? Apa fungsi larutan
tersebut?

Larutan laktofenol dapat digunakan dalam pewarnaan pada khamir dan kapang. Organisme
yang tersuspensikan ke dalam larutan tersebut akan mati akibat phenol yang terdapat di
dalamnya dan akan memberi efek transparan, sedangkan methylen blue hanya memberi
warna pada kapang dan khamir. Konsentrasi fenol yang tinggi membuat enzim yang
terdapat dalam sel terdeaktifasi tanpa menyebabkan terjadinya lisis. Laktofenol tidak
mudah menguap seperti akuades sehingga preparat tidak cepat kering dan sel kapang tidak
cepat rusak. Kerugian dari penggunaan laktofenol adalah apabila dipakai terlalu lama
laktofenol dapat mengubah bentuk sel. Laktofenol dapat mencegah penguapan dan
pengerutan sel, sehingga sel mudah diamati.( Lay,2004)
6. Mengapa digunakan metilen blue dalam pengecatan sederhana sel khamir?
Jelaskan!

Fungsi dari methylen blue dalam pengecatan sel khamir adalah sebagai indikator untuk
memberikan perbedaan yang nyata antara sel yang hidup dan sel yang mati. Sel yang
mati mengalami kerusakan pada membran selnya, protein dalam sel keluar dan berikatan
dengan biru tripan, sehingga sel yang mati akan berwarna biru karena telah menyerap
methylen blue dan sel yang hidup berwarna transparan karena tidak menyerap methylen
blue.( Dwidjoseputro,2005).

7. Dalam pengecatan endospora, reagen apakah yang berfungsi sebagai cat

utama dan cat penutup? Jelaskan fungsinya masing-masing!

Pada metode Schaeffer-Fulton yang banyak dipakai dalam pengecatan endospora, pertama
endospora diwarnai dengan malachite green dengan proses pemanasan. Larutan ini
merupakan pewarna yang kuat yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah
perlakuan malachite green, biakan sel dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin.
Teknik ini akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel
vegetatifnya(Campbell,2006)
8. Jelaskan jenis-jenis uji biokimiawi untuk proses identifikasi mikroorganisme!

a) Uji katalase,Uji katalase bertujuan untuk mengetahui apakah suatu organisme

memiliki enzim katalase atau tidak.(oktarina,2010)
b) Indol Media ini biasanya digunakan dalam identifikasi yang cepat. Hasil uji indol
yang diperoleh negatif karena tidak terbentuk lapisan (cincin) berwarna merah
muda pada permukaan biakan, artinya bakteri ini tidak membentuk indol dari
tryptopan sebagai sumber karbon, yang dapat diketahui dengan menambahkan
larutan kovaks seperti Ehrlich yang megandung para-dimetil-aminobenzaldehida
(oktarina,2010)
c) Uji gula-gula (Glukosa, Laktosa, Sukrosa dan Manitol) Uji ini dilakukan untuk
mengindetifikasi bakteri yang mampu memfermentasikan karbohidrat. Pada uji
gula-gula hanya terjadi perubahan warna pada media glukosa yang berubah
menjadi warna kuning, artinya bakteri ini membentuk asam dari fermentasi
glukosa. Pada media glukosa juga terbentuk gelembung pada tabung durham yang
diletakan terbalik didalam tabung media, artinya hasil fermentasi berbentuk gas
(Oktarina, 2010)
d) uji reduksi nitrat Keberadaan nitrit dalam media diuji dengan penambahan asam
sulfanilat dan -naftilamin yang akan bereaksi dengan nitrit yang ditunjukkan
dengan perubahan warna media menjadi merah atau merah muda(oktarina,2010)

1.

Pengamatan Kapang

Biakan murni Aspergillus

niger dan Rhizopus Orizae

Dibersihkan gelas benda dengan alkohol dan ditetesi laktofenol atau gliserol 10%

Diambil sedikit biakan murni jamur dengan jamur preparat

diletakkan digelas benda yang telah diberi laktofenol

dipisahkan dengan jarum preparatjika menggumpal

Ditutup dengan gelas penutup

Diamati dengan mikroskop perbesarn 100x dan 400x

Digambar hasil pengamatan

Hasil

2. Pengecatan sederhana sel khamir

Biakan murni Sacharomyces cerevisae

Dibersihkan gelas benda dan gelas penutup dengan alkohol

Biakan L.Plantarum,
Hasil
AcetobacterXylinum