PEMERIKSAAN ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT

ASSAY (ELISA) DALAM PENENTUAN KADAR

MATRIKS METALLOPROTEINASE-8 DAN -9 CAIRAN
SULKUS GINGIVA PADA PERIODONTITIS

Oleh:
Okky Marita Ardy
091414653003

SEKOLAH PASCA SARJANA

UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
2015

BAB 1
PENDAHULUAN
Jaringan periodontal terdiri dari gingiva dan jaringan periradikular. Jaringan
periradikular terdiri dari ligamen perodontal, sementum dan tulang alveolar.
Cairan sulkus gingiva (CSG) merupakan cairan yang sangat berguna sebagai
sarana diagnostik bagi para klinisi karena mengandung penanda-penanda biologis
(biomarker) yang spesifik pada kondisi tertentu, yang dapat dijadikan penilaian untuk
mengetahui kondisi biologis dari jaringan periodonsium (Waddington, 2001). Cairan
Sulkus Gingiva (CSG) ini adalah suatu eksudat inflamatoris yang berasal dari pleksus
pembuluh darah gingiva di korium gingiva, dijumpai di sulkus gingiva. Cairan ini
cenderung

meningkat

jumlahnya

pada

kondisi

inflamasi

dan

meningkatnya

permiabilitas kapiler (Meeran,2011).

Penyakit periodontal ialah reaksi radang jaringan periodontal akibat invasi
bakteri yang berkolonisasi pada plak gigi. Ruangan subgingiva sangat terbatas pada
individu dengan kondisi jaringan periodontal yang sehat. Namun, bila akumulasi plak
terjadi terus-menerus, akan terjadi pengurangan perlekatan lapisan epitel gingiva pada
permukaan gigi dan berakibat peningkatan kedalaman poket gingiva.
Bakteri plak gigi akan mengeluarkan produk/material, seperti asam lemak
(contohnya asam butirat dan asam propianat), peptida seperti FMLP (Nformilmethionyl-leucyl- phenylalanine) dan LPS, yang akan berdifusi kedalam lapisan
epitel gingiva. Material ini akan merangsang sel epitel untuk memproduksi mediator
inflamasi seperti interleukin-8 (IL-8), IL-1 beta, prostaglandin E2 (PGE2), matriks
metailoproteinase (MMP) dan tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha).
Matriks metailoproteinase (MMP) disebut juga dengan matriksin atau
kolagenase adalah enzim proteinase yang mampu merusak matriks ekstraseluler seperti
kolagen. MMP terdiri dari kelompok kolagen interstisial (contohnya ialah MMP-1,
MMP-8, dan MMP-13), gelatinase (contohnya MMP-2 dan MMP-9), Stromelisin
(contohnya MMP-3, MMP-10, MMP-11), kelompok yang berikatan dengan membran
(contohnya MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17).
Matriks Metalloproteinase 8 (MMP-8) bagian dari keluarga zinc-dependent
endopeptidase yang berperan dalam pengrusakan kolagen (Surlin 2000), paling efektif
mendegradasi kolagen tipe I (Apajalahti, 2004) yang paling banyak ditemukan pada
ligamen periodontal. Di antara enzim litik famili matrixine, tipe IV collagenase yang

disebut juga sebagai gelatinase merupakan tipe matrixine yang memiliki aktivitas
degradasi kolagen tertinggi.
Sandwich ELISA merupakan jenis ELISA yang dapat digunakan untuk
mengukur antigen maupun antibodi,. Karakteristik khas dari sandwich ELISA
adalah menggunakan antibodi penangkap atau primer antibodi. Antigen yang akan
dideteksi dan diukur konsentrasinya berikatan terlebih dahulu dengan antibodi
penangkap.

Antigen

akan

berikatan

kembali

dengan

antibodi

sesuai

jenis sandwich ELISA yang digunakan.

Mekanisme kerusakan jaringan pada penyakit periodontal tidak terlepas dan
peranan enzim matriks metalloproteinase (MMP). MMP diproduksi oleh set makrofag
dan fibroblast gingiva dan letaknya sangat berhubungan dengan jaringan yang sedang
mengadakan remodeling. Produk bakteri seperti LPS akan megaktifkan sel fagosit
untuk memproduksi mediator seperti IL-1. Mediator ini kemudian akan mengaktifkan
sel makrofag dan fibroblast gingiva untuk memproduksi MMP dan regulatornya yaitu
TIMP. MMP ini akan mengawali terjadinya destruksi matriks ekstraseluler gingiva
seperti kolagen dan merangsang terjadinya resorpsi tulang.
Pada makalah ini penulis ingin menjelaskan prosedur pemeriksaan sandwich
ELISA dalam penentuan kadar matriks metalloproteinase (MMP)-8 dan -9 cairan sulkus
gingiva pada periodontitis.

BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA

2.1

Struktur Jaringan Periodontal

Jaringan periodontal merupakan sistem fungsional jaringan yang mengelilingi

gigi dan melekatkan pada tulang rahang, dengan demikian dapat mendukung gigi
sehingga tidak terlepas dari socketnya. Jaringan periodontal terdiri dari gingiva dan
jaringan periradikular. Jaringan periradikular terdiri dari ligamen periodontal, sementum
dan tulang alveolar.

Gambar 1. Struktur Gigi dan Jaringan Periodontal

2.1.1

Gingiva

Gingiva adalah bagian dari mukosa oral yang mengelilingi gigi dan menutupi
alveolar ridge. Secara anatomis, gingiva dibagi menjadi marginal gingiva, attached
gingiva, dan area interdental.
Jaringan ikat gingiva terdiri dari rangkaian bundel serat kolagen yang
mengandung pembuluh darah dan saraf, fibroblas, makrofag, sel mast, limfosit sel
plasma dan sel-sel sistem pertahanan lainnya. Jaringan ikat merupakan komponen
utama pada gingiva terdiri dari serat kolagen (60%), fibroblas (5%), dan pembuluh
darah, saraf dan matriks (35%) (Graber et al, 2005). Jaringan ikat gingiva fibrosa terdiri
dari sel fibroblast spesialized dan jaringan fibrosa kolagen tertanam dalam matriks
ekstraselular yang terdiri dari proteoglikan dan glikoprotein matriks lainnya (Elley et al,
2010).

2.1.2

Ligamen Periodontal
Ligamen periodontal adalah jaringan lunak, kaya akan pembuluh darah dan

jaringan ikat selular yang mengelilingi akar gigi dan menggabungkan sementum dengan
lamina dura atau tulang alveolar.
Sel-sel aktif ligamen periodontal adalah fibroblas, osteoblas, dan sementoblas.
Fibroblas mensintesis kolagen dan matriks dan terlibat dalam degradasi kolagen untuk
pengubahan bentuknya berupa serabut utama yang konstan dalam pemeliharaan
ligamen periodontal yang sehat. Fibroblas merupakan sel-sel ligamen periodontal yang
paling penting.
Osteoblas atau sel pembentuk tulang ditemukan di daerah lateral ligamen
periodontal melapisi soket tulang. Fungsi osteoblas adalah deposisi kolagen dan matriks
yang ditumpuk pada permukaan tulang.
2.1.3

Sementum
Sementum adalah lapisan tipis matriks ekstraseluler termineralisasi yang

menutupi permukaan akar. Tersusun dari hidroksiapatit dan kolagen tipe I, avaskular,
tidak memiliki inervasi dan tidak mengalami remodelling. Sementum dibagi menjadi
dua yaitu tipe selular dan aselular, tergantung dari ada atau tidak sementosit (Apajalahti,
2004).
2.1.4

Tulang Alveolar
Merupakan bagian spesifik pada tulang maksila dan mandibula yang

membentuk struktur pendukung utama gigi geligi. Tulang alveolar terdiri dari tulang
kortikal padat yang mengelilingi tulang kanselus (trabekular) (Sodek and McKee,
2000).
Tulang alveolar adalah bagian dari jaringan periradikular. Pembentukannya
dimulai oleh osifikasi intra-membran pada tingkat awal pembentukan akar. Osteoblas
pada tepi ligamen periodontal menumpuk suatu matriks organik yang disebut osteoid,
yang terdiri dari fibril kolagen dan substansi dasar yang terdiri dari glikoprotein,
fosfoprotein, lipid dan proteoglikan. Pada waktu ostetoblas menumpuk matriks,
beberapa terjebak di dalamnya; sel-sel ini disebut osteosit. Matriks mengapur karena
deposisi kristal hidroksiapatit yang terutama terdiri dari kalsium dan fosfat.

2.2 Klasifikasi Penyakit Periodontal

1. Penyakit gingiva
a. Dental plaque-induced gingival disease
b. Non plaque-induced gingival disease
2. Periodontitis kronis
a. Lokalisata : < 30% daerah yang terlibat
b. Generalisata : > 30% daerah yang terlibat
c. Slight : 1-2 mm clinical attachment loss
d. Moderate : 3-4 mm clinical attachment loss
e. Severe : 5 mm clinical attachment loss
3. Periodontitis agresif
4. Periodontitis dengan manifestasi penyakit sistemik
5. Necrotizing periodontal disease
6. Periodontal abses
7. Periodontitis kaitan dengan lesi endodontik
2.3 Matriks Ekstraseluler
Matriks ekstraseluler adalah sekumpulan protein fibrosa yang melekat pada gel
polisakarida terhidrasi. Molekul makro yang membentuk matriks ekstraseluler disekresi
oleh sel-sel, terutama fibroblas. Untuk matriks yang lebih khusus, misalnya kartilago
atau tulang, maka matriks ekstraseluler disekresi oleh sel-sel yang berdiferensiasi lebih
tinggi, misalnya osteoblas, yang membentuk tulang dan atau kondrosit yang
membentuk kartilago (Gendron,1999). Komponen matriks ekstraseluler utama adalah
protein-protein jaringan, antara lain kolagen, fibronektin dan glikosaminoglikan yang
berikatan dengan protein membentuk proteoglikan. Protein-protein ini yang
bertanggung jawab atas integritas struktural dari jaringan pendukung gigi. Kerusakan
dari jaringan pendukung ini ditandai oleh degradasi matriks ekstraseluler yang dapat
menyebabkan kerusakan permanen dari jaringan lunak periodontal dan tulang alveolar
(Kerrigan,2000).
2.4 Matriks Metalloproteinase
Matriks metalloproteinase (MMP) adalah sejenis enzim proteolitik sebagai
subfamilia matrixin dan familia zinc metalloproteinase yang pada manusia dijumpai
sekurang-kurangnya 25 macam (Apajalahti, 2004).

Sel-sel jaringan ikat endogen dan juga beberapa jenis sel hematopoetik yang
mensintesis MMP. Matriks ini pertama kali ditemukan oleh Gross dan Lapiere tahun
1962 pada vertebrata termasuk homo sapiens, tetapi kemudian ditemukan juga pada
invertebrata dan tumbuhan. MMP dibedakan dengan endopeptidase lain karena
ketergantungannya pada ion logam sebagai kofaktor dan kemampuannya untuk
mendegradasi matriks ekstraseluler, serta ciri-ciri khasnya dalam sekuens DNA
(Kerrigan. 2000).
Matriks Metalloproteinse (MMP) dapat diproduksi oleh berbagai sel
imunoefektor seperti netrofil, monosit/ makrofag, fibroblast (Uitto, 2003). Juga
dipengaruhi oleh pelepasan neuropeptida pro inflamasi dari saraf sensoris yang dekat
pada berbagai jaringan termasuk gingiva (Avellan et al, 2005).
Matriks metalloproteinase (MMP) tidak hanya mendegradasi hampir semua
matriks ekstraselular dan komponen membran basal tapi juga growth factor, reseptor
permukaan sel, sitokin proinflamasi sehingga mengakibatkan pengaturan sel dan
penghantaran sinyal. Sebagai tambahan, MMP terlibat erat pada kondisi patologik
seperti rheumatoid arthritis, invasi tumor dan metastasis, infeksi pernafasan kronis,
penyakit periodontal dan penyakit mata (Apajalahti, 2004).
Berdasarkan gambaran strukturnya, MMP dapat dibagi menjadi kolagenase,
gelatinase, stomelisin, matrilisin dan matriks metaloproteinase jenis membran.
Kolagenase sebagai anggota subfamilia MMP terdiri atas kolagenase-1 (MMP-1),
kolagenase-2 (MMP-8) dan kolagenase-3 (MMP-13). Kolagenase mempunyai
kemampuan yang unik dalam memecah kolagen fibriler tipe I, II dan III.

Gambar 2. Peran kolagenase dalam memecah tiple helix kolagen

Kolagenase sanggup menginisiasi degradasi kolagen dengan mengurai triple

helix. Triple helix kolagen membelah pada tempat spesifik unutk menghasilkan Nterminal dan C terminal fragmen dimana pada suhu tubuh dapat berubah menjadi
gelatin (Apajalahti, 2004).
Semua kolagenase disekresi dari sel sebagai proenzim laten dan diaktivasi in
vivo secara ekstraseluler terutama terhadap pemotongan proteolitik oleh host derived
tissue dan serine protease (MMP lain, PMN elastase, plasmin, capthepsin G, trypsin-2)
atau oleh proteinase bakterial (Apajalahti, 2004).
2.4.1

Matriks Metalloproteinase 8 (MMP-8)

Matriks metalloproteinase-8 (MMP-8) adalah enzim pemecah kolagen yang

terdapat pada jaringan ikat dari kebanyakan mamalia. Pada manusia, protein MMP-8
disandi oleh gen MMP-8. Pada umumnya, MMP disekresi dalam bentuk proprotein
yang diaktifkan ketika dipecah oleh proteinase ekstraseluler. Akan tetapi, enzim ini
disimpan di granuler sekunder dari netrofil yang diaktivasi dengan cara pemecahan
autolitik. Fungsinya adalah untuk mendegradasi kolagen jenis I,II dan III (Nagase,
2006; Apajalahti, 2004).
Matriks Metalloproteinase 8 (MMP-8) bagian dari keluarga zinc-dependent
endopeptidase yang berperan dalam pengrusakan kolagen, paling efektif mendegradasi
kolagen tipe I yang paling banyak ditemukan pada ligamen periodontal.
MMP-8 pada awalnya dianggap terbatas pada netrofil, tetapi akhirnya dapat
dideteksi pada kondroisit dari kartilago osteoartritis, fibroblas sinovial dan sel endotel,
sel odontoblas dan sel pulpa gigi (Sasano, 2002). Fungsi dari MMP-8 antara lain adalah
berhubungan dengan penyakit mielofibrosis, melanoma, terlibat dalam proses
proteolisis, proses katabolik kolagen, metabolisme peptidoglikan (protein yang
diharapkan mempunyai fungsi molekuler aktivitas kolagenase netrofil, ikatan ion zinc,
ikatan ion kalsium, aktivitas kolagenase interstitial, aktivitas metaloendopeptase)
terlokalikasi di ruang ekstra seluler, matriks ekstra seluler proteinase dan matriks
ekstraseluler (Palosaari, 2000). Kadar MMP-8 menunjukkan pada kondisi periodontitis
sekitar 2500 g/L, pada gingivitis sekitar 750 g/L dan pada kondisi sehat sekitar 100
g/L.
2.4.2

Matriks Metalloproteinase 9 (MMP-9)

Di antara enzim litik famili matrixine, tipe IV collagenase yang disebut juga

sebagai gelatinase merupakan tipe matrixine yang memiliki aktivitas degradasi kolagen
tertinggi. Gelatinase atau collagenase tipe IV (MMP-2 dan -9) memiliki kemampuan

untuk mendegradasi triple helix collagen tipe IV dari lamina basalis yang ditemukan
pada membran basalis.
Gelatinase atau collagenase tipe IV juga memiliki kemampuan tinggi dalam
proses gelatinolitik yang mendegradasi kolagen tipe V, VII, IX, dan X, fibronektin dan
elastin. Walaupun serupa dalam struktur dan fungsinya, kedua enzim gelatinase ini
berasal dari transkripsi mRNA yang terpisah dari gen yang terpisah pula. Lebih lanjut,
dari antara tipe IV collagenase ini, ternyata MMP-9 memiliki peran terpenting dan
paling berkaitan dengan progresifitas suatu tumor.
MMP-9 disekresi oleh sel tubuh manusia, seperti sel fibroblast, sel endotel, sel
polimorfonuklear, keratinosit, dan makrofag. Peningkatan ekspresi MMP-9 terjadi pada
proses inflamasi dan juga pada proses keganasan.
2.5 Cairan Sulkus Gingiva
Sulkus gingiva merupakan suatu celah dangkal disekeliling gigi dengan dinding
sebelah dalam adalah permukaan gigi dan dinding sebelah luar adalah epitel sebelah
dalam dari gingiva bebas. Sulkus ini membetuk seperti huruf V.
Cairan sulkus gingiva (CSG) merupakan cairan yang sangat berguna sebagai
sarana diagnostik bagi para klinisi karena mengandung penanda-penanda biologis
(biomarker) yang spesifik pada kondisi tertentu, yang dapat dijadikan penilaian untuk
mengetahui kondisi biologis dari jaringan periodonsium (Waddington, 2001).
Cairan Sulkus Gingiva (CSG) ini adalah suatu eksudat inflamatoris yang berasal
dari pleksus pembuluh darah gingiva di korium gingiva, dijumpai di sulkus gingiva.
Cairan ini cenderung meningkat jumlahnya pada kondisi inflamasi dan meningkatnya
permeabilitas kapiler (Meeran,2011). Cairan ini keluar pada tepi gingiva dan dapat
dikumpulkan melalui berbagai prosedur yang bervariasi dengan proses yang spesifik
pada sisi tertentu dan non invasif. Pengumpulannya dapat dilakukan dengan beberapa
cara yaitu menggunakan platinum loop, filter-paper strip, pembilasan gingiva dan pipet
mikro.
Komponen-komponen seluler dan humoral darah dapat mencapai gigi dan
permukaan epitel mulut dengan cara cairan tersebut mengalir melalui epitel junctional
gingiva. Oleh karena itu fungsi dan struktur epitel junctional adalah penting dalam hal
relasi biologis antara komponen vaskuler dan struktur periodontal. Epitel junctional
membentuk suatu perlekatan organik ke gigi dan bersambung dengan epitel sulkus yang

meluas ke tepi gingiva. Epitel junctional berbeda dengan epitel lainnya karena
mempunyai dua lamina basalis, satu melekat ke jaringan ikat dan satunya ke gigi.
Dalam CSG dijumpai komponen cairan dan seluler. Komponen cairan dari CSG
antara lain mengandung imunoglobulin A, Ig G dan IgM, komplemen C3, C4, dan C5
dan proaktifator C3. IgG cairan krevikuler mengandung antibodi spesifik terhadap
sejumlah miroorganisme mulut, misalnya Streptococcus mutans. Aktivasi dari fagosit
(netrofil dan monosit) menyebabkan kerusakan dan respon peradangan. Selama proses
inflamasi, produk interseluler dibuat dan bermigrasi ke sulkus gingiva atau poket
periodontal. Mediator-mediator dari aktivitas penyakit seperti IL-1, IL-6, TNF telah
diidentifikasi dan dijadikan sampel dari berbagai cairan biologis misalnya saliva dan
CSG (Kinney, 2007).
Komponen seluler pada CSG yang paling banyak dijumpai adalah netrofil
(92%). Sel-sel lainnya adalah mononuklear, terdiri dari makrofag, limfosit T dan B. Selsel ini bermigrasi dari darah melalui epitel junctional, dan mungkin sel-sel ini setelah
memakan bakteri, menuju ke sulkus gingiva. Proporsi netrofil dalam cairan krevikuler
lebih tinggi dibanding yang dijumpai dalam darah (70%) secara konsisten walaupun
diketahui bahwa netrofil mempunyai kapasitas untuk bermigrasi.
Cairan Sulkus Gingiva (CSG) muncul pada margin gingiva dan dapat bervariasi
digambarkan sebagai transudat atau eksudat. Laju aliran ini terkait dengan tingkat
inflamasi gingiva,dan tingkat 0,05-0,20 per menit dilaporkan dalam kasus peradangan
minimal. Jumlah cairan aliran adalah antara 0,5 dan 2,4 mL per hari.
2.6

SANDWICH ELISA
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) merupakan suatu teknik

biokimia untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel.
Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk
antigen tertentu. ELISA terdiri atas tiga macam yaitu Direct ELISA, Indirect
ELISA, dan Sandwich ELISA (Baker et al, 2007).
Sandwich ELISA merupakan jenis ELISA yang dapat digunakan untuk
mengukur antigen maupun antibodi. Sandwich ELISA menggunakan antibodi
penangkap atau capture antibody, antibodi primer, dan antibodi yang berlabel
enzim. Antigen yang akan dideteksi dan diukur konsentrasinya berikatan terlebih
dahulu dengan antibodi penangkap (Crowther, 1995).

Antigen merupakan molekul yang menginduksi respon sistem imun atau

molekul yang akan dikenali oleh sistem imun yang spesifik. Antibodi merupakan
protein-protein yang terbentuk sebagai respon terhadap antigen yang masuk ke
tubuh dan bereaksi secara spesifik dengan antigen tersebut (Rao, 2001).

Gambar 3. Prinsip Kerja Sandwich ELISA

Alat yang digunakan dalam uji ELISA antara lain adalah ELISA reader,
ELISA washer, well plate, dan mikropipet beserta tips. Bahan yang digunakan
antara lain blocking buffer, washing buffer, antigen, antibodi monoklonal, dan suatu
substrat.
Cara kerja uji ELISA adalah sebagai berikut. Pertama, well plate dilapisi
dengan

antibodi

penangkap.

Kedua, well

plate dicuci

dengan

menggunakan washing buffer. Ketiga, antigen diberikan pada well plate dan well
plate kemudian dicuci dengan menggunakan washing buffer. Keempat, well
plate diberi antibodi detektor dan well plate kembali dicuci menggunakan washing
buffer. Kelima, anti-antibodi yang dilabeli enzim ditambahkan pada well plate dan
well

plate kembali

dicuci

menggunakan

washing

buffer. Keenam,

substrat

dimasukkan agar enzim dapat berikatan dan memberikan sinyal terhadap

keberadaan antigen.

Gambar 4. ELISA Reader dan ELISA Washer

Gambar 5. Tahapan Sandwich ELISA

Prinsip tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:

1.

Melapisi plate ELISA dengan antibodi penangkap yang sudah diencerkan dan
diinkubasi semalam pada suhu 4C.

2.

Cuci well plate dengan ddH2O, cuci dengan PBS-Triton sebanyak dua kali.

3.

Semua

non

spesifik binding

sites pada

permukaan

diblokir

dengan

menggunakan BSA / PBS dan diinkubasi selama 30-60 menit pada suhu kamar.
4.

Cuci plate. Kemudian masukkan 100 l sampel berisi antigen dan tambahkan
antibodi primer supaya berikatan secara spesifik dengan antigen.

5.

Inkubasi selama 1 jam pada suhu kamar. Cuci plate untuk membuang kelebihan
antigen yang tidak terikat.

6.

Tambahkan 100 l antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim (Alkaline

Phosphatase atau Horseradish Peroxidase) yang akan berikatan dengan antibodi
primer

7.

Inkubasi selama 1 jam, cuci plate, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak
terikat dapat dibuang.

8.

Tambahkan 100 l substrat yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal
berwarna/ berfluoresensi, inkubasi selama 1 jam. Tambahkan juga stopping
solution. Stop solution merubah warna menjadi kuning.

9.

Baca plate menggunakan microplate ELISA reader pada 450 nm. Diukur
absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen.

Gambar 6. Well Plate dan Micropipet

Hasil dari proses ELISA terdiri dari dua bentuk yaitu kualitatif dan
kuantitatif. Hasil secara kualitatif adalah perubahan warna pada well plate yang
mengindikasikan bahwa terjadi reaksi yang spesifik antara antigen dengan antibodi.
Perubahan warna tersebut dihasilkan oleh reaksi antara substrat dengan enzim yang
terdapat di anti-antibodi. Hasil secara kuantitatif berupa besaran konsentrasi dan
nilai adsorbsi (y) pada sampel. Pengukuran y pada hasil ELISA menggunakan
mesin ELISA reader yang prinsipnya sama dengan mesin spektrofotometer.
Intensitas cahaya yang diserap oleh sampel pada panjang gelombang tertentu
berbanding lurus dengan besar nilai y. Jika semakin banyak intensitas cahaya yang
diserap, maka semakin besar nilai y. Semakin kecil nilai intensitas cahaya yang
diserap

oleh

sampel,

semakin

kecil

pula

nilai y (Crowther,

2001).

Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya

mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama antibodi
penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap
secara kompetitif oleh permukaan lempeng.

BAB 3
PEMBAHASAN JURNAL
3.1 Judul
Levels of gingival crevicular metalloproteinases-8 and -9 in periodontitis.
3.2 Sampel
Sampel terdiri dari 10 pasien dengan periodontitis (5 laki-laki, 5 wanita) dengan
kisaran usia 29-34 tahun dan 10 pasien dengan kondisi periodontal sehat (5 laki-laki, 5
wanita) dengan kisaran usia 28-34 tahun.
3.2.1 Kriteria Sampel Pasien Periodontitis
1. Memiliki minimal 18 gigi, tidak termasuk molar ke-3
2. Minimal 7 gigi mengalami moderate hingga advanced / severe chronic
periodontitis (kedalaman poket periodontal sebesar > 6 mm)
3. Tidak ada kelainan sistemik
4. Tidak ada riwayat medikasi selama 5 bulan sebelumnya dan tidak ada perawatan
periodontal
5. Tidak untuk wanita yang sedang hamil atau sedang menjalani perawatan vitamin
atau hormon
3.2.2 Kriteria Sampel Pasien Sehat
1. Tidak ada kelainan periodontal
2. Tidak ada kelainan sistemik
3. Tidak ada riwayat medikasi selama 5 bulan sebelumnya dan tidak ada perawatan
periodontal
4. Tidak untuk wanita yang sedang hamil atau sedang menjalani perawatan vitamin
atau hormon
3.3 Prosedur
1. Mencatat parameter klinis periodontal (kedalaman probing periodontal,
perdarahan pada saat probing, dan clinical loss of attachment) pada masingmasing subyek setelah pengambilan saliva.
2. Pengukuran kedalaman probing pada 6 bagian pada masing-masing gigi
(mesiobukal, midbukal, distobukal, mesiolingual, midlingual, dan distolingual)

dengan menggunakan manual probe (Hu-Friedy, Chicago, USA). Pengukuran

clinical loss of attachment hanya pada daerah interproksimal saja.
3. Satu hingga empat bagian gigi pada masing-masing pasien diambil cairan sulkus
gingiva secara random.
4. Daerah yang akan diambil cairan sulkusnya dibersihkan dari plak dengan alat
kuret, terutama daerah supragingiva dan dikeringkan, kemudian diisolasi dengan
cotton roll.
5. Pengambilan cairan sulkus gingiva dengan cara menginsersikan Periopaper
strips (PerioCol Paper Strips, Oraflow Inc., USA) pada poket gingiva selama 45
detik. Strip yang terkontaminasi darah atau saliva dibuang.
6. Strip dimasukkan ke dalam 50 L larutan phosphate-buffered saline (PBS)
0,9%, kemudian diletakkan ke dalam es selama 1 jam.
7. Kemudian sampel tersebut disentrifugasi pada 9220g selama 15 menit.
8. Kadar MMP-8 dan -9 diukur dengan metode ELISA (R&D systems for MMP-8,
-9 ELISA kit, Minneapolis, MN, USA).

Gambar 7. ELISA kit R&D Systems

3.4 Hasil
Pada parameter klinis periodontal terdapat perbedaan yang nyata atau signifikan
antara pasien periodontitis dan pasien sehat (kontrol) (P<0,05) (Tabel 1). Kadar MMP-8
dan -9 pada pasien periodontitis juga ditemukan lebih tinggi daripada pasien dengan
kondisi periodontal yang sehat (P<0,05) (Tabel 2).

3.5 Peran MMP-8 dan -9 pada Periodontitis

Periodontitis ialah reaksi radang jaringan periodontal akibat invasi bakteri yang
berkolonisasi pada plak gigi. Bakteri plak gigi diketahui mengeluarkan banyak
komponen kedalam ruang mulut dan sulkus gingiva. Bakteri gram negatif
mengeluarkan material dinding sel yang berperan sebagai vesikel membran. Material
ini diantaranya ialah lipopolisakarida (LPS), lipid dan protein. Material ini berperan
pula sebagai signal bagi hospes untuk mengetahui seberapa besar dan macam bakteri
plak gigi dan menyebabkan hospes berespon secara langsung maupun tidak langsung.
Respon langsung terjadi bila bakteri atau produknya menginduksi sel gingiva untuk
mengeluarkan glikoprotein seperti khemokin atau interleukin. Respon tidak langsung
bila bakteri menyebabkan sel terangsang memproduksi glikoprotein yang selanjutnya
akan merangsang sel lainnya.
Bakteri gram positif hanya akan menyebabkan produksi khemokin dengan level
rendah. Oleh karena bakteri gram positif hanya pada plak gigi dengan jaringan
periodontal relatif sehat, maka jarang ditemukan infiltrasi sel pada gingiva. Sebaliknya
gram negatif sangat potent merangsang produksi khemokin ini, akibatnya banyak
dijumpai infiltrasi sel pada jaringan periodontal yang mengalami inflamasi. Diketahui
pula bahwa LPS dari bakteri gram negatif mampu menyebabkan destruksi tulang
alveolar dengan cara mengaktifkan set osteoklast. Jadi pada penyakit periodontal tahap

lanjut, dijumpai adanya kerusakan tulang alveolar yang parah dan berakibat gigi goyah.
Bakteri ini mampu pula merusak integritas lapisan epitel gingiva.
Bakteri plak gigi akan mengeluarkan produk/material, seperti asam lemak
(contohnya asam butirat dan asam propianat), peptida seperti FMLP (Nformilmethionyl-leucyl- phenylalanine) dan LPS, yang akan berdifusi kedalam lapisan
epitel gingiva. Material ini akan merangsang sel epitel untuk memproduksi mediator
inflamasi seperti interleukin-8 (IL-8), IL-1 beta, prostaglandin E2 (PGE2), matriks
metalloproteinase (MMP) dan tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha). Mediator ini
akan merangsang pembuluh darah menjadi terinflamasi.
Peningkatan permeabilitas pembuluh darah menyebabkan ekstravasasi sel
leukosit. Protein serum seperti komplemen, protein fase akut dan sistem plasmin akan
semakin meningkatkan respon inflamasi dan mengaktifkan sel endotel untuk
memproduksi mediator Iebih banyak seperti IL-1 akan mengaktifkan sel makrofag
untuk memproduksi mediator Iainnya seperti TNFalpha, IL-8, 1L-6, IL-10, IL-12,
PGE2, MMP, interferon-gamma (IFN-gamma), dan khemokin seperti RANTES, MCP
dan MIP. Meningkatnya level IL-8 juga menyebabkan aktivasi dan migrasi sel netrofil
ke tempat plak gigi.
Setelah fase awal inflamasi terjadi, sel mononuklear seperti makrofag dan sel
limfosit mulai infiltrasi. LPS mampu pula secara !angsung mengaktifkan sel limfosit B
untuk memproduksi antibodi dan merangsang sel makrofag mengeluarkan mediator
seperti TGF-beta, IL-1, IL-12, dan IL-10 maupun matriks metalloproteinase. Hasil akhir
dari fase ini ialah semakin banyaknya infiltrasi sel makrofag dan limfosit disertai
semakin tinggi tingkat kerusakan matriks ekstraselular seperti kolagen. Akibatnya,
semakin banyak akumulasi plak gigi, semakin tinggi respon imun dan semakin besar
kerusakan jaringan. Hal ini dapat dilihat secara klinis dengan semakin dalamnya poket
gingiva dan perdarahan spontan.
Mekanisme kerusakan jaringan pada penyakit periodontal tidak terlepas dan
peranan enzim matriks metalloproteinase (MMP). Enzim ini juga disebut matriksin atau
kolagenase adalah enzim proteinase yang mampu merusak matriks ekstraseluler seperti
kolagen. MMP ini sebenarnya adalah sekelompok proteinase yang mempunyai fungsi
yang hampir sama. Mereka terdiri dari kelompok kolagen interstisial (contohnya ialah
MMP-1, MMP-8, dan MMP-13), gelatinase (contohnya MMP-2 dan MMP-9),
Stromelisin (contohnya MMP-3, MMP-10, MMP-11), kelompok yang berikatan dengan
membran (contohnya MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17). MMP akan berfungsi

melisis target sesuai dengan nama kelompok MMP. Diketahui pula ada substansia yang
disebut TIMP (Tissue Inhibitor of Metalloproteinase) dan berfungsi sebagai
penghambat kerja TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 dan TIMP-4.
MMP dan TIMP diproduksi oleh sel makrofag dan fibroblast gingiva dan
letaknya sangat berhubungan dengan jaringan yang sedang mengadakan remodeling.
Diduga, produk bakteri seperti LPS akan megaktifkan sel fagosit untuk memproduksi
mediator seperti IL-1. Mediator ini kemudian akan mengaktifkan sel makrofag dan
fibroblast gingiva untuk memproduksi MMP dan regulatornya yaitu TIMP. MMP ini
akan mengawali terjadinya destruksi matriks ekstraseluler gingiva seperti kolagen dan
merangsang terjadinya resorpsi tulang.
Pada penderita periodontitis, infiltrasi sel dan degradasi kolagen bergerak kearah
apikal sepanjang akar gigi. Sel osteoblast menghilang tetapi disertai dengan
meningkatnya sel osteoklast yang meresorpsi tulang. Permukaan sementum gigi
merupakan permukaan terakhir yang diresorpsi osteoklast. LPS bakteri plak gigi akan
merangsang sel seperti makrofag dan fibroblast untuk memproduksi mediator seperti
IL-1, PGE-2 dan TNF-alpha. Mediator ini menghambat proses diferensiasi osteoblast,
menghambat produksi mediator sel osteoblast dan menghambat produksi matriks
ekstraseluler dan proses kalsifikasi. Akibatnya, jumlah maupun fungsi osteoblast
semakin menurun, meningkatkan diferensiasi osteoklast dan aktivitas osteoklast. Hal ini
berakibat derajat kerusakan tulang tidak dapat diimbangi oleh proses remodeling oleh
osteoblast.

BAB 4
KESIMPULAN
1. Kadar matriks metalloproteinase-8 dan -9 dalam cairan sulkus gingiva yang
ditentukan melalui uji sandwich ELISA ditemukan lebih tinggi pada
periodontitis.
2. Kadar matriks metalloproteinase-8 dan -9 dalam cairan sulkus gingiva dapat
menjadi biomarker adanya penyakit periodontal dan membantu deteksi awal
periodontitis.

DAFTAR PUSTAKA
Apajalahti S. 2004. Short Root Anomaly (SRA) Prevalence and Phenotypic Features in
families- with Emphasis on matrix Metalloproteinases in Gingival Crevicular
Fluid of SRA and Orthodontic Patients. Academic dissertation. Institute of
Dentistry Departement of Pedodontics and Orthodontics, University of Helsinki,
Finland.
Avellan NL et al. 2005. Painful tooth Stimulation Elevates Matrix Metalliproteinase-8
Levels Locally in Human Gingival Crevicular Fluid. Journal of Dental Research;
Apr 2005; 84,4; ProQuest pg. 335.
Baker, G.B, S. Dunn & A. Latja. 2007. Handbook of neurochemistry and molecular
neurobiology: Practical nerochemistry methods, vol. 6. Springer Science,
New York..
Crowther, J.R. 1995. ELISA: Theory and practice.Humana Press, New Jersey.
Elley BM, Soory M, Manson JD. 2010. Periodontics. Sixth edition. Toronto. Churchill
Livingstone. Elsevier.
Gendron R,Grevier D, Sorsa T, Mayrand D. 1999. Inhibition of the activities of
MMP2,8 and 9 by chlorhexidine. Clin Diag Lab Immuno.6(3); 431-9.
Graber, Vanarsdall, Vig. 2000. Orthodontics- current principles and techniques. 4th ed.
Elsivier Mosby. Misouri.
Kerrigan JJ,Mansell Jp, Sandy JR.2000. Matriks turnover. J Orthod 2000;27 (3):227-33.
Kinney JS, Ramshiera Ca, Giannobile WV. 2007.Oral fluid-based biomarkers of
alveolar bone loss in periodontitis. Ann N Y Acad Sci; 1098:230-51.
Meeran NA.2011. The role of gingival cevicular fluid in orthodontic tooth movement- a
review. SRM University Journal of Dental Sciences. Vol 2(2). P129-133.
Nagase H,Visse R, Murphy G.2006. structure and function of matrix metalloproteinase
and TIMP. Cardiovascular Res.69(3).562-70.
Palosaari H, Walgren j, Larmas M, ronka H. 2000. The expression of MMP-8 in hman
odontoblast and dental pulp cells is down regulated by TGF-beta 1. J Dent Rest;
79:77-84.
Rao, K. 2001. Encyclopedia of life sciences. Nature publishing group, New Delhi.
Sasano Y, Jing-Xu Z, Tsubota M. 2002. Gene expression of MMP-8 and MMP-13
during embryonic development of bone and cartilago in the rat mandibula and
hind limb. J Histochem Cytochem 2002; 50 (30).
Sodek, McKee. 2000. Molecular and Cellular biology of Alveolar Bone.
Periodontology 2000.24. p 99-126.
Uitto VJ. 2003. Gingival crevice fluid- an introduction. Periodontology 2000.
Vol.31.2003.9-11.
Velasco G, Pendas AM, Fueyo A, Knauper V, Murphy G, Lopez-Otin C. 1992. Cloning
and characterization of human MMP-23, a new matrix metalloproteinase
predominantly expressed in reproductive tissues and lacking conserved domains
in other family member. J Biol Chem 1992;267:9612-8.
Waddington RJ, Emberry G. 2001. Proteoglycans and orthodontics tooth movement. J
orthod. 28;281-90.