Hand out praktikum mikrobiologi

No 1 Percobaan
Isolasi bakteri

Tujuan
Mampu mengisolasi bakteri

Obyek
Sample dari sela-sela gigi

Cara
1.cawan gores 2.cawan sebar

Catatan
Langsung menggunakan media padat (Mueler Hinton) lalu media cair Kontrol hasil lihat LCD Hasil sesungguhnya difoto

Identifikasi bakteri

Mampu mengidentifikasi bakteri

1. Staphylococcus aureus 2. Enterobakteri

Angka kuman

Mampu menghitung konsentrasi kuman dalam larutan sampel Mampu mensterilkan dan menghitung konsentrasi ekstrak

Limbah cair atau minuman jalanan (bawa sendiri) Ekstrak : rebusan daun sirih/ rimpang jahe/ kunir putih/ temu giring Sterilisasi : tabung, blue tip, yellow tip E.c. S.a. C.a. E.c. S.a. C.a.

1. Cat Gram untuk S.a dan E.c. 2. Biokimia : a. MSA untuk S.a. b. KIA, LIA, MIO, SSS untuk Enterobakteri Pengenceran (5 deret)

Sterilisasi dan preparasi ekstrak

Direbus 50 gram dalam 200 ml air selama 10 menit sejak mendidih Sterilisasi dg autoklaf Media cair Media padat

Dihitung pada hasil pengenceran yg dapat dihitung jumlah koloninya Berat dan volume bias diubah.

5. 6.

Uji aktivitas anti mikroba Uji aktivitas anti mikroba

Percobaan 1. Isolasi Bakteri Isolasi bakteri dilakukan dengan metode cawan gores dan cawan sebar. Caranya sebagai berikut : Sampel/bahan yang akan diisolasi bakterinya disuspensikan ke dalam tabung reaksi steril yang berisi larutan NaCl 0,9% steril sebanyak 1 ml, lalu ujung tabung disentuhkan api, ditutup dengan kapas steril dan digojog pelan sampai merata, disebut suspensi sampel. Metode cawan gores : a. Diambil 1 ose, digoreskan di media Agar Mueller Hinton. (lihat animasi). Catatan : goresan tidak sampai merusak Agar. b. Cawan diinkubasi pada suhu 37C selama 18-24 jam. c. Gambar/potretlah hasil inkubasinya. Kalau gambar harus diwarnai. d. Ambil 1 koloni dengan ose dan dikultur pada media BHI cair, inkubasi 18-24 jam e. Gambar/potretlah hasil inkubasinya. Kalau gambar harus diwarnai. f. Biakan murni tersebut (isolat) kemudian dipelihara pada media padat yang sesuai . (tidak dilakukan di praktikum) Metode cawan sebar: a. Kapas lidi steril dicelupkan pada suspensi sampel, lalu diperas di dinding tabung dan diusapkan di atas media Agar Mueller Hinton. (Dapat juga menggunakan spreader, tetapi belum disediakan di lab) b. Langkah b,c,d,e dan f sama dengan metode cawan gores. Tabel keperluan alat dan bahan untuk setiap kelompok percobaan Percobaan : Alat dan Bahan 1. Isolasi bakteri Tabung Reaksi Steril berisi BHI cair 2 ml Tabung Reaksi Steril berisi Larutan NaCl 0,9% Steril 1 ml (jaga2 2 ml juga) Plate Agar Mueller Hinton Kapas lidi steril Lampu Bunsen Tusuk gigi steril Sprayer alkohol Kapas secukupnya 2. Identifikasi bakteri Obyek glass Tabung isolat S. aureus Tabung isolat E. coli Tabung isolat Shigella Tabung media KIA Tabung media LIA Jumlah 2 1 2 1 1 1 1 2 1 1 1 2 2

Tabung media MIO Tabung media SSS Tabung media MSA Botol berpipet berisi Cat gram A,B,C,D @ 10 ml Mikroskop LCD (print out control hasil identifikasi biokimia untuk E. Coli, Shigella, dan S.aureus) Ose lancip Ose bulat Lampu spiritus Kapas secukupnya Sprayer alkohol 3. Pemeriksaan angka kuman Tabung reaksi berisi NaCl 0,9% steril 4,5 ml Plate Mueller Hinton Pipet tetes (berskala 0,5 dan 1) Penghitung (counter) 4. Sterilisasi Mikropipet Lampu Bunsen Beaker glass 100 ml Kompor listrik Labu takar 50 ml (untuk meng-ad-kan rebusan) Pengaduk Kertas saring Sampel empon-empon 10 gram (bawa sendiri, ditimbang di lab) Label Selotip Erlenmeyer 100 ml Tabung Reaksi Steril kosong Elenmeyer 50 ml berisi akuades 20 ml Tabung reaksi berisi media BHI steril 1 ml Tabung reaksi berisi BHI DS steril 5 ml Tabung reaksi berisi CYG steril 5 ml Tabung reaksi berisi CYG steril 5 ml Tabung reaksi (erlenmeyer) berisi larutan sampel Erlenmeyer berisi NaCl 0,9% 25 ml Blue tip Yellow tip Tabung Reaksi Steril berisi BHI cair 2 ml Tabung Reaksi Steril berisi Larutan NaCl 0,9%

2 2 1 2 set 1 1 1 1 1 1 4 4 5 1 1 1 1 1 1 1 1

Yang disterilkan : (persiapan perc 4)

1 8 1 1 1 1 1 1 1 5 5 2 1

(persiapan perc 1)

Steril 1 ml (jaga2 2 ml juga) Kapas lidi steril Tusuk gigi steril (persiapan perc 2) Ose lancip Ose bulat (persiapan perc 3) Tabung reaksi Erlenmeyer berisi NaCl 0,9% 25 ml Pipet tetes (berskala 0,5 dan 1)

1 1 1 1 4 1 5

Percobaan 5 dan 6. Uji aktivitas antibakteri Pengukuran aktivitas secara mikrobiologi dapat dilakukan dengan beberapa cara, antara lain : 1) Metode Dilusi Ada dua macam metode dilusi yaitu metode dilusi cair (Metode Macro Broth Dillution) dan metode dilusi padat (Metode agar dilusi). Pada dilusi cair, masing-masing konsentrasi obat ditambah suspensi bakteri, sedangkan dalam dilusi padat tiap konsentrasi dicampur dengan media agar lalu ditanam bakteri, diinkubasi selama 24 jam. Kegunaan dari metode dilusi ini adalah untuk mencari KHM (Kadar Hambat Minimum) yaitu kadar obat terendah yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri. 2) Metode Difusi a) Cara Kirby Bauer Beberapa koloni kuman dari pertumbuhan 24 jam pada agar diambil, disuspensikan ke dalam 0,5 ml BHI cair, diinkubasikan 48 jam pada 37C. Suspensi ditambah aquadest steril hingga kekeruhan tertentu sesuai dengan standar konsentrasi bakteri 108 CFU per ml. Kapas lidi dicelupkan dalam suspensi bakteri lalu ditekantekan pada permukaan media agar selanjutnya diletakkan kertas samir (disk) yang mengandung antibiotik di atasnya, diinkubasi pada suhu 37C selama 24 jam. b) Cara Sumuran Seperti cara Kirby Bauer, setelah dioleskan bakteri pada media agar dibuat sumuran dengan garis tengah tertentu dan ke dalam sumuran diberi larutan antibakteri dan diinkubasikan pada suhu 37C selama 18-24 jam. c) Poor Plate Diambil suspensi bakteri satu ose dimasukkan ke dalam 4 ml agar base 1,5% yang mempunyai temperatur 50oC setelah suspensi homogen dituang pada media Mueller hinton ditunggu sebentar sampai agar tersebut membeku, diletakkan disk diatas media, diinkubasi 15 20 jam dengan temperatur 37oC, interprestasikan hasilnya sesuai standar antibiotika untuk masing-masing bakteri (Anonim, 1994). Pembacaan hasil dapat dilakukan dengan cara mengukur : (1) Zona radikal yaitu suatu daerah di sekitar disk dimana sama sekali tidak ada pertumbuhan bakteri. (2) Zona irradikal yaitu suatu daerah di sekitar disk yang pertumbuhan bakterinya dihambat tetapi tidak dimatikan (Anonim, 1993).

Contoh hasil uji aktivitas terhadap S. aureus dengan metode dilusi cair :

(a) Tabel Hasil Uji aktivitas anti bakteri pada media cair Keterangan Cuplikan I. Kontrol bakteri Konsentrasi 5% v/v II. Kontrol pelarut Konsentrasi 7,5% v/v III. Kontrol filtrat Konsentrasi 10% v/v IV. Kontrol media Konsentrasi 12,5% v/v Konsentrasi 15% v/v Konsentrasi 17,5% v/v Keterangan : Jernih (J) atau Keruh (K)

(b)

Gambar Hasil uji aktivitas terhadap S. aureus pada media cair untuk penetapan KHM

Keterangan K K J J

Kesimpulan : Kadar Hambat Minimum (KHM) = .............. (konsentrasi terkecil yang jernih)

a)

(b)

Gambar Hasil uji aktivitas terhadap S. aureus pada media padat untuk penentuan KBM

Tabel hasil uji aktivitas terhadap S. aureus pada media padat untuk penentuan KBM Keterangan Cuplikan Keterangan I. Kontrol bakteri Konsentrasi 5% v/v + v II. Kontrol pelarut Konsentrasi 7,5% /v + III. Kontrol filtrat Konsentrasi 10% v/v + v IV. Kontrol media Konsentrasi 12,5% /v v Konsentrasi 15% /v Konsentrasi 17,5% v/v Keterangan : Ada (tumbuh) koloni (+) atau Tidak ada koloni (-) Kesimpulan : Kadar Bunuh Minimum (KBM) = .............. (kadar terkecil yang tidak tumbuh koloni)

Uji aktivitas antimikroba Yang dilakukan pada praktikum : Sampel mikroba : Staphylococcus aureus (untuk kelompok- 1 dan 4) Escherichia coli (untuk kelompok- 2 dan 5) Candida albicans (untuk kelompok- 3 dan 6) 1. Pembuatan stok bakteri : Satu ose bakteri dari stok disuspensikan ke dalam 2 ml media BHI Inkubasi pada suhu 37C, selama 3-5 jam (krn waktu terbatas, dilakukan 1 jam saja) Diambil 200 l, diencerkan dengan NaCl 0,9% steril , hingga kekeruhan sama dg standar Mc Farland (108 CFU/ml) Suspensi bakteri 108 CFU/ml diencerkan menjadi 106 CFU/ml dengan BHI DS Suspensi bakteri 2. Pemeriksaan aktivitas antibakteri (metode dilusi cair) a. Persiapan tabung uji : Disiapkan 8 tabung reaksi steril (4 untuk kontrol dan 4 lagi untuk cuplikan) : 1) 2) bakteri 3) bakteri 4) 5) bakteri) 6) pelarut) 7) sampel) 8) Tabung I diisi 0,5 ml filtrat 50% v/v dan 0,5 ml suspensi bakteri Tabung II diisi 0,5 ml filtrat 25% v/v dan 0,5 ml suspensi Tabung III diisi 0,5 ml filtrat 12,5% v/v dan 0,5 ml suspensi Tabung IV diisi 0,5 ml filtrat 6,25% v/v dan 0,5 ml suspensi bakteri Tabung V diisi 0,5 ml BHI dan 0,5 ml suspensi bakteri (kontrol Tabung VI diisi 0,5 ml BHI dan 0,5 ml aquadest steril (kontrol Tabung VII diisi 0,5 ml filtrat 50 % v/v dan 0,5 ml BHI (kontrol Tabung VIII diisi 1 ml media BHI (kontrol media)

b. Semua tabung uji diinkubasi pada temperatur 37C selama 18-24 jam lalu dilihat adanya kekeruhan dengan cara membandingkan dengan kontrol untuk menetapkan KHM. c. Kemudian percobaan dilanjutkan dengan menggoreskan sampel dari masing-masing tabung pada media Agar. Media yang digunakan adalah media Agar Darah (Staphylococcus aureus) dan Mc Conkey (Escherichia coli). Konsentrasi filtrat terkecil yang tidak terjadi pertumbuhan pada media dinyatakan sebagai KBM.

0,5 ml suspensi bakteri dimasukkan dalam tabung yang telah berisi 0,5 ml sampel dalam berbagai konsentrasi

Diinkubasi pada suhu 37 C selama 24 jam

KHM dibaca dengan melihat kejernihan larutan dibandingkan dengan tabung kontrol

Tiap tabung digores di media agar (Media agar darah untuk Staphylococcus aureus dan Media Mc Conkey untuk Escherichia coli)

Diinkubasi pada suhu 37C selama 18-24 jam

KBM dibaca dengan melihat tumbuh tidaknya bakteri dalam media agar dan dibandingkan kontrol

Gambar Skema Uji Aktivitas Antibakteri dengan Metode Dilusi Cair

Catatan : untuk Jamur Candida albicans digunakan media cair CYG (sebagai pengganti BHI) dan media padat SDA (Sabouroud Dextrose Agar)

Tabel keperluan alat dan bahan untuk setiap kelompok percobaan Percobaan : Alat dan Bahan Jumlah 5. Uji aktivitas Tabung Reaksi Steril kosong 8x3 anti mikroba Tabung reaksi berisi akuades steril 6 ml 1x 3 Tabung reaksi berisi media BHI steril 1 ml 1x3 Tabung reaksi berisi BHI DS steril 5 ml 1x3 Tabung reaksi berisi CYG steril 5 ml 1x3 Tabung reaksi berisi CYG steril 5 ml 1x3 Tabung reaksi (erlenmeyer) berisi larutan sampel 1x3 Rak tabung 1x3 Tabung reaksi berisi 1 ml suspensi Staphylococcus 1 aureus (kel 1 dan 3) Tabung reaksi berisi 1 ml suspensi Escherichia coli 1 (kel 2 dan 5) Tabung reaksi berisi 1 ml suspensi Candida albicans 1 (kel 3 dan 6) Media Mc. Conkey 1 Media agar darah 1 Media SDA 1 Blue tip 5x3 Yellow tip 5x3 Mikropipet 1 Lampu Bunsen 1x3