1.

uji eksoenzim
amilolitik
Karbohidrat akan dipecah menjadi asam, gas, dan produk-produk lainnya. Pemecahan gula bersifat spesifik
untuk mikroorganisme tertentu, contohnya glukosa, laktosa, dan sukrosa akan dipecah menjadi asam dan gas
oleh bakteri Enterobacter aerogenes, Staphylococcuc aureus akan memecah gula-gula tersebut menjadi asam,
sedangkan bakteri Alcaligenes faecalis tidak akan menghasilkan asam dan gas.
Amilolitik merupakan aktivitas bakteri dalam merombak pati dengan bantuan enzim amilase. Enzim amilase
adalah enzim yang mampu menghidrolisis pati menjadi senyawa lebih sederhana seperti maltosa dan glukosa.
Enzim ini dapat memecah atau menghidrolisis pati, glikogen, dan turunan polisakarida dengan cara memecah
ikatan glikosidiknya. Enzim amilase dibedakan menjadi 3 golongan yaitu -amilase yang di sebut juga
endoamilase, -amilase yang di sebut juga eksoamilase, dan glukoaminase (Rehm & Reed 1987 Uji amilolitik
dilakukan dengan cara bakteri Bacillus dan E. coli diinokulasikan pada media Nutrient Agar yang mengandung pati
secara streak. Bakteri yang telah diinokulasikan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37C. Setelah selesai
inkubasi, cawan diteteskan dengan iodin secukupnya sehingga seluruh permukaan media terkena iodin. Hidrolisis
zat pati terlihat sebagai zona jernih di sekeliling koloni, sedangkan hasil negatif ditunjukkan warna sekitar koloni
tetap biru hitam
Pada media yang mengandung pati, maka pati di sekitar pertumbuhan bakteri akan dihidrolisis oleh enzim
amilase yang dihasilkan bakteri. Jika zat pati dihidrolisis, maka pada media agar yang diteteskan larutan yodium
akan timbul daerah transparan di sekitar pertumbuhan bakteri. Sebaliknya, jika pati tidak dihidrolisis, maka akan
timbul warna biru-kehitaman di sekitar pertumbuhan (Lay, 1994).
Media yang biasa digunakan pada uji hidrolisis karbohidrat adalah media Starch Agar (SA) yang mengandung
tripton, ekstrak khamir, K2HPO4, pati terlarut, agar, dan air. Ekstrak khamir sebagai sumber vitamin B kompleks,
tripton dipakai untuk menyediakan nitrogen, karbohidrat, dan garam mineral, air untuk menyalurkan nutrient
yang dibutuhkan mikroba, sedangkan pati berfungsi sebagai komponen karbohidrat yang akan dihidrolisis pada
uji ini (Fardiaz, 1992).

Wilis Ari Setyati* dan Subagiyo 2012

Isolasi dan Seleksi Bakteri Penghasil Enzim Ekstraseluler (proteolitik, amilolitik,

lipolitik dan selulolitik) yang Berasal dari Sedimen Kawasan Mangrove
Vol. 17 (3) 164-168

Hasil
Contoh
jenis yang mempunyai spesies bersifat Amilolitik misalnya Clostridium butyricium dan Bacillus
subtilis (Fardiaz, 1992).

Proteolitik
- Media

Bakteri proteolitik adalah bakteri yang memproduksi enzim protease ekstraseluler, yaitu enzim pemecah
protein yang diproduksi di dalam sel kemudian dilepaskan keluar dari sel. Semua bakteri mempunyai
enzim protease di dalam sel, tetapi tidak semua mempunyai enzim protease ekstraseluler. enzim protease
ini berfungsi untuk menghidrolisis ikatan peptida di protein dan melepas asam amino (Volk dan Wheeler,
1993). Dekomposisi protein oleh mikroorganisme lebih kompleks daripada pemecahan karbohidrat dan
produk akhirnya juga lebih bervariasi. Hal ini disebabkan struktur protein yang lebih kompleks.
Mikroorganisme melalui suatu sistem enzim yang kompleks, memecah protein menjadi senyawasenyawa yang lebih sederhana yaitu asam amino (Durham 1987).
Ada tiga macam bakteri proteolitik, yaitu:
a. Bakteri aerobik atau anaerobik fakultatif yang tidak membentuk spora, contohnya Proteus dan
Pseudomonas.
b. Bakteri aerobik dan anerobik fakultatif pembentuk spora, contohnya Bacillus.
c. Bakteri anaerobik pembentuk spora, contohnya beberapa Clostridium.
Ada bakteri yang bersifat proteolitik asam yang dapat menghidrolisis protein dan memfermentasi asam,
contohnya Streptococcus faecalis dan ada juga bakteri yang bersifat putrefaktif yang memecah protein secara
anaerobik dan menghasilkan senyawa berbau busuk, contohnya Pseudomonas (Fardiaz, 1992).
Media untuk uji hidrolisis protein adalah media SMA (Skim Milk Agar) yang tersusun dari tripton, dekstrosa,
ekstrak khamir, agar, air destilata, dan 20% susu skim bubuk. Biasanya media ini dapat bekerja pada pH netral,
yaitu pH 7. Tripton sebagai sumber sumber N dan mineral, ekstrak khamir sebagai sumber vitamin B kompleks,
dekstrosa sebagai sumber energi, sedangkan susu skim bubuk mengandung kasein yang akan dipecah pada uji
hidrolisis ini (Fardiaz, 1992).
Jika mikroorganisme memproduksi enzim protease maka daerah di sekitar koloni bakteri akan berwarna
jernih. Kejernihan ini akibat penguraian molekul protein menjadi asam amino yang larut di dalam media sehingga
kekeruhan di sekitar koloni bakteri menjadi hilang. (Lay, 1994).

Lipolitik
Lemak lebih sulit dipecah oleh mikrooganisme daripada karbohidrat dan protein sehingga hanya
mikrooganisme lipolitik yang menghasilkan enzim lipase saja yang dapat memecah lemak menjadi asamasam lemak bebas dan gliserol dengan bantuan air (Fardiaz, 1992), selanjutnya gliserol dimetabolisasi
melalui jalur EMP dan asam lemaknya diuraikan melalui asetat pada siklus asam sitrat (Volk dan Wheeler,
1993).

Jika lemak di dalam media dihidrolisis oleh enzim lipase, maka daerah di sekitar koloni bakteri menjadi
asam akibat terbentuknya asam lemak. Indikator pH yang ditambahkan ke dalam media akan membantu
menunjukkan adanya proses hidrolisis yang ditandai dengan perubahan warna (Lay, 1994).

Media NA (Nutrient Agar) merupakan media yang dipakai untuk hidrolisis lemak. Agar dapat digunakan untuk
menguji adanya mikroba lipolitik, maka pada media ini ditambahkan lemak 1%. Komponen-komponen media ini
adalah ekstrak sapi sebagai zat hara untuk menyediakan karbohidrat, nitrogen, vitamin, dan garam mineral,
pepton untuk mengontrol pH, agar, air untuk transportasi nutrient yang dibutuhkan bagi pertumbuhan mikroba,
dan merah netral sebagai indikator (Fardiaz, 1992).
Bakteri ini menghasilkan enzim lipase yang berfungsi sebagai katalis reaksi hidrolisis lemak menjadi asamasam lemak dan gliserol. Produk akhir dari hidrolisis lemak dapat dioksidasi lagi menjadi energi di dalam
kondisi aerob. Kebanyakan bakteri aerobik dan proteolitik aktif juga merupakan bakteri lipolitik. Contoh
bakteri lipolitik adalah Pseudomonas, Alcaligenes, Serratia, dan Micrococcus (Fardiaz, 1992).

2. IMViC
)

Indol

Tryptophan merupakan asam amino esensial yang dapat mengalami oksidasi dengan cara kegiatan enzimatik
beberapa bakteri. Konversi triptofan menjadi produk metabolik di mediasi oleh enzim Tryptophanase. Media ini
biasanya digunakan dalam indetifikasi yang cepat. Perbenihan indol digunakan untuk melihat kemampuan
bakteri mendegradasi asam amino triptofan secara enzimatik.
Bakteri Escherichia coli mampu menggunakan triptofan sebagai sumber karbon.
E.coli menghasilkan enzim triptofanase yang mengkatalisasikan penguraian gugus indol dari triptofan. Dalam
media biakan, indol menumpuk sebagai produk buangan, sedangkan bagian lainnya dari molekul triptofan (asam
piruvat dan NH4+) dapat digunakan untuk memenuhi kebutuhan zat hara mikroorganisme. Reagens bereaksi
dengan indol dan menghasilkan senyawa yang tidak larut dalam air dan berwarna merah pada permukaan
medium (Widyawati, 2012).

Hasil uji indol yang diperoleh negatif karena tidak terbentuk lapisan (cincin) berwarna merah muda pada
permukaan biakan, artinya bakteri ini tidak membentuk indol dari tryptopan sebagai sumber karbon, yang
dapat diketahui dengan menambahkan larutan kovaks. Asam amino triptofan merupakan komponen asam
amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh
mikroorganisme akibat penguraian protein(Volk dan Wheeler, 1993).
-

Uji indol
Uji indol digunakan untuk mengetahui apakah dalam proses pertumbuhannya bakteri dapat membentuk

indol dari asam amino esential triptofan. (Lay, 1994).

-

Uji MR-VR
Uji MR bertujuan untuk menentukan kemampuan mikroorganisme untuk mengoksidasi glukosa dan

menstabilkan konsentrasi asam yang tinngi sebagai produk akhir. Sedangkan uji VR untuk membedakan

kemampuan mikroorganisme untuk menghasilkan produk akhir non-asam atau netral seperti asetilmetilkarbonil
dari asam organik yang dihasilkan dari metabolisme glukosa. (Lay, 1994).
-

Uji Sitrat
Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme untuk menggunakan sitrat sebagai satu-

satunya sumber karbon dan energi. (Capuccino dan Sherman, 1992)

2)

MR-VP

Uji MR Perbenihan ini digunakan untuk mendeteksi bakteri yang memiliki kemampuan untuk mengoksidasi
glukosa menghasilkan produk asam berkonsentrasi tinggi yang stabil sehingga menyebabkan pH media
turun hingga dibawah 4,4 yang ditandai dengan hasil positif, terjadi perubahan warna menjadi merah setelah
ditambahkan Methyl Red. Artinya, bakteri ini mengahasilkan asam campuran (metilen glikon) dari proses
fermentasi glukosa yang terkandung dalam medium MR-VP (Lehninger, 1995).
3)

Uji VP

Dengan hasil negatif, karena tidak terbentuk warna merah pada medium setelah ditambahkan -napthol dan
KOH, artinya hasil akhir fermentasi bakteri inibukan asetil metil karbinol (asetolin) (Volk dan Wheeler, 1993).
4)

Simmons Citrate

Perbenihan ini digunakan untuk melihat kemampuan organisme enterik berdasarkan kemampuan
memfermentasi sitrat sebagai sumber karbon. Perbenihan Simmons Citrate ini mengandung indikator biru
bromtimol yang akan berubah menjadi biru pada reaksi positif dan tetap hijau jika reaksi negatif (Volk dan
Wheeler, 1993).

a. Uji Indol
b. Uji Merah Metil (Methyl Red)
Uji merah metil digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam campuran. Beberapa bakteri
memfermentasikan glukosa dan menghasilkan berbagai produk yang bersifat asam sehingga akan
menurunkan pH media pertumbuhannya menjadi 5,0 atau lebih rendah. Penambahan indikator pH merah
metil dapat menunjukkan adanya perubahan pH menjadi asam. Merah metal berwarna merah pada
lingkungan dengan pH 4,4 dan berwarna kuning dalam lingkungan dengan pH 6,2 (Widyawati, 2012).
c. Uji Voges-Proskauer
Uji ini digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme yang memfermentasi karbohidrat menjadi 2,3butanadiol sebagai produk utama, akan terjadi penumpukan bahan tersebut dalam media pertumbuhan. Pada
penambahan KOH, adanya asetoin ditunjukan adanya perubahan warna menjadi merah muda. Perubahan
warna ini diperjelas dengan penambahan larutan alfa-naftol (Widyawati, 2012).
d. Uji Sitrat

Uji Sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme menggunakan sitrat sebagai satu-satunya
sumber karbon dan energi. Untuk uji ini dapat digunakan medium sitrat-Koser berupa medium cair atau
medium sitrat- Simmons berupa medium padat. Simmons citrate agar merupakan medium sintetik dengan Na
sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon, NH4+ sebagai sumber N dan Brom Thymol Blue sebagai indikator
pH, sedangkan medium sitrat-Koser tidak mengandung indikator. Bila mikroorganisme mampu menggunakan

sitrat, maka asam akan dihilangkan dari medium biakan, sehingga menyebabkan peningkatan pH dan
mengubah warna medium dari hijau menjadi biru. Terjadinya perubahan warna dari hijau menjadi biru
menunjukan bahwa mikroorganisme mampu menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon.
Sedangkan pada medium sitrat-Koser kemampuan menggunakan sitrat
ditunjukkan oleh kekeruhan yang menandakan adanya pertumbuhan (Widyawati, 2012).

3. OF
Oksidasi
- Media
- Proses
- Hasil
- Contoh
Fermentatif
- Media
- Proses
- Hasil
- Contoh