Hari/tanggal

Materi

: Pembuatan sediaan darah dan pewarnaan sediaan darah untuk pemeriksaan

malaria secara mikroskopis

Tujuan

: Mengetahui cara pembuatan sediaan darah dan pewarnaannya untuk

pemeriksaan malaria secara mikroskopis

Metode

: Sediaan darah tipis dan tebal, serta pewarnaan polikromatis dengan Giemsa

Dasar Teori:
Penyakit Malaria merupakan penyakit infeksi dengan kematian sekitar 1 juta orang/tahun.
Disebabkan oleh parasit jenis protozoa dari golongan/genus Plasmodium. Dari genus
Plasmodium terdapat 5 spesies yang ditemukan dapat menyebabkan penyakit pada manusia
yaitu Plasmodium falciparumI, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale,
dan yang terbaru Plasmodium knowlesi. Plasmodium falciparumI dan Plasmodium vivax
merupakan yang paling sering ditemukan, sedangkan Plasmodium malariae dan Plasmodium
ovale dijumpai pada indonesia bagian timur. Plasmodium knowlesi merupakan parasit malaria
baru yang ditemukan ternyata bisa menginfeksi manusia yang mana asalnya menginfeksi
kera.
Salah satu cara untuk mendiagnosis adanya penyakit malaria adalah dengan menemukan
parasit malaria dalam darah melalui pemeriksaan sediaan darah tebal dan tipis. Keuntungan
dari sediaan darah tebal adalah parasit mudah ditemukan karena sediaannya lebih tebal, tetapi
sediaan ini tidak baik untuk identifikasi spesies Plasmodium sp. Sediaan darah tipis untuk
identifikasi parasit karena morfologi yang ada lebih bagus dibandingkan sediaan darah tebal
yang tidak difiksasi, tetapi penyebaran sel selnya lebih sedikit maka parasit yang ditemukan
lebih sedikit dibandingkan sediaan darah tebal.

Alat dan Bahan:

Objeck glass
Blood Lancet
Autoclick
Kapas Kering
Kapas Alkohol
Methanol
Cat stok Giemsa
Buffer fosfat 7,2
Pipet tetes

Beaker gelas
Tissue
Mikroskop
Rak pewarnaan
Air bersih

Cara Kerja:
1. Sediaan Darah
a. Pegang tangan pasien dengan telapak menghadap keatas dan pilihlah jari manis
untuk dilakukan penusukan.
b. Bersihkan jari manis dengan kapas alkohol 70%. Gesek dengan kuat kapas
alkohol untuk menghilangkan minyak dan kotoran pada permukaan jari manis
c. Biarkan alkohol mengering. Sementara itu jari disekitar tempat yang telah
dialkoholi dapat dipijat dan dielus untuk melancarkan peredaran darah.
d. Dengan lancet steril, tusuk kulit jari manis yang telah dialkoholi tadi dengan
tusukan yang cepat. Jika menggunakan bantuan autoclick, tarik pegas autoclick,
tempelkan lubang tusuk pada kulit dan tekan pelatuk untuk meluncurkan lancet.
e. Tekan perlahan jari manis tadi untuk mengeluarkan darah, hapus darah pertama
yang keluar dengan kapas kering. Pastikan tidak ada serabut kapas yang tertempel
pada kulit.
f. Tekan lagi jari manis, ambil kaca slide dan tempelkan kaca slide pada darah di
bagian tengah kaca slide untuk mendapatkan darah sebesar . Ini untuk apusan
darah tipis. Tekan lagi jari manis untuk mendapatkan banyak darah dan tempelkan
3 tetes darah sedikit debih jauh dari tetesan pertama untuk apusan darah tebal.
Putar kaca slide sehingga tetesan darah tadi menghadap keatas
g. Buat apusan darah tipis dengan mengambil kaca slide lain yang bersih sebagai
pengapus. Tarik 1 tetes darah di tenga slide tadi dengan kaca pengapus dan
membuat sudut 45 derajat. Biarkan darah menyebar sepanjang sisi kaca pengapus
lalu dorong dengan cepat kaca pengapus untuk menyebarkan darah membentuk
lapisan tipis nyaris transparan.
h. Buat apusan darah tebal dengan meratakan 3 tetes darah pada sisi kaca slide
membentuk lingkaran berdiameter 1 cm menggunakan sudut dari kaca pengapus
yang berlawanan dengan sisi yang digunakan untuk mengapus darah pada sediaan
darah tipis
i. Biarkan apusan mengering. Apusan dilabeli. Setelah kering apusan diwarnai
dengan pewarnaan Giemsa.
2. Pewarnaan Sediaan
a. Siapkan cat Giemsa dari cat stok Giemsa dengan mengencerkannya sampai 3%
atau 10%. Hasil paling bagus adalah dengan Giemsa 3% namun perlu waktu lama
sehingga cocok untuk digunakan dalam penelitian dan survei atau pengerjaan
sampel sekaligus banyak. 10% Giemsa digunakan jika perlu pemeriksaan cepat.
Encerkan 3 tetes Giemsa stok dalam 1 ml Buffer untuk membuat Giemsa 10%

dan 3 ml Giemsa stok dalam 97 ml Buffer untuk 3%. Setiap slide perlu paling
tidak 3 ml Giemsa.
b. Fiksasi hapusan darah tipis dengan mengalirkan methanol absolut pada hapusan
tanpa mengenai hapusan darah tebal, bisa juga dilakukan dengan menotolnotolkan kapas yang direndam dalam methanol
c. Letakkan slide pada rak pewarnaan dan genangi dengan Giemsa 10% selama 8-10
menit atau selama 45-60 menit untuk Giemsa 3%
d. Bilas cat dengan menambahkan tetes demi tetes air bersih untuk mengangkat
semacam kotoran kehijauan mengapung diatas cat. Setelah kotoran kehijauan tadi
hilang, lalu cuci perlahan dengan mengalirkan air dari botol semprot ke sediaan
secara perlahan atau dengan mencelup-celupkannya pada wadah berisi air.
e. Keringkan slide
f. Sediaan bisa disimpan atau diperiksa dibawah mikroskop
3. Pemeriksaan dibawah Mikroskop
a. Atur pencahayaan mikroskop pada tingkat maksimum
b. Turunkan panggung mekanik atau naikkan lensa dengan memutar makro agar
lensa jauh dari panggung.
c. Letakkan kaca slide pada panggung dengan apusan menghadap keatas. jepit
dengan menggunakan penjepit.
d. Putar revolver dan pilih lensa objektif perbesaran 100x.
e. Tetesi setetes minyak imersi pada slide
f. Putar makro sampai lensa objektif perbesaran 100x menyentuh minyak imersi,
terus naikkan sampai lensa objektif nyaris menyentuh sediaan (tidak tepat
menyentuh)
g. Lihat ke lensa okuler, putar makro dan mikro untuk memfokuskan perbesaran
sampai apa yang ada dalam slide terlihat jelas. Atur juga pencahayaan sampai
nyaman dan jelas untuk dilihat dengan mengatur pembukaan diafragma
h. Amati penampakan yang terlihat pada mikroskop