Pasca panen pengendalian biologis busuk pahit apel oleh Actinomycetes yang

ditanggung tanah dan identifikasi molekuler antagonis aktif

ABSTRAK
Apel busuk pahit adalah buah busuk yang merusak apel di seluruh dunia. Karena
kemajuan pascapanen baru-baru ini
Pengendalian biologis sebagai alternatif ramah lingkungan dan berpotensi fungisida,
penelitian ini dievaluasi
Aktivitas antagonis lebih dari 100 aktinomisetes terisolasi dari tanah apel dari
Kerman
Kota (Iran) melawan agen penyebab penyakit ini. Bioassay in vitro mengungkapkan
bahwa enam dari isolat tersebut memiliki
Efek penghambatan yang signifikan terhadap pertumbuhan miselium patogen.
Pascapanen in vivo
Percobaan dilakukan dengan aplikasi langsung spora antagonis dan tikar miselia
Suspensi ekstrak kasar mereka. Hasil statistik menunjukkan bahwa antagonis
menghambat pembusukan apel
Buah (p <0,01) baik dengan penghambatan onset penyakit atau mencegah
bentangan lebih lanjut dari buah yang sakit -
Lesi. Identifikasi molekuler antagonis yang dilakukan berdasarkan urutan nukleotida
16S rDNA,
Dan diidentifikasikan sebagai Amycolatopsis sp. Penelitian ini merupakan langkah
awal menuju produksi sebuah
Produk biokontrol ramah lingkungan yang berlaku. Evaluasi pasca panen skala besar
di masa depan akan mengungkapkan hal tersebut
kemungkinan.

INTRODUTION
Penyakit pascapanen buah-buahan menghasilkan banyak posthar-
Kerugian rampasan mencapai 20-25% selama transportasi di Indonesia
Negara maju (El-Ghaouth et al., 2004; Droby, 2006; Zhu,
2006; Ippolito dan Nigro, 2000) dan lebih banyak lagi yang mengembangkannya.
Sayangnya, dalam beberapa dekade terakhir, penggunaan fungisida sintetis
Telah menjadi pilihan utama untuk mengurangi kerugian pasca panen
Memenuhi tuntutan pangan untuk populasi dunia yang terus meningkat
(Kelman, 1989). Bersamaan dengan itu, meningkatnya kendala pada
Penerapan fungisida, termasuk efek samping yang dirasakannya
Kesehatan manusia dan lingkungan serta perkembangan
Strain patogen pasca-panen yang fungisida, memerlukan
Pengembangan alternatif yang lebih efisien dan lebih aman, terutama
Kontrol biologis (Droby, 2006; Sharma et al., 2009; Janisiewicz
Dan Korsten, 2002; Tripathi dan Dubey, 2003; Ray et al., 2011). Di
Selain itu, pengendalian biologis penyakit pasca panen (BCPD) berlaku
Kelebihan kelayakan dan efektivitas biaya yang terkendali
Dan kondisi penyimpanan terbatas (Wilson dan Pusey, 1985; Sharma

Et al., 2009; Droby, 2006; Janisiewicz et al., 2003). Efektif

Antagonis mikroba telah ditemukan dan dalam beberapa kasus,
Berhasil dikomersialisasikan melawan patogen pasca panen utama
Dari buah yang berbeda (Janisiewicz dan Korsten, 2002; Janisiewicz et al.,
2003; Ray et al., 2011; Gholamnejad et al., 2009; Vinas et al., 1998).
BioSave, Aspire, Avogreen, YieldPlus, SHEMER dan Candifruit adalah
Produk yang tersedia secara komersial efektif terhadap pembantai yang disebabkan
oleh
Botrytis, Penicillium, Rhizopus, dan stroberi Aspergilluson,
Anggur, citrus dan pome fruitsthroughout dunia (Droby,
2006; Janisiewicz dan Korsten, 2002; Sharma et al., 2009;
Janisiewicz et al., 2003). Actinomycetes, sebagai biocontrol potensial
Agen phytopathogens, mewakili fraksi yang luar biasa dari
Biomassa mikroba tanah, yang menghasilkan sumber agro-
Senyawa aktif (Doumbou et al., 2002; Shimizu, 2011). Beberapa
Strain Actinomycetes telah ditemukan untuk melindungi tanaman
Berbagai jamur phytopathogenic oleh produksi jamur sel-
Dinding merendahkan-enzim, antijamur antibiotik, pertumbuhan tanaman
Promotor (Bressan, 2003; Doumbou et al., 2002; Eccleston
Et al., 2010; Trejo-Estrada et al., 1998; Yuan dan Crawford, 1995;
El-Tarabily dan Sivasithamparam, 2006; El-Tarabily et al., 2000;
Jorjandi et al., 2009). Ada beberapa peningkatan biologis
Kontrol patogen tanaman jamur dan bakteri oleh Actinomycetes
Spesies, yang telah mencapai pasar atau cenderung Berkembang secara komersial
di tahun-tahun mendatang (Doumbou et al., 2002;
Shimizu, 2011; Rugthaworn et al., 2007; Macagnan et al., 2008; El-
Tarabily dan Sivasithamparam, 2006; Prapagdee et al., 2008;
Gonzalez-Franco dan Hernandez, 2009).
Bitter membusuk dari apel, disebabkan oleh Glomerella cingulata (Stonem.)
Spauld. Dan Schrenk, anamorph: Colletotrichum gloeosporioides
(Penz.) Sacc., Adalah prekursor dan pasca panen yang berpotensi merusak
Penyakit di hampir semua negara tempat apel tumbuh
(Snowdon, 2010; Schubert, 1983; Boyd-Wilson et al., 2006). Sebelumnya
Untuk panen, infeksi demam pra-panen terbentuk sebagai kecil
Peluruhan buah di kebun buah-buahan menyebabkan terjadinya pembusukan besar
pada saat berikutnya
Penyimpanan (Gonzalez et al., 2006; Snowdon, 2010). Di bawah lembab dan
Kondisi panas, ketika tingkat inokulum infektif meningkat,
Membasahi buah sebelum penyimpanan dapat menyebabkan kontaminasi silang
Buah yang rusak dengan spora yang dilepaskan dari yang membusuk,
Sehingga menyebabkan peluruhan epidemi parah dalam penyimpanan (Janisiewicz
et al.,
2003). Di daerah lembab dan beriklim sedang, penyakit dapat menyebabkan hasil
panen
Kerugian setinggi 50% (Gonzalez dan Sutton, 2004). Penggunaan yang langka
Agen biokontrol termasuk Bacillus subtilis B-3, Metchnikowia
Pulcherrima T5-A2 dan beberapa isolat ragi lainnya untuk mengendalikan ini
Penyakit juga dilaporkan (Boyd-Wilson et al., 2006; Pusey
Dan Robins, 1991; Janisiewicz et al., 2003). Penelitian ini bertujuan
Untuk menentukan efek penghambatan Actinomycetes yang diisolasi dari tanah
Kebun buah apel pada saat pendirian dan perpanjangan getah pahit
Buah apel di gudang Lebih dari 100 isolat Actinomycetes keduanya
In vitro dan in vivo disaring untuk bioaktivitas yang dicari
Agen biokontrol yang efisien yang mampu menghambat atau memperlambat
Kemajuan penyakit dan melindungi pra-panen yang terkontaminasi
Buah apel melawan patogen selama periode pascapanen. Di
Periode penyimpanan yang panjang, melindungi hasil biokontrol yang aman
Agen dan bukan dengan penerapan fungisida protektif
Mengatasi kekhawatiran tentang residu fungisida yang baru diproduksi.
Comprehensive in vitro dan in vivo bioassay dilakukan pada
Memverifikasi beberapa aspek proses biokontrol yang terlibat dan
Sifat efek penghambatan sebagai langkah menuju berkelanjutan
Kontrol biologis.

. Bahan dan metode

2.1. Buah-buahan

Kultivar apel "Golden Delicious" digunakan dalam semua pengalaman-

. Buah segar (tidak ada penyimpanan sebelumnya) dipilih untuk seragam
Ukuran dan kedewasaan, tidak memiliki luka, bekas luka dan pembusukan di
permukaan.

2.2. Patogen

Isolat ganas dari minyak glikospora dari virulen diperoleh dari

Laboratorium Patologi Tumbuhan Balai Penelitian Pertanian,
Kementerian Pertanian, Kerman, Iran, dan dipelihara pada kentang-
Pelat Dextrose-Agar (PDA, Difco).

2.3. Antagonis

Sampel tanah rhizosfir acak dikumpulkan dari beberapa sampel

Kebun apel di provinsi Kerman, Iran, seperti yang dijelaskan oleh Lee dan
Hwang (2002). Sampel tanah diambil dari kedalaman 10-20 cm.
Tanah superfiks 10 cm dari permukaan tidak disertakan. Sampel
Dikeringkan dengan udara pada suhu sekitar 7-10 hari, dilewatkan
Melalui saringan mesh 0,8 mm, dan dipelihara dalam kantong polietilen
Pada suhu kamar sampai digunakan. Mengisolasi Actinomycetes, 10 g
Tanah disuspensikan dalam 90 mL air suling steril, terguncang
Secara menyeluruh selama 1 jam dan diijinkan untuk menetap selama 1 jam.
Selanjutnya, sepuluh-
Pengenceran berturut-turut berturut-turut (10 2-10 6) disiapkan secara steril
air sulingan. Aliquot (1 mL) 10 3-10 6 pengenceran tanah
Dituangkan ke dalam piring Kasein-Gliserin Agar diautoklaf (25 mL) di

50 C dengan tiga ulangan untuk setiap pengenceran. Pelat diinkubasi

Pada 28 C sampai 14 hari. Begitu muncul, koloni Actinomycetes
Diisolasi di piring CGA Petri, diinkubasi pada 28 C selama satu minggu
Dan disimpan di ruang berpendingin sebagai budaya stok sebelum digunakan.
Untuk studi skrining, lebih dari 100 isolat Actinomycete murni
Dikumpulkan (Aghighi et al., 2004).

2.4. Prosedur penyaringan dan bioassay antijamur in vitro

Untuk memeriksa aktivitas antijamur dari Actinomycetes yang terisolasi

Terhadap patogen, bioassay dilakukan melalui disk agar, dual
Budaya dan metode difusi yang baik seperti yang dijelaskan oleh Shahidi-Bonjar
(2004) dan Aghighi et al. (2004). Aktivitas antijamur dievaluasi
Dengan mengukur diameter zona hambatan (DIZ) disekitarnya
Disk agar aktinomycete. Tingkat penghambatan dalam dual culture
Dihitung melalui metode pemodifikasian modis Lee dan Hwang
(2002) dan El-Tarabily et al. (2000). Jarak (mm) jamur
Pertumbuhan menuju koloni antagonis (g) dikurangkan dari
Jari-jari pertumbuhan jamur (g) kultur kontrol untuk mendapatkan Dg = g g.
Dimana Dg: 5-9 mm, + (hambatan lemah); Dg: 10-19 mm, ++
(Penghambatan moderat); Dan Dg> 20 mm, +++ (penghambatan kuat).
2.5. Uji sensitivitas kloroform senyawa bioaktif

Mengevaluasi stabilitas prinsip bioaktif dalam bentuk non-polar

Pelarut seperti kloroform, suspensi spora (sekitar 106
Spora mL 1) masing-masing isolat terlihat (1 mL per spot) ke
Pelat CGA 15 mL. Pelat diinkubasi pada 28 C selama 3 hari. Kemudian,
Muncul koloni dibunuh dengan membuka piring yang tidak ditemukan
3 jam di atas gelas yang berisi 5 mL kloroform. Setelah itu,
Kacamata jam tangan dilepas dan piringnya diangin-anginkan dalam asap
Kerudung selama 30 menit untuk menghilangkan kloroform sisa. Mereka
Selanjutnya ditutup dengan 15 mL 1% agar air. Setelah
Solidi fi kasi, C. gloeosporioides berbudaya secara merata di atas
Permukaan agar-agar dan pelat diinkubasi pada 28 C selama 5-
7 hari. Tampilan atau kekurangan zona penghambatan pertumbuhan jamur
Isolat sekitarnya terlihat dinilai tahan kloroform
Atau pokok aktif yang sensitif). Tiga ulangan itu
Dipertimbangkan untuk masing-masing isolat (Davelos et al., 2004; Jorjandi dkk.,
2009).

2.6. Kultur terendam dan persiapan ekstrak kasar

Antagonis Actinomycete yang paling aktif tumbuh di
Budaya submerged media CG pada inkubator shaker di bawah
2,15 s 1 pada 28 C. Untuk memantau tren perubahan aktivitas versus
Waktu penyemaian pasca, sejumlah kecil limbah kultur diambil
Aseptik pada interval 24 jam selama 25 hari berturut-turut dan
Aktivitas dievaluasi dengan metode difusi yang baik (Aghighi et al.,
2004) dimana hari efek penghambatan maksimum terhadap
Patogen sudah ditentukan Untuk persiapan ekstrak kasar, sekitar
4-6 hari dari inokulasi (tergantung isolat) saat aktivitas
Mencapai kultur spora dan spora dan bebas miselia secara maksimal
Disiapkan oleh fi ltrasi melalui dua lapisan kain katun tipis. Itu
Kultur fi ltrate kemudian dibekukan-dikeringkan menjadi minyak mentah gelap (200
kPa,
40 C) dan disimpan didinginkan sebelum digunakan (Jorjandi et al., 2009).

2.7. Penentuan konsentrasi hambat minimum (MIC)

Untuk mengukur nilai MIC, konsentrasi serial dua kali lipat dari 50,
25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,562 dan 0,781 g L 1 dari ekstrak kasarnya adalah
Disiapkan dalam pelarut dimetil sulfoksida: metanol (1/1: v / v) (DM
Pelarut) dan aktivitas antijamur diuji dengan difusi baik
Metode (Jorjandi et al., 2009). Disini MIC mengacu pada yang terendah
Konsentrasi mampu menghambat setiap pertumbuhan jamur yang dapat diamati.
Semua data mewakili rata-rata tiga eksperimen yang direplikasi.

2.8. Jalur in vivo

Studi in vivo dilakukan dua berbeda

Prosedur.
2.8.1. Penerapan langsung antagonis
Eksperimen dilakukan secara statistik sama sekali
Rancangan acak (CRD) dengan 10 ulangan untuk setiap perlakuan.
Setelah desinfestasi permukaan (Zhou et al., 2001; He et al., 2003) of
Buah, luka buah sampai kedalaman 1 mm dilakukan dengan a
Jarum steril yang sesuai dengan colokan disk yang tepat
Berikut Untuk masing-masing isolat Actinomycetes, ada empat perlakuan
Ditunjuk: (A) 10 buah apel terluka diperlakukan dengan polos
Disk media CGA, (B) 10 buah apel terluka diinokulasi
Dengan 6 mm cakram kultur isolat Actinomycete yang berkembang dengan baik
Daerah yang terluka, (C) 10 buah apel yang terluka diinokulasi
6 mm cakram kultur C. gloeosporioides yang tumbuh dengan baik, (D) 10 buah
Diinokulasi dengan 6 mm cakram dari budaya tumbuh dengan baik (memiliki-
Ing conidia yang melimpah) dari kedua antagonis dan patogen,
Berurutan. Inokulasi antagonis dan patogen itu
Dilakukan sebagai berikut: (1) Semua buah apel secara aseptis jarum-
Terluka seperti yang dijelaskan di atas, (2) colokan antagonis 6 mm atau
Patogen ditempatkan pada luka dan diinkubasi selama 12 jam, (3) setelahnya
Periode ini, disk dalam perawatan 4 telah dilepas dan diganti dengan
6 mm cakram kultur C. gloeosporioides (memiliki
Konidia yang melimpah). Penggantian dalam perawatan 1 dilakukan dengan
Disk agar polos dan dalam perawatan 2 dengan colokan Actinomycete. Semua
Perawatan disimpan untuk tambahan 12 jam di bawah disegel
Inkubasi, (4) setelah periode ini, semua sumbat disk dikeluarkan dari
Semua sampel yang diobati, (5) Semua perawatan dikemas dalam kemasan baru,
Terpisah, disegel, kantong plastik dan diinkubasi pada 28 C sampai 16 hari,
(6) Kemajuan penyakit dipantau pada interval 4 hari sampai
Hari ke 16 dengan mengukur diameter area busuk untuk
Analisis statistik.
2.8.2. Penerapan ekstrak kasar antagonis
Untuk masing-masing isolat, konsentrasi MIC tiga kali lipat ekstrak kasar
Dalam air suling steril disiapkan dan dicampur secara menyeluruh untuk
10 menit. Perawatan dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya
Bagian dengan beberapa perbedaan sebagai berikut: 100 mL suspensi itu
Terbentang di radius 20 mm di sekitar luka dengan cara steril
Penyeka. Setelah mengeringkan suspensi bekas, empat perawatan
Dirancang untuk setiap sampel kasar Actinomycetes: (A) 10 terluka
Buah apel diolah dengan suling steril 100 mL, (B)
10 buah apel yang terluka diinokulasi dengan 100 ml minyak mentah
Sampel isolat Actinomycete, (C) 10 buah apel yang terluka
Diinokulasi dengan 6 mm cakram kultur C. gloeospor-
Ioides, (D) 10 buah diinokulasi terlebih dahulu dengan 100 mL minyak mentah
Sampel isolat Actinomycete diikuti oleh 6 mm cakram sumur-
Kultur tumbuh (memiliki konidia yang melimpah) dari patogen. Semua
Perlakuan dikemas dalam kantong plastik terpisah dan tertutup
Diinkubasi pada 28 C selama 16 hari. Kemajuan penyakit itu
Dipantau pada interval 4 hari dengan mengukur diameter busuk
Daerah untuk analisis statistik

2.8.3. Analisis statistik

Data yang terekam dikenai analisis varians (ANOVA)
Dengan perangkat lunak SAS (SAS Institute, versi 9, Cary, NC). Statistik
Signifikansi ditentukan pada p 0,01. Duncan's Multiple-
Range Test digunakan untuk membandingkan mean.

2.9. Produksi enzim litik ekstraselular oleh antagonis

Mengevaluasi produksi enzim lamina ekstraselular oleh

Antagonis, tiga ulangan dievaluasi dalam setiap bioassay untuk
Masing isolat Actinomycete yang aktif dalam semua uji enzimatik ini
Bagian dan data dicatat dengan mengukur diameter halo
Zona yang dihasilkan dari aktivitas enzimatik antagonis di

Ara. 1. Aktivitas antijamur in vitro isolat Actinomycete terhadap Colletotrichum

Gloeosporioides. Pusat, sumbat agar C. gloeosporioides, searah jarum jam dari
bawah:
(A) disk agar-agar kosong sebagai kontrol, isolat Actinomycete 550, 536, 534; (B)
kontrol, 541,
505, 521; (C) kontrol, 528, 574, 560; (D) kontrol, 115, 354, 101. Efek penghambatan
Terhadap pertumbuhan mycelial patogen terlihat pada beberapa isolat.
Ara. 2. Bioaktivitas enzim kultur berair dari isolat Actinomycete 521 di
Metode difusi dengan baik terhadap kultur rumput Colletotrichum gloeosporioides.
Searah jarum jam dari bawah: kontrol dengan baik yang menerima serat budaya
yang tidak diinokulasi,
Kultur isolat isolat Actinomycete 521 pada hari ke 3, 4, dan 5 dari penyemaian
Waktu yang merupakan penghambatan pertumbuhan C. gloeosporioides.
Ara. 3. Diameter zona penghambatan yang disebabkan oleh kultur fi ltrasi kultur
terendam isolat Actinomycete 521 sebagai indikasi bioaktivitas terhadap
Colletotrichum.
Gloeosporioides versus post seeding time dipantau dengan metode difusi baik. Efek
penghambatan maksimal diperoleh pada hari ke 5 inokulasi. Setiap titik data adalah
Wakil rata-rata tiga ulangan.

40 C dalam oven semalam (Macagnan et al., 2008). Chitinolitik

Aktivitas tersebut diidentifikasikan sebagai munculnya zona yang jelas di sekitar
Koloni setelah 5 hari inkubasi pada 28 C.

2.9.2. Glucanases
Produksi glukanase oleh masing-masing antagonis aktif adalah
Terdeteksi dengan mentransfer cakram 6 mm dari budaya tumbuh dengan baik ke a
Media agar minimal 1,5% mengandung lichenan 0,1% (Sigma). Setelah
3 hari o nformasi di 28 C, piring diwarnai dengan 0,3% Kongo
Red (Sigma) selama 15 menit. Setelah membuang sisa zat warna dengan
Benar-benar membilas permukaan agar-agar dengan air, noda itu diperbaiki
Dengan mengepak piring dalam 1 M NaCl selama 10 menit. Hidrolisis Lichenan
Dinilai dengan munculnya zona bening di sekitar glukanolitik
Koloni (Walsh et al, 1995; Sergeyenko dan Los, 2003).

2.9.3. Protease
Aktivitas proteolitik dideteksi dengan hidrolisis kasein pada agar
Piring yang mengandung 0,3% kasein, 0,1% glukosa, dan 1,5% agar.
Antagonis ditransfer sebagai disket 6 mm dari sumur mereka
Budaya ke medium Pelat diinkubasi pada 28 C selama 3-
4 hari. Pembentukan zona yang jelas di sekitar koloni adalah indikasi
Aktivitas proteolitik (Dunne et al., 2000; Pereira Rodarte et al., 2011).

2.9.4. Lipase
Media pendeteksi lipase terdiri dari pepton 1%, NaCl 0,5%
0,01% agar CaCl2 dan 1,5% disiapkan dan dilengkapi dengan
10 mL Tween-80 yang diautoklaf secara terpisah. Isolat Actinomycete
Dikultur pada medium seperti yang disebutkan untuk deteksi protease.
Pelat diinkubasi pada 28 C selama 3-4 hari. Bila seperti bedak
Halo sedimen muncul di sekitar koloni lipolitik (Sierra, 1957),
Bioassay ditandai sebagai positif.

2.9.5. Amilase
Sekitar 0,2% pati larut ditambahkan ke agar nutrisi yang sesuai
Medium basal. Setelah inokulasi Actinomycetes seperti yang disebutkan
Diatas dan inkubasi pada 28 C selama 3-4 hari, hidrolisis pati
Dievaluasi dengan mengepak piring di iodium encer (Lugol). Ketiadaan
Warna ungu kebiru-biruan itu khas dari pati-yodium
Kompleks yang menunjukkan hidrolisis pati (Society of American
Ahli Bakteriologi, 1951).
2.10. Identifikasi molekuler

Menurut hasil tes sebelumnya, Actinomycete

Isolat 521 dipilih sebagai antagonis yang paling efisien. Untuk

Tabel 1
Analisis varians data diameter-penyakit-lesi akibat penerapan langsung antagonis
Actinomycete terhadap Colletotrichum gloeosporioides 4, 8, 12 dan 16
Hari setelah onset pengobatan. Hasil menunjukkan perbedaan yang signifikan (p
0,01) antara perlakuan Actinomycete dan kontrol yang sakit.
Tabel 2
Hasil perbandingan mean untuk data (diameter area pembusukan penyakit)
dihasilkan dari aplikasi langsung isolat antinokatalis Actinomycete terhadap
Colletotrichum.
Gloeosporioides setelah 4, 8, 12 dan 16 hari sejak onset pengobatan. Huruf yang
serupa dalam kolom tidak signifikan (p 0.5) berbeda menurut Range-Rentang
Duncan
Uji (tes SSR). Terlepas dari kenyataan bahwa semua antagonis memiliki efek
penghambatan yang signifikan terhadap kemajuan penyakit dibandingkan dengan
kontrol, tidak ada perbedaan yang signifikan antara
Actinomycetes dalam efek penghambatannya.

Identifikasi molekul isolat berdasarkan urutan 16S rRNA,

DNA genomik diekstraksi dengan protokol CTAB seperti yang dijelaskan oleh
Rogers dan Bendich (Kieser et al., 2000). Berikut ini Actino-
Primer mycetes-specific digunakan untuk memperkuat gen rRNA;
F16SS (50-ACGGGTGAGTAACACG-30) dan R16SS (50-
TACCGCGGCTGCTGGCACG-30) (CinnaClone, Teheran, Iran). PCR
Pengamplasan dilakukan dan menghasilkan produk PCR 16S rDNA
Diligasi menjadi vektor pTZ5R / T oleh Kloning PCR CloneTM T / A
Kit (Fermentas). Fragmen diurutkan di kedua arah oleh
Perusahaan Faza-Pajhouh (Teheran, Iran) menggunakan M13F (20) dan M13R-
PUC (40) primer. Rangkaian urutan 16S yang diperoleh adalah
Dibandingkan dengan semua urutan yang dapat diakses di NCBI GenBank
Database dengan Basic Alignment Search Tool (BLAST, http: //
Www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Ara. 6. Hasil percobaan in vivo pengendalian biologis busuk pahit apel dengan
menggunakan ekstrak kasar isolat Actinomyceste antagonis. (A) Isolasi 534; (B)
mengisolasi 536; (C) mengisolasi
521; (D) mengisolasi 541; (E) mengisolasi 505 dan (f) mengisolasi 550 pada hari ke
4 setelah inokulasi dan onset pengobatan. Searah jarum jam dari kiri, setiap
gambar termasuk kontrol positif
Diperlakukan secara eksklusif oleh Colletotrichum gloeosporioides; Pengobatan
bersama C. gloeosporioides plus isolat Actinomycete; Kontrol negatif (tidak ada
pengobatan patogen dan / atau
Antagonis) dan pengobatan isolat Actinomycete
3. Hasil

3.1. Deteksi kemampuan antijamur isolat Actinomycete

Dalam tes dual culture, delapan dari lebih dari 120 Actinomycete
Isolat, yang ditunjuk sebagai isolat 354, 505, 521, 534, 536, 541, 550 dan
574, ditemukan mampu menghambat C. gloeosporioides
Pertumbuhan seperti ditunjukkan pada Gambar. 1.

3.2. Uji kloroform

Di antara 8 antagonis Actinomycete yang paling efektif, isolat

354 dan 574 kehilangan aktivitas antijamur mereka, sementara enam isolat lainnya
Mempertahankan aktivitas antijamur mereka setelah terpapar kloroform
Dan seleksi untuk penyelidikan selanjutnya.

3.3. Aktivitas antijamur dari kultur terendam

Hasil pengujian berturut-turut setiap hari dengan menggunakan kultur aktif

Isolat menunjukkan bahwa untuk isolat 550, 541 dan 521, antijamur
Kegiatan mencapai maksimal 4 hari dari waktu inokulasi, sedangkan
Untuk isolat 534, puncak aktivitas terdeteksi pada tanggal 5 dan untuk
Isolat 505 dan 536 pada hari ke 6 inokulasi. Penghambat
Pengaruh budaya dan aktivitas versus waktu pembibitan padi di Indonesia
Kultur terendam untuk isolat Actinomycete 521 ditunjukkan pada
Gambar. 2 dan 3. Kali ini digunakan untuk memanen budaya untuk dipersiapkan
Ekstrak kasar untuk studi lebih lanjut.

3.4. Penentuan MIC

MIC dari ekstrak kasar untuk menghambat pertumbuhan C.
Gloeosporioides ditentukan serendah 6,25 g L 1 untuk isolat
534, 505, 541 dan 521. Sedangkan untuk isolat 550 dan 536,
Konsentrasi 12,5 dan 25 g L 1 dari ekstrak kasar diperlukan
Untuk menghambat pertumbuhan jamur.

3.5. Jalur in vivo

3.5.1. Penerapan langsung antagonis

Kurang lengkap gejala penyakit diamati pada pengobatan-
Beberapa kontrol yang tidak diinokulasi dan Actinomycete-diinokulasi
Buah apel Gejala diamati pada dua perawatan lainnya,
Yang termasuk patogen diinokulasi dan patogen plus antagon-
Nist Data dianalisis sebagai desain acak lengkap
Mengandung tujuh perawatan termasuk perawatan bersama oleh masing-masing
Antagonis dan Colletotrichum serta positif Colletotrichum-
Kontrol yang diinokulasi Hasil analisis data oleh perangkat lunak SAS 9.1
Menunjukkan bahwa pengobatan buah antagonis Actinomycete
Signifikan (p 0,01) menekan efek pada perpanjangan
Lesi penyakit dibandingkan kontrol penyakit. Namun, artinya
Dibandingkan dengan Uji Rentang Duncan (Uji SSR) (hlm
Analisis varians untuk data yang dihasilkan dari penerapan minyak mentah
Actinomycetes
Ekstrak melawan Colletotrichum gloeosporioides (diameter penyakit lesi) pada usia
ke-4
Dan hari ke 8 setelah onset perawatan menunjukkan perbedaan yang signifikan
antara
Perawatan dan kontrol terapan.
0,05) tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik di antara enam
Memeriksa isolat Actinomycets dalam pengendalian penyakit mereka.
Pengamatan fenotipik dan hasil analisis statistik
Telah ditunjukkan pada Gambar. 4 dan 5 dan Tabel 1 dan 2

3.5.2. Penerapan ekstrak kasar antagonistik

Hasil menunjukkan penurunan yang signifikan pada penyakit
Gejala pada buah ekstrak kasar yang diobati dibandingkan dengan kontrol
Dengan analisis data menggunakan perangkat lunak SAS 9.1 yang menunjukkan
perlakuan
Buah dengan ekstrak kasar antagonis memiliki signifikan (p 0,01)
Efek penghambatan pada perpanjangan lesi penyakit dibandingkan dengan
Kontrol yang sakit Tidak ada perbedaan yang signifikan antara keduanya
Berbagai isolat antagonis. Ara. 6 dan Tabel 3 dan 4 menunjukkan
Ekspresi gejala dan hasil analisis statistik, masing-masing-
Ly.
3.6. Produksi enzim litik ekstraselular

Semua isolat Actinomycete mampu menghasilkan berbagai macam

Enzim hidrolitik sampai derajat yang berbeda. Hasil terkait
Bioassay ditunjukkan pada Gambar. 7. Sebagai hasil menunjukkan, Actino-
Isolat myceste 521 adalah antagonis yang paling manjur
Menghasilkan semua enzim yang dipertimbangkan, namun secara mencolok
kitinase dan
Glukanase Isolat ini dipilih untuk nukleotida 16S rDNA
Identifikasi berbasis urutan

3.7. Analisis rDNA 16S

Perbandingan dibuat antara rRNA 406 bp 16S parsial

Urutan yang diperoleh dari isolat Actinomycete 521 (diserahkan kepada
GenBank dengan nomor akses HQ393406.1) dan sebelumnya
Urutan yang ada di GenBank, menunjukkan bahwa isolatnya adalah
Diklasifikasi dalam genus Amycolatopsis famili Pseudonocardiaceae.

4. Diskusi

Karena kekhawatiran masyarakat terkait keamanan pangan dan

Lingkungan, penggunaan agen biokontrol untuk mengelola pascapanen
Penyakit buah telah muncul sebagai alternatif penggunaan
Hasil perbandingan berarti untuk data yang dihasilkan dari aplikasi ekstrak kasar
isolat Actinomycete terhadap Colletotrichum gloeosporioides pada hari ke 4 dan 8
setelah
Onset pengobatan. Huruf yang identik dalam kolom tidak signifikan (p 0,5) berbeda
menurut Uji Rentang Duncan Duncan (uji SSR).
Kemampuan relatif isolat Actinomycete untuk menghasilkan enzim hidrolitik
ekstraselular diukur sebagai diameter zona terhidrolisis dari substrat terkait. Setiap
titik data adalah
Wakil rata-rata tiga ulangan.

Fungisida sintetis. Dalam penelitian ini, enam isolat

Antagonis Actinomycetes - sumber mikroba yang diketahui lebih banyak
Dari 90% senyawa bioaktif, yang memiliki potensi applica-
Di farmasi, industri, pertanian dan lingkungan -
Menunjukkan efisiensi biokontrol terhadap buah apel yang membusuk pahit
Yang disebabkan oleh C. gloeosporioides ditemukan. Di antara yang teruji
Antagonis, isolat 521, yang kemudian diidentifikasi sebagai
Amycolatopsis, adalah yang paling efektif dalam bioassay in vitro. Nya
Bioaktivitas sangat menonjol di semua bioassay yang digunakan. Tes kloroform
Menunjukkan bahwa efek antijamurnya terus berlanjut saat terpapar
khloroform. Dalam bioassays antijamur, mean yang dihitung untuk
Diameter zona penghambatan terhadap C. gloeosporioides lebih tinggi
Dibanding rekan-rekannya yang lain. Seiring dengan isolat 550 dan 541,
Itu mencapai bioaktivitas maksimum setelah hanya 4 hari terendam
Budaya. Konsentrasi hambat kasar ekstrak kasar untuk
Isolat ini diukur serendah 6,25 g L 1, menghasilkan semua
Dianggap enzim hidrolitik, terutama glukananasa, kitinase
Dan protease, yang berpotensi terlibat dalam biokontrol dan
Kemungkinan besar terjadi dan proses kompetisi substrat terhadap
Patogen teruji. Hasil uji in vivo secara statistik
Sangat penting. Persentase buah yang terinfeksi di Actinomycetes-
Mengandung perawatan, dibandingkan dengan kontrol, menunjukkan
Pengurangan penyakit sebesar 40-50% sepanjang pencatatan data persidangan
Periode. Dalam perawatan yang menerima Actinomycetes, beratnya
Gejala dan lesi secara signifikan lebih rendah dan diperpanjang
Lebih lambat dari kontrol, terutama untuk isolat 521. Temuannya adalah
Berharga karena fakta bahwa metode yang satu ini mengendalikan pahit
Busuk apel efektif dalam menunda pertumbuhan busuk selama
penyimpanan. Membandingkan dua metode inokulasi yang digunakan: (1)
Menggunakan sumbat miselia dan spora antagonis dan (2) minyak mentah
Ekstrak, hasilnya menunjukkan bahwa metode pertama lebih efektif.
Dengan kata lain, aplikasi antagonis aktif praktis
Formulasi tampaknya lebih efektif dibandingkan dengan ekstrak kasar
Digunakan dalam percobaan Meski uji in vivo untuk mencegah pahit
Busuk tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan antara isolat aktif,
Berdasarkan karakteristik yang disebutkan, isolat 521 dipilih
Identifikasi molekuler yang menyebabkannya dikategorikan sebagai genus
Amycolatopsis T terlihat bahwa beberapa spesies ini ada
Produsen produk bioctive yang berharga seperti Rifamycin,
Vankomisin dan antibiotik antijamur spektrum luas baru
Octacosamicin A dan B (Ding et al., 2007; Majumdar et al.,
2006). Meskipun sebagian tidak jelas mengenai sifat dan jumlahnya
Prinsip yang terlibat dalam proses biokontrol, hasil saat ini
Cukup meyakinkan untuk menyarankan calon isolat aktif
Untuk penyelidikan biokimia dan molekuler lebih lanjut sebagai efesien
Agen biokontrol Pemahaman yang lebih baik tentang mekanisme mereka
Tindakan harus memudahkan penerapannya tidak hanya untuk biokontrol
Patogen saat ini tapi untuk pembentukan teknologi baru
Mengendalikan spektrum penyakit pasca panen pada buah - buahan dan
Sayuran. Produksi dan formulasi metabolit bioaktif

Via rekayasa genetika dan fermentasi bisa berakibat aman dan

Fungisida ramah lingkungan. Umumnya, penelitian saat ini adalah yang pertama
Melangkahlah di sepanjang jalan untuk menghasilkan formulasi komersial agar lebih
aman
Perawatan pascapanen dan pra-penyimpanan buah untuk menghambat atau
Mengurangi kerugian buah apel yang membusuk jamur patogen.

Pengakuan

Terima kasih kepada Shahid Bahonar University of Kerman untuk keuangan

mendukung. Penelitian ini merupakan bagian dari Skripsi MSc dari penulis pertama
dan
Didedikasikan untuk Mr Afzalipour dan Mrs Fakhereh Saba, para pendiri
Universitas di Kerman.