PEMERIKSAAN CONTENT HEMOGLOBIN RETICULOCYTE (CHr)

METODE HEMATOLOGI
TAHAP DASAR ORIENTASI

Presentan : Yan Ajie Nugroho

Pembimbing :

Sienny Linawati, dr., MSc, Sp.PK

Program Pendidikan Dokter Spesialis Patologi Klinik

Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret

Surakarta
2017

1
 BAB I
PENDAHULUAN

Retikulosit adalah sel darah merah yang masih muda yang tidak berinti
dan berasal dari proses pematangan normoblas di sumsum tulang. Sel ini
mempunyai jaringan organela basofilik yang terdiri dari RNA dan protoforpirin
yang dapat berupa endapan dan akan berwarna biru apabila dicat dengan
pengecatan biru metilen (Suega, 2010).
Prekursor eritroid yang secara morfologik dalam sumsum tulang dikenal
sebagai pronormoblas, kemudian berkembang menjadi basofilik (early
normoblast), selanjutnya polychromatophilic normoblast dan acidophilic (late)
normoblast. Sel ini kemudian kehilangan intinya, masih tertinggal sisa-sisa RNA,
yang jika di cat dengan pengecatan khusus akan tampak seperti jala sehingga
disebut retikulosit. Retikulosit akan dilepas ke darah tepi, kehilangan sisa RNA
sehingga menjadi eritrosit dewasa. Proses ini dikenal sebagai eritropoesis (Bakta,
2006).
Retikulosit berada di sirkulasi selama 1-2 hari sebelum akhirnya menjadi
sel darah merah matang (Anonim 1, 2010). Tahapan proses pematangan sel darah
merah dapat dilihat pada gambar 1.
Pemeriksaan retikulosit kembali mendapat perhatian yang penting setelah
ditemukannya pemeriksaaan dengan alat yang lebih canggih dengan pewarnaan
yang spesifik untuk RNA. Hasil pemeriksaan ini jauh lebih tepat dan akurat
walaupun pada kosentrasi retikulosit yang rendah.
Bahkan generasi terakhir dari alat ini mampu memberikan informasi
tambahan seperti adanya gambaran fraksi retikulosit muda (IRF) dan beberapa
paremeter lainnya seperti MCVr (Reticulocyte Mean Corpuscular Volume),
MCHCr (Reticulocyte Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration) dan rata-
rata kadar hemoglobin dalam retikulosit (CHr) (Suega, 2010).
Anemia defisiensi besi adalah bentuk paling umum dari anemia akibat
kekurangan nutrisi di seluruh dunia. Berbagai parameter biokimia yang digunakan
untuk mendiagnosa anemia defisiensi besi termasuk Feritin, Saturasi Transferin,

1
 Gambar 1. Tahapan pematangan sel darah merah (Anonim 1, 2010).

Serum Iron dan Mean Corpuscular Volume (MCV). Meskipun ketersediaan

parameter ini, namun validitas untuk diagnosis anemia defisiensi besi masih
diperdebatkan (Karagulle, 2013). Baik tes saturasi transferin dan feritin secara
tidak langsung memberikan informasi jumlah zat besi yang tersedia dalam
sumsum tulang untuk eritropoiesis (Anonim 1, 2010).
Feritin serum, merupakan reaktan fase akut dan kadarnya dipengaruhi
oleh peradangan. Saturasi transferin berfluktuasi karena variasi diurnal serum
iron, dan kadar Serum Iron akan menurun pada proses infeksi, peradangan,
keganasan dan akan meningkat pada penyakit hati. Pemeriksaan CHr kurang
dipengaruhi oleh inflamasi dibandingkan saturasi transferin dan ferritin
(Karagulle, 2013).
Pemeriksaan CHr atau Ret-He merupakan pengukuran tidak langsung
dari besi fungsional yang diproduksi sel darah merah baru selama 3-4 hari
sebelumnya. Pengukuran kadar hemoglobin retikulosit dalam darah perifer
berguna untuk diagnosis defisiensi zat besi pada orang dewasa dan juga anak-
anak (Mast, Binder, 2007).

2
 Standar emas yang digunakan untuk menentukan kekurangan zat besi
adalah penilaian dari pewarnaan zat besi sumsum tulang. Namun, karena adanya
variabilitas interobserver dan ditemukannya juga cadangan besi pada pasien
dengan anemia akibat peradangan kronis, maka tidak lagi menjadi standar emas
yang sempurna dalam menentukan kekurangan zat besi. Pengukuran respon
eritropoesis terhadap terapi zat besi mungkin menjadi standar emas yang lebih
baik (Mast, 2007).
Pemeriksaan CHr mengukur hemoglobin dari retikulosit (sel darah
merah yang imatur) dan dapat mengukur langsung zat besi yang tersedia untuk
eritropoiesis produksi sel darah merah) secara dini. Content Hemoglobin
Reticulocyt memiliki sensifitas dan spesifisitas yang tinggi untuk diagnosis
defisiensi besi dibandingkan pengukuran zat besi secara tradisional (Anonim 1,
2010).
Dengan kemampuan mengukur secara langsung hemoglobin yang
terdapat pada retikulosit, penilaian CHR menjad alat sensitif baru untuk deteksi
dini dari defisiensi besi fungsional dan memberikan informasi tambahan yang
dapat digunakan dalam mengelola kebutuhan zat besi pada terapi rHuEPO
(Anonim 2, 2010).
Di Laboratorium Patologi Klinik RS Moewardi, CHr diukur saat analisis
retikulosit dengan menggunakan ADVIA 120 automated hematology analyzers
yang diproduksi oleh Siemens.
ADVIA 120 dan 2120 telah disetujui untuk penggunaan klinis oleh
FDA di Amerika Serikat pada tahun 1997 (Mast, 2007).
Content Hemoglobin Reticulocyte ditentukan dari pengukuran light
scatter pada dua sudut yang berbeda meliputi isovolumetric sphering dari oxazine
750-stained reticulocytes. Volume dan konsentrasi hemoglobin retikulosit diukur
dari jumlah cahaya yang tersebar di dua sudut berbeda (Mast, 2007).
Content Hemoglobin Reticulocyte merupakan produk dari volume
seluler dan konsentrasi hemoglobin selular. Konsentrasi hemoglobin meningkat
dan volume sel menurun pada retikulosit yang matang dan menjadi eritrosit. Oleh

3
karena itu, CHr adalah parameter yang lebih stabil daripada konsentrasi
hemoglobin retikulosit (Mast, 2007).
Pemeriksaan serupa dapat dilakukan dengan menggunakan alat Sysmex
(XE 2100) hematology analyzer, tetapi tidak identik, parameter retikulosit disebut
RET-Y yang telah tersedia sejak Mei 2005. Ret-He adalah hasil pengukuran dari
forward scatter dari retikulosit yang terwarnai dan memiliki hubungan kurva
linear dengan CHr. Nilai Ret-He secara matematis dapat dikonversi menjadi nilai
konsentrasi hemoglobin retikulosit yang mencerminkan nilai CHr yang diperoleh
pada analisa ADVIA (Mast, 2007).
Reticulocyte hemoglobin content yang berasal dari teknologi Siemens
(Advia) sangat mirip dibandingkan reticulocyte hemoglobin content (RET-He)
pada alat Sysmex, dengan rentang R dari 0,95-0,99 (Brugnara, Kratz, 2015).
Keuntungan dari pengukuran reticulocyte hemoglobin content
menggunakan hematology analyzer adalah hasil pemeriksaan dapat diperoleh
dalam beberapa menit dan juga untuk mengurangi pemeriksaan tambahan seperti
ferritin, serum iron dan total iron binding capacity (Brugnara, Kratz, 2015).
Kekurangannya adalah bahwa parameter ini hanya didapat pada alat
Advia. Tetapi sekarang parameter celluler hemoglobin content tersedia juga pada
alat Sysmex yang disebut dengan RET-He (Brugnara, 2015).
Nilai rata-rata CHr bagi individu yang sehat menggunakan ADVIA
analyzer telah dilaporkan sebesar 30,8 pg dengan tidak ada perbedaan antara laki-
laki dan perempuan (Mast, 2007).
Sysmex (XE 2100) hematology analyzer menggunakan fluorescent
flowcytometry dengan pewarna polymethine, mengukur nilai rata-rata dari
forward light scatter histogram dari sel darah merah yang matur dan retikulosit.
(Acton, 2012).
Pengukuran RET-He menggunakan satuan pikogram, dimana
menunjukkan rata-rata hemoglobin retikulosit. Nilai RET-He dihitung secara
matematis dari nilai ret-Y dan rbc-Y (nilai rata-rata dari forward light scatter
dalam histogram yang secara proporsional menggambarkan dimensi dan isi
hemoglobin (Zini, 2014).

4
 Banyak penelitian dalam membedakan jenis anemia dan untuk monitoring
terapi erytrhropoietin menunjukkan bahwa RET-He adalah indikator awal dari
defisiensi besi eritropoiesis meskipun nilai serum feritin atau saturasi transferin
masih normal (Wick, Pinggera, Lehman, 2012).
RET-He meningkat pada pasien dialisis yang menerima besi intravena
secara simultan dengan EPO. Pada anak RET-He juga dipercaya sebagai indikator
yang baik untuk defisiensi besi pada anak-anak. Rentang nilai normal RET-He
adalah 28-35 pg per retikulosit (Wick, Pinggera, Lehman, 2012).

Tabel 1. Perbandingan pemeriksaan CHr pada Advia 120 dengan RET-He

pada Sysmex XE-2100.

Persamaan
Item Parameter CHr pada Advia 120 ParameteRET-He r
pada Sysmex XE-2100

Kegunaan Mengukur hemoglobin retikulosit Mengukur hemoglobin

retikulosit
Antikoagulan EDTA EDTA

Tipe sampel Darah perifer Darah perifer

Perbedaan

Metode Parameter retikulosit yang menggunakan fluorescent

berasal dari kombinasi light
scatter laser dan penyerapan
pewarnaan pada asam nukleat.
flowcytometry dimana pada
retikulosit menggunakan
pewarna polymethine, juga
mengukur nilai rata-rata dari
forward light scatter histogram
dari sel darah merah yang
matur dan retikulosit

(Anonim 2, 2010)

Pengukuran indeks retikulosit, seperti CHr dengan automated hematology

analyzer telah dipercaya menjadi indikator sensitif pada saat awal terjadinya
kekurangan zat besi pada eritropoiesis karena retikulosit yang berumur 4-hari.
Pemeriksaan CHr menyediakan ukuran yang akurat dari besi fungsional untuk

5
eritropoiesis selama 3-4 hari sebelumnya. Sehingga merupakan penanda
laboratorium yang berguna untuk diagnosis kekurangan zat besi baik pada orang
dewasa maupun anak-anak dan dapat juga digunakan untuk mengidentifikasi
kekurangan zat besi fungsional pada pasien yang menerima terapi erythropoietin
(Mast, 2007).
Namun, karena yang digunakan untuk perhitungan CHr adalah ratarata
volume seluler, maka pemeriksaan CHr memiliki keterbatasan diagnostik.
Pemeriksaan CHr sering rendah pada pasien thalasemia dan hemoglobinopati
yang menyebabkan anemia mikrositik. Juga dapat meningkat pada pasien yang
kekurangan zat besi pada anemia megaloblastik karena tingginya rata-rata volume
seluler terkait dengan megaloblastosi (Mast, 2007).
Oleh karena itu, dalam menafsirkan nilai-nilai CHr kita juga harus
memperhatikan fisiologi eritrosit, ermasuk informasi adanya transfusi darah,
terapi zat besi, vitamin B12 atau defisiensi folat, dan hasil analisis hemoglobin
(Mast, 2007).
Nilai CHr menurun secara signifikan pada defisiensi besi dan tidak
menurun pada pasien anemia dengan inflamasi kronis (Anderson, McLaren,
2012).
Untuk memastikan hasil pemeriksaan yang akurat perlu diperhatikan
beberapa hal berikut:
a. Sampel diambil sebelum dialisis.
b. Hindari kontaminasi darah dari heparin atau salin.
c. Gunakan luer adapter untuk memasukkan spesimen secara langsung ke dalam
tabung, hindari menggunakan spuit.
d. Pastikan mencampur sampel secara perlahan dengan membolak-balikkan
sebanyak 5 kali.
e. Simpan dalam refrigerator sccara tepat saat menunggu pengiriman dan jangan
dibekukan (Anonim 1, 2010).

6
 BAB II
PEMERIKSAAN CONTENT HEMOGLOBIN RETICULOCYTE (CHr)

A. Pra analitik
1. Tujuan
Pemeriksaan Content Hemoglobin Reticulocyte (CHr) bertujuan untuk
mengukur jumlah hemoglobin dalam retikulosit (Anonim 1, 2010).

2. Persiapan pasien
Tidak ada persiapan khusus
3. Sampel
a. Pengumpulan Sampel
Darah dilkumpulkan dalam tabung berisi EDTA sebagai antikoagulan
(Anonim 4, 2012). Sampel darah harus disimpan dalam lemari
pendingin dengan suhu 2C sampai 8C apabila tidak dianalisa dalam
8 jam setelah phlebotomy . Apabila sampel telah disimpan dalam
lemari pendingin, biarkan terlebih dahulu sampai mencapai suhu
ruangan (15C sampai 30C) sebelum dilakukan analisa (Anonim 2,
2010).
b. Pengenceran Sampel
Pengenceran darah untuk pemeriksaan retikulosit tidak
direkomendasikan . (Anonim 2, 2010).
c. Stabilitas sampel
Telah dilakukan penelitian mengenai efek dari lamanya penyimpanan
darah selama periode 72 jam pada ADVIA 120 Hematology System.
Dua pasang sampel darah dari 15 orang normal dinilai sesaat setelah
phlebotomy dan dibandingkan dengan pada saat interval 8, 24, 36, 48,
dan 72 jam. Satu dari setiap pasang sampel disimpan pada suhu kamar
sedangkan satu sampel lainnya disimpan pada suhu 2C sampai 8C
dalam tabung tetutup yang menggunakan antikoagulan EDTA.
Hasilnya menunjukkan bahwa parameter retikulosit stabil dalam 2
standar deviasi.

Tabel 2. Stabilitas sampel

7
 Parameter Stabilitas dalam suhu Stabilitas dalam lemari
kamar (jam) pendingin (jam)

% RETIC 24 72

CHr 24 72

(Anonim 2, 2010)

4. Alat dan bahan

a. ADVIA 120 Hematology Analyzer

Gambar 2. Advia 120 Hematology Analyzer (Anonim 3, 2010)

b. Tabung K3EDTA yang digunakan untuk pemeriksaan hematologi

rutin (Mast, 2002).

c. Reagensia
ADVIA 120 auto retic mengandung deterjen zwiterionic (surfaktan)
yang isovolumetrik dengan sel darah merah. Dan juga berisi pewarna
kationik, Oxazine 750, yang mewarnai RNA sel (Anonim 3, 2010).
B. Analitik

8
1. Prinsip
Prinsip pemeriksaan yang digunakan untuk mengukur CHr adalah
flowcytometri. Kandungan hemoglobin seluler dari retikulosit diukur per
sel melalui dual angle light scatter dan nilai rata-ratanya dilaporkan
sebagai CHr (Anonim 2, 2010).
Dua mikroliter (2uL) dari sampel dengan antikoagulan EDTA
dicampur dengan reagen ADVIA 120 autoRETIC. Reagen ADVIA 120
autoRETIC isovolumetrik dengan sel eritrosit dan akan mewarnai RNA
seluler. Low-angle laser liht scatter, high-angle laser light scatter dan
absorbsi dari seluruh sel dihitung dan diukur. Data absorbsi digunakan
untuk mengklasifikasikan sel sebagai retikulosit atau sel darah merah
matang berdasarkan isi RNA (Anonim 2, 2010).
2. Cara kerja
a. Untuk menjalankan sampel secara otomatis dengan autosampler:
1) Masukan tabung ke dalam rak dengan label barcode terlihat di atas rak.
Label barcode menunjukkan jumlah rak dan posisi sampel.
2) Masukan rak ke antrian input dengan label menghadap kedepan,
jika indikator standby menyala, tekan standby.
3) Pada touchpad, pilih start / stop Sampler.
4) Indikator start menyala.
5) Mengevaluasi hasil kontrol atau memvalidasi hasil pasien (Anonim 2,
2010).

b. Untuk menjalankan sampel secara manual dengan tutup tabung terbuka:

1) Jika indikator standby menyala, pilih standby.

2) Scan label tabung atau masukkan informasi sampel pada manual
sample ID, pastikan sample ID yang terlihat dalam status line sudah
benar sebelum dilakukan aspirasi.
3) Posisikan tabung agar sampler probe dapat terendam pada sampel
yang sudah tercampur homogen.
4) Benamkan sampler probe dengan kedalaman sekitar 0,25 inchi untuk
memastikan dapat teraspirasi.
5) Tekan aspirate plate dan lampu sampling akan menyala saat aspirasi.
6) Ketika lampu sampling berhenti menyala, keluarkan tabung.

9
 7) Mengevaluasi hasil kontrol atau memvalidasi hasil pasien (Anonim 2,
2010).

C. Paska analitik
1. Penilaian hasil

Melalui penggunaan algoritma flagging, petugas laboratorium

diingatkan untuk menduga adanya kondisi abnormal. Kondisi ini ditandai
dengan tanda flag seperti *, +, dan atau penebalan warna. Ketika muncul
flag, maka petugas laboratorium harus mengevaluasi hasil dan melakukan
tindakan yang tepat (Anonim 2, 2010).

Gambar 3. Histogram retikulosit (Anonim 3, 2007)

Histogram RETIC cellular hemoglobin (RETIC CH) menampilkan
distribusi dari Sel Eritrosit matur dan retikulosit dengan berat atau massa
hemoglobin dari setiap sel.
Histogram memiliki rentang dari 0-100 pg. Sel Eritrosit matur
berwarna merah dan populasi retikulosit berwarna biru.
Perhitungan parameter yang dilaporkan :
a. %RETIC: 100 x (RETIC Count) x % Retic Cal Factor
b. #RETIC: RBC x (%Retic 100)
c. MCVr (Mean Cell Volume population reticulocytes) adalah rata-rata
dari Retic Volume histogram untuk retikulosit.
d. CHr (Cellular Hemoglobin population content reticulocytes) adalah
rata-rata dari RETIC CH histogram untuk retikulosit.
e. CHCMr (Cell Hemoglobin Concentration Mean reticulocytes)adalah
rata-rata dari Retic HC histogram untuk populasi retikulosit (Anonim
3, 2007).

10
2. Nilai normal
Nilai normal CHr (Content Hemoglobine Retyculocyte) dapat
dilihat dalam tabel dibawah ini:

Tabel 3. Rentang nilai normal CHr

Umur Pria (pg/cell) Wanita (pg/cell)
1 Hari - < 2 Tahun 22.5 31.8 23.9 30.9
2 Tahun - < 6 Tahun 25.1 32.0 26.4 32.1
6 Tahun - < 12 Tahun 23.6 33.9 25.1 33.3
12 Tahun - < 18 Tahun 27.0 33.2 28.2 33.9
>18 Tahun 30.1 34.6 27.1 35.2
(Anonim 4, 2012).

Cut off point CHr untuk menilai anemia defisiensi besi adalah 29
pg (Karagulle, 2013).

3. Interferensi
Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi nilai CHr diantaranya
adalah sebagai berikut:

a. Pengobatan dengan erytrhropoietin (EPO).

b. Pemberian zat besi Intravena.
c. Infeksi atau inflamasi (Anonim 1, 2010).

11
 BAB III
SIMPULAN

1. Pemeriksaan retikulosit kembali mendapat perhatian yang penting setelah

ditemukannya pemeriksaaan dengan alat yang lebih canggih dengan
pewarnaan yang spesifik untuk RNA.
2. Pemeriksaan CHr mengukur hemoglobin dari retikulosit (sel darah merah
yang imatur) dan dapat mengukur langsung zat besi yang tersedia untuk
eritropoiesis (produksi sel darah merah) secara dini.
3. Prinsip pemeriksaan yang digunakan untuk mengukur CHr adalah
flowcytometri, dimana kandungan hemoglobin seluler dari retikulosit diukur
per sel melalui dual angle light scatter dan nilai rata-ratanya dilaporkan
sebagai CHr.
4. Pemeriksaan CHr memiliki sensifitas dan spesifisitas yang tinggi untuk
diagnosis defisiensi Fe dibandingkan pengukuran zat besi secara tradisional.

12
 DAFTAR PUSTAKA

Acton, 2012. Usefulness of measuring Reticulocyte Hemoglobin equivalent in the

Management of Haemodialysis Patients with Iron deficiency. Issues in
Hematology
Anderson, McLaren. 2012. Iron Physiology and Pathophysiology in Humans
Anonim 1. 2010. A Test for Diagnosing Iron Deficiency. Spectra Laboratories,
Inc. http://www.spectra-labs.com/ (diunduh 2 April 2017)
Anonim 2. 2010. ADVIA 2120/2120i Hematology Systems Operators Guide.
Anonim 3. 2007. Method Advia 120
www.vetlabor.hu/images/laboratorium/advia
120 (diunduh 2 April 2017)
Anonim 3. 2017. Hemoglobin Content in the Diagnosis of Iron Deficiency Anemia
www.ncbi.nlm.nih.gov (diunduh 2 April 2017)
Anonim 4. 2012. Reticulocyte Hemoglobin Content (CHr). UCSF Departments
of
Pathology & Laboratory Medicine. http://labmed.ucsf.edu (diunduh 4
April 2017)
Bakta. Hematologi Klinik Ringkas. EGC. 2006
Brugnara. 2015. Automated Hematology Analizers.Clinics in Laboratory medicine
Karagulle. 2013. Clinical Significance of Reticulocyte. Turkish Journal of
Hematology www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3878462/ (diunduh
2 April 2017)
Mast A. E. 2002. Clinical Utility of The Reticulocyte Hemoglobin Content in The
Diagnosis of Iron Deficiency. www.bloodjournal.org/content/99/4/1489
(diunduh 2 April 2017)
Mast A. E, Blinder M.A. 2007. Reticulocyte Hemoglobin Content. The American
Journal of Hematology. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18027835
(diunduh 2 April 2017)

13
Suega. K. 2010. Aplikasi Klinis Retikulosit . Jurnal Penyakit Dalam. Volume 11.
www.portalgaruda.org (diunduh 2 April 2017)
Wick, Pinggera, Lehman. 2012. Concepts in the anemias of malignancies and
renal and rheumatoid diseases . Clinical Aspects and Laboratory. Iron
Metabolism, Anemias., 6th ed
Zini. 2014. Morphology of Blood Disorders. 2nd ed

14
15