Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.
com
bagian Saya
Hematologi Laboratorium
Bab 1
pemeriksaan darah dan sumsum tulang
Kristi J. smock, sherrie L. perkins
Penilaian darah yang cermat seringkali merupakan langkah pertama
dalam penilaian fungsi hematologi dan diagnosis penyakit terkait, dan
banyak gangguan hematologi ditentukan oleh tes darah tertentu.
Pemeriksaan apusan darah dan parameter hematologi menghasilkan
informasi diagnostik penting tentang morfologi seluler, kuantifikasi
komponen seluler darah, dan evaluasi ukuran dan bentuk seluler yang
memungkinkan pembentukan kesan diagnostik diferensial yang luas,
yang mengarahkan pengujian tambahan. Bab ini memperkenalkan
konsep dasar dan batasan yang mendasari evaluasi laboratorium
darah dan menguraikan pengujian tambahan yang dapat membantu
dalam mengevaluasi gangguan hematologi, termasuk pewarnaan
khusus dan pemeriksaan sumsum tulang.
Elemen darah meliputi eritrosit atau sel darah merah, leukosit atau
sel darah putih, dan trombosit. Sel darah merah (RBC) adalah sel darah
paling banyak dalam darah dan diperlukan untuk respirasi jaringan. Sel
darah merah tidak memiliki inti dan mengandung hemoglobin, protein
yang mengandung zat besi yang bertindak dalam pengangkutan
oksigen dan karbon dioksida.Sel darah putih (WBC) melayani fungsi
kekebalan dan mencakup berbagai jenis sel yang memiliki fungsi
spesifik dan penampilan morfologis yang khas. Berbeda dengan sel
darah merah matang, sel darah putih berinti dan termasuk neutrofil,
limfosit, monosit, eosinofil, dan basofil.Trombosit adalah fragmen
sitoplasma yang berasal dari megakariosit sumsum yang berfungsi
dalam koagulasi dan hemostasis.
Evaluasi darah memerlukan kuantifikasi masing-masing elemen
seluler dengan metode manual atau otomatis. Metode otomatis,
menggunakan peralatan yang dikalibrasi dengan benar,1,2
lebih tepat daripada prosedur manual. Selain itu, metode otomatis
dapat memberikan data tambahan yang menjelaskan karakteristik
seluler seperti volume sel. Namun, pengukuran otomatis
menggambarkan karakteristik seluler rata-rata tetapi tidak cukup
menggambarkan penyebaran nilai individu di sekitar rata-rata. Oleh
karena itu, populasi bimodal sel darah merah kecil (mikrositik) dan
besar (makrositik) dapat dilaporkan sebagai ukuran sel normal. Oleh
karena itu, pemeriksaan darah menyeluruh juga memerlukan evaluasi
mikroskopis dari film darah bernoda untuk melengkapi data
penganalisis hematologi, terutama ketika temuan baru diidentifikasi.3-5
koleksi spesimen
Pengumpulan spesimen yang tepat diperlukan untuk memperoleh data
laboratorium yang andal dan akurat untuk setiap spesimen hematologi.
Sebelum spesimen diperoleh, pemikiran yang cermat tentang studi apa
yang diperlukan akan membantu dalam pengumpulan sampel yang
optimal. Komunikasi dengan personel laboratorium yang menganalisis
spesimen sering membantu dalam memastikan penanganan yang tepat dan
kinerja pengujian.
Sejumlah faktor dapat mempengaruhi pengukuran hematologi, dan
spesimen harus dikumpulkan dengan cara standar untuk mengurangi
variabilitas data. Contoh faktor, aktivitas pasien, tingkat hidrasi, obat-
obatan, jenis kelamin, usia, ras, merokok, dan kecemasan dapat secara
Hematologi Laboratorium
signifikan mempengaruhi parameter hematologi.6,7,8 Demikian pula,
usia spesimen dapat mempengaruhi kualitas data yang dikumpulkan.
9,10 Dengan demikian, data seperti usia pasien, jenis kelamin, dan
waktu pengumpulan spesimen harus dicatat, serta informasi klinis
korelatif terkait.
Paling sering, darah dikumpulkan dengan pungsi vena ke dalam tabung
pengumpul yang berisi antikoagulan.11 Tiga antikoagulan yang paling
umum digunakan adalah tripotassium atau garam trisodium dari
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), trisodium citrate, dan heparin. EDTA
dan dinatrium sitrat bertindak untuk menghilangkan kalsium, yang penting
untuk inisiasi koagulasi, dari darah.11 Heparin bekerja dengan membentuk
kompleks dengan antitrombin dalam plasma untuk mencegah
pembentukan trombin. EDTA adalah antikoagulan yang lebih disukai untuk
hitung darah karena menghasilkan antikoagulan lengkap dengan efek
morfologis dan fisik yang minimal pada sel. Heparin menyebabkan warna
kebiruan pada latar belakang ketika apusan darah diwarnai dengan
pewarnaan Wright-Giemsa, tetapi tidak mempengaruhi ukuran atau bentuk
sel. Heparin sering digunakan untuk pengujian sel darah merah, pengujian
kerapuhan osmotik, dan analisis fungsional atau imunologi leukosit.
Heparin tidak sepenuhnya menghambat sel darah putih atau
penggumpalan trombosit. Trisodium sitrat adalah antikoagulan yang
disukai untuk studi trombosit dan koagulasi.
Konsentrasi antikoagulan yang digunakan dapat mempengaruhi
ukuran konsentrasi sel jika tidak sesuai dengan volume darah yang
dikumpulkan dan juga dapat mendistorsi morfologi seluler. Paling
sering, darah dikumpulkan langsung ke dalam tabung vakum
bertekanan negatif yang disiapkan secara komersial (tabung
Vacutainer; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), yang mengandung
konsentrasi antikoagulan yang benar bila diisi dengan tepat, sehingga
meminimalkan kesalahan.11 Darah antikoagulan dapat disimpan pada
suhu 4°C selama 24 jam tanpa mengubah jumlah sel atau morfologi
seluler secara signifikan.9 Namun, lebih baik melakukan analisis
hematologi sesegera mungkin setelah darah diperoleh.
Keandalan tes
Selain perolehan spesimen yang tepat, keandalan data memerlukan
metode pengujian yang tepat dan dapat direproduksi. Baik pengujian
manual dan otomatis dari spesimen hematologi harus ditafsirkan
berdasarkan presisi pengujian yang diharapkan, terutama ketika
mengevaluasi signifikansi perubahan kecil. Semua tes laboratorium
1
2 Bagian I Hematologi Laboratorium
dievaluasi sehubungan dengan akurasi dan reproduktifitas.
Ketepatan adalah perbedaan antara nilai terukur dan nilai sebenarnya,
yang menyiratkan bahwa nilai sebenarnya diketahui. Jelas, ini dapat
menimbulkan kesulitan ketika berhadapan dengan spesimen biologis.
Komite Nasional Standar Laboratorium Klinis (NCCLS) dan Institut
Standar Klinis dan Laboratorium (CLSI) telah berusaha
mengembangkan standar untuk menilai keakuratan pemeriksaan
apusan darah.11 dan penganalisa sel darah otomatis.2 Instrumentasi
otomatis memerlukan evaluasi jaminan kualitas yang teratur dan
kalibrasi yang cermat untuk mencapai sasaran kinerja yang diharapkan
dan kemampuan untuk mengumpulkan data yang akurat dan dapat
direproduksi.2,12,13 Selain itu, International Consensus Group for
Hematology Review telah menyarankan kriteria yang harus mengarah
pada tinjauan manual spesimen setelah analisis otomatis dan
penghitungan diferensial.3
jumlah sel
Jumlah sel adalah parameter penting dalam mengevaluasi darah. Jumlah sel
dapat ditentukan baik secara manual atau dengan penganalisis hematologi
otomatis. Baik dilakukan dengan metodologi manual atau otomatis, akurasi
dan presisi penghitungan bergantung pada pengenceran sampel darah
yang tepat, distribusi sel yang merata, dan pengukuran sampel yang tepat.
Karena darah mengandung sejumlah besar sel, pengenceran sampel
biasanya diperlukan untuk analisis yang akurat. Jenis pengencer tergantung
pada jenis sel yang akan dicacah. Jadi, jumlah sel darah merah memerlukan
pengenceran dengan media isotonik, sedangkan dalam jumlah sel darah
putih atau trombosit, pengencer yang melisiskan lebih banyak sel darah
merah sering digunakan untuk menyederhanakan penghitungan. Tingkat
pengenceran juga tergantung pada jenis sel. Secara umum, jumlah sel
darah merah membutuhkan lebih banyak pengenceran daripada yang
dibutuhkan untuk sel darah putih yang kurang melimpah. Kesalahan dalam
jumlah sel terutama disebabkan oleh kesalahan dalam pengukuran sampel,
pengenceran, atau penghitungan sel. Tingkat presisi tertinggi terjadi ketika
sejumlah besar sel dapat dievaluasi. Jelas, metode otomatis lebih unggul
daripada metode manual untuk menghitung sejumlah besar sel dan
meminimalkan kesalahan statistik. Tabel 1.1 mencantumkan nilai
reproduktifitas yang sebanding untuk metode penghitungan otomatis dan
manual (hemositometer).
/: /
Hitungan manual dilakukan dengan menggunakan mikroskop
setelah pengenceran sampel yang sesuai dalam a hemositometer,
ruang hitung yang dibangun khusus yang berisi volume tertentu. Sel
darah merah, leukosit, dan trombosit dapat dihitung. Karena
tt p
ketidaktepatan yang melekat pada penghitungan manual dan jumlah
waktu teknis yang diperlukan, sebagian besar penghitungan sel
sekarang dilakukan oleh instrumen otomatis yang meningkatkan
akurasi dan kecepatan analisis oleh cl
h
tabel 1.1
RepRoducibiLitas prosedur penghitungan darah
Dua Koefisien Variasi
Tipe Sel Hematologi Otomatis
Terhitung HemositometerA (%) Penganalisis (%)
sel merah ±11.0
sel darah putih ±16.0
TrombositB ±22.0
Retikulosit ±33.9
AKesalahan minimal. Kesalahan biasa.
BKesalahan mungkin lebih besar dengan rendah (<35 × 109/L) atau sangat tinggi (>450 × 109/L. jumlah
trombosit. Data berasal dari Bentley S, Johnson A, Bishop C. Evaluasi paralel dari empat penganalisis
hematologi otomatis. Am J Clin Pathol 1993;100:626–63214 dan Wintrobe M. Hematokrit sederhana dan
akurat. J Lab Clin Med 1929;15:287–28915.
manipulasi untuk entri uji, pengambilan sampel, pengenceran sampel,
dan analisis.16 Dengan otomatisasi yang meningkat, beberapa
penganalisis hematologi dapat digabungkan dengan instrumen yang
melakukan tes laboratorium lain menggunakan tabung darah yang
sama.17 Ada berbagai penganalisis hematologi otomatis yang tersedia,
tergantung pada volume sampel yang akan diuji dan kebutuhan
spesifik dari dokter yang memesan pengujian. Alat analisis ini memiliki
kisaran harga dan kapasitas beban kerja mulai dari yang sesuai untuk
kantor dokter individu atau fasilitas perawatan hingga yang
dibutuhkan di laboratorium referensi yang sibuk dengan kapasitas
lebih dari 100 sampel untuk dianalisis per jam.16
Kebanyakan penganalisis hematologi otomatis melakukan berbagai
pengukuran hematologi, selain penghitungan sel, seperti konsentrasi
hemoglobin (Hb), ukuran sel darah merah, dan perbedaan leukosit.
Banyak instrumen juga melakukan pengujian yang lebih khusus,
seperti jumlah retikulosit.18 Kemampuan penganalisis untuk
i. r
melakukan penghitungan diferensial WBC yang akurat, terutama yang
dapat melakukan diferensial lima bagian (menghitung neutrofil,
limfosit, monosit, eosinofil, dan basofil), telah menjadi kemajuan
teknologi yang signifikan selama 15 tahun terakhir. Metode otomatis
s
untuk jumlah dan perbedaan sel darah putih menggunakan beberapa
s
pendekatan teknis yang berbeda, termasuk pengukuran impedansi
listrik, hamburan cahaya diferensial, sifat optik, atau pewarnaan
n
antigen permukaan/sitokimia baik sendiri atau dalam kombinasi.19,20
a
Sebagian besar penganalisis hematologi generasi baru menggunakan
is
teknologi aliran optik sitometrik dengan atau tanpa pewarnaan sitokimia
tambahan untuk mendeteksi jenis sel tertentu seperti sel darah merah, sel
darah putih, dan trombosit (Gbr. 1.1).19,21,22 Alat analisis yang lebih baru
r
memiliki kemampuan tambahan untuk mendeteksi retikulosit sebagai
bagian dari diferensial hitung darah lengkap (CBC) normal menggunakan
e
pewarna RNA fluoresen dan banyak juga akan menghitung nomor sel darah
merah berinti berdasarkan sifat optiknya.23 Selain itu, banyak penganalisis
p
saat ini melakukan pengambilan sampel otomatis langsung dari tabung
.
p
i
Berbagai Sudut
dari Cahaya Tersebar
v
Aliran Sampel
Terfokus
Sinar laser
Sarung
±1.0 Sampel Sungai kecil
Nozzle Pakan
±1.5
±2.0
±5.0
Gambar 1.1. Jenis aliran optik sitometrik penganalisis hematologi otomatis. Sebuah suspensi-
sion sel dilewatkan melalui ruang aliran dan difokuskan ke aliran sampel sel tunggal. Sel-sel
melewati ruang dan berinteraksi dengan sinar laser. Penyebaran sinar laser pada sudut yang
berbeda direkam, menghasilkan sinyal yang diubah menjadi sinyal elektronik yang memberikan
informasi tentang ukuran sel, struktur, struktur internal, dan granularitas. (Diadaptasi dan
digambar ulang dari Cell-Dyn 3500 Operator's Manual. Santa Clara, CA: Abbott Diagnostics, 1993.)
 Bab 1 pemeriksaan darah dan sumsum tulang 3

dan gunakan sampel yang sangat kecil mulai dari 35 hingga 150 Ml untuk
analisis CBC lengkap. Menggunakan teknologi flow cytometric, beberapa
alat analisa juga memiliki kemampuan untuk mendeteksi populasi sel darah
spesifik dengan ekspresi antigen spesifik, seperti deteksi sel punca darah
tepi CD34 atau ledakan leukemia.24-26 Integrasi data dari pewarnaan
sitokimia atau antigenik dan sifat hamburan cahaya telah meningkatkan
akurasi diferensial lima bagian dan menurunkan jumlah sel yang tidak dapat
diidentifikasi yang memerlukan tinjauan teknisi untuk identifikasi.
Instrumen dari Abbott Laboratories (CELL-DYN),16,27
Horiba Medical (seri ABX Pentra), dan Sysmex (seri XE, seri XT, dan seri XS)16
,28,29 terutama menggunakan flow cytometry berbasis fluoresen sebagai
modalitas untuk analisis. Setiap sistem memiliki kombinasi pewarnaan
fluorokrom yang sedikit berbeda yang membantu dalam identifikasi sel
darah putih, sel darah merah, dan trombosit dalam kombinasi dengan
karakteristik hamburan cahaya. Semua menyediakan jumlah retikulosit
PARAMETER ANALISIS SEL
DARAH MERAH
Sel darah merah ditentukan oleh tiga nilai kuantitatif: volume sel darah
merah atau hematokrit (Hct), jumlah hemoglobin (Hb), dan konsentrasi sel
darah merah per satuan volume. Tiga indeks tambahan yang
menggambarkan karakteristik kualitatif rata-rata dari populasi sel darah
merah juga dikumpulkan. Ini adalah mean corpuscular volume (MCV), mean
corpuscular hemoglobin (MCH), dan mean corpuscular hemoglobin
konsentrasi (MCHC). Semua nilai ini dikumpulkan dan dihitung secara rutin
oleh penganalisis hematologi otomatis, sebagian besar menggantikan
banyak metode karakterisasi RBC manual atau semi-otomatis yang
digunakan sebelumnya, dengan pengecualian tertentu seperti yang
tercantum di bawah ini. Penggunaan penganalisis hematologi memberikan
tingkat presisi yang tinggi dibandingkan dengan pengukuran dan

i. r
terintegrasi dan perbedaan lima bagian. Kapasitas beban kerja berkisar perhitungan manual (Tabel 1.1 dan 1.2).
antara 70 hingga 106 sampel yang dianalisis per jam. Ketika retikulosit
dipesan sebagai bagian dari diferensial, kapasitas turun menjadi antara 40
Volume Sel darah merah yang dikemas (hematokrit)

s
dan 60 sampel per jam (memungkinkan pewarnaan dan deteksi fluoresensi
pewarna RNA). Instrumen oleh Siemens (seri Advia 120 dan 2120) Hematokrit adalah proporsi volume sampel darah yang ditempati oleh sel

s
menggunakan kombinasi teknik aliran sitometrik dan pewarnaan darah merah. Hct dapat ditentukan secara manual dengan sentrifugasi
peroksidase sitokimia untuk diferensial lima bagian. Instrumen ini darah pada kecepatan dan waktu tertentu dalam tabung gelas standar

n
mengintegrasikan data impedansi listrik, aliran hamburan cahaya dengan lubang seragam, seperti yang awalnya dijelaskan oleh Wintrobe.15
sitometrik, pewarnaan fluoresen karakteristik, dan pewarnaan sitokimia Ketinggian kolom sel darah merah setelah sentrifugasi dibandingkan

a
dengan total volume sampel darah menghasilkan Hct. Metode makro

Hematologi Laboratorium
untuk menghasilkan diferensial sel darah putih yang akurat. Teknologi

is
Siemens juga menghitung kadar hemoglobin, mengklaim bahwa ini (menggunakan tabung reaksi 3 mm) dengan sentrifugasi kecepatan rendah
menyebabkan lebih sedikit gangguan oleh jumlah sel darah putih yang atau metode mikro menggunakan tabung kapiler dan sentrifugasi
tinggi atau lipemia dalam spesimen.16,30,31 Instrumen dari Beckman/Coulter kecepatan tinggi juga dapat digunakan.

r
(seri Coulter DxH, seri LH 500, seri LH 750, seri LH 780) juga memanfaatkan Metode manual untuk mengukur Hct adalah cara yang sederhana dan
impedansi atau konduktivitas listrik dalam kombinasi dengan pendekatan akurat untuk menilai status sel darah merah. Mereka mudah dilakukan

e
hamburan cahaya, mengintegrasikan teknologi ini untuk memberikan dengan sedikit peralatan khusus, memungkinkan adaptasi untuk situasi di
analisis lengkap dan diferensial lima bagian (Gbr. 1.2). Seri Beckman/ mana analisis sel otomatis tidak tersedia atau untuk penggunaan kantor.

p
Coulter mencakup sel darah merah berinti dan jumlah retikulosit Namun, beberapa sumber kesalahan melekat dalam teknik ini. Spun Hct

.
mengukur konsentrasi sel darah merah, bukan massa sel darah merah.
dalam setiap diferensial. Kapasitasnya adalah 45 per jam ketika Oleh karena itu, pasien dalam syok atau dengan penurunan volume

p
sampel retikulosit disertakan dan 100 sampel per jam untuk CBC mungkin memiliki pengukuran Hct normal atau tinggi karena

i
tanpa jumlah retikulosit.16 hemokonsentrasi meskipun massa sel darah merah menurun. Sumber
kesalahan teknis dalam penentuan Hct manual biasanya timbul dari

v
konsentrasi antikoagulan yang tidak tepat,32 pencampuran sampel yang

/: /
buruk, atau sentrifugasi yang tidak memadai.15 Kesalahan bawaan lainnya
WBC sel darah merah

REL#

tt p
V
HAI
L
tabel 1.2
50 100 200 300 f
kamu
M PLT
RepRoducibiLitas indeks sel darah merah
E

h
REL#

% Kesalahan (±2

2 10 20 30 f
Koefisien dari
DF 1
Indeks Metode yang Digunakan Variasi)

ID# 1 WBC 6.7 sel darah merah 4.56 Konsentrasi hemoglobin Spektrofotometri 1.0–2.0
nomor 2 % # HGB 13.5 Otomatis <1.0
Urutan # NE 59,4 4.1 HCT 40.3 Rata-rata volume sel darah Hemositometer 9.5
LY 31.6 2.1 MCV 88.3 Otomatis <1.0
TANGGAL: 21/06/96 MO 7.7 0,5 KIA 29.5
08:55:45 EO 0,7 0,0 MCHC 33.5
Berarti sel darah Hemositometer 10.0
WAKTU:
BA 0.6 0,0 RDW 13.4
hemoglobin Otomatis 0.6–1.2
Cass/Pos S
Berarti sel darah Otomatis 1.0–1.5
Pop WBC Normal
PLT 202 konsentrasi hemoglobin
Pop RBC Normal
MPV 8.2
PLT Pop Biasa
Data berasal dari Bentley S, Johnson A, Bishop C. Evaluasi paralel dari empat penganalisis
Gambar 1.2. Histogram dan hasil cetak yang dihasilkan oleh penganalisis hematologi otomatis hematologi otomatis. Am J Clin Pathol 1993;100:626–632; NCCLS. Referensi dan prosedur
Coulter menggunakan hamburan cahaya dan impedansi listrik. BA, basofil; EO, eosinofil; standar untuk penentuan kuantitatif hemoglobin dalam darah, edisi ke-2. Dokumen H15-A2.
HCT, hematokrit; HGB, hemoglobin; LY, limfosit; KIA, berarti hemoglobin sel darah; MCHC, berarti Villanova, PA: NCCLS, 1994 dan Komite Internasional untuk Standardisasi Hematologi.
konsentrasi hemoglobin sel darah; MCV, rata-rata volume sel darah; MO, monosit; MPV, rata-rata volume Rekomendasi untuk metode referensi untuk hemoglobinometri dalam darah manusia (Standar
trombosit; NE, neutrofil; PLT, trombosit; sel darah merah, sel darah merah; RDW, lebar distribusi sel darah ICSH 1986) dan spesifikasi untuk persiapan referensi hemoglobinsianida internasional, edisi
merah; WBC, sel darah putih. ke-3. Clin Lab Haematol 1987;9:73–79.
4 Bagian I Hematologi Laboratorium
dalam penentuan Hct manual muncul dari perangkap plasma di kolom sel
darah merah. Ini dapat menjelaskan 1% hingga 3% dari volume dalam
metode tabung mikrokapiler, dengan metode tabung makro yang menjebak
plasma yang relatif lebih banyak.33,34 Perlu dicatat bahwa sel darah merah
abnormal (misalnya, sel sabit, sel mikrositik, sel makrositik, atau sferosit)
sering kali menjebak volume plasma yang lebih tinggi karena peningkatan
kekakuan seluler, mungkin mencapai hingga 6% dari volume sel darah
merah.34 Hcts yang sangat tinggi, seperti pada polisitemia, mungkin juga
memiliki perangkap plasma berlebih. Metode manual Hct biasanya memiliki
koefisien presisi variasi (CV) sekitar 2%.33
Penganalisis otomatis tidak bergantung pada teknik sentrifugasi untuk
menentukan Hct, melainkan menghitung Hct dengan pengukuran langsung
jumlah sel darah merah dan volume sel darah merah (Hct = jumlah sel darah
merah × rata-rata volume sel darah merah). Nilai Hct otomatis sangat
paralel dengan pengukuran yang diperoleh secara manual, dan Hct manual
digunakan sebagai metode referensi untuk penganalisis hematologi
(dengan koreksi untuk kesalahan yang disebabkan oleh perangkap plasma).
Kesalahan perhitungan Hct otomatis lebih sering terjadi pada pasien
dengan polisitemia35 atau tekanan osmotik plasma abnormal.36 Metode
manual penentuan Hct mungkin lebih disukai dalam kasus ini. Ketepatan
sebagian besar Hcts otomatis adalah <1% (CV).16
Konsentrasi hemoglobin
Hemoglobin (Hb) adalah protein yang sangat berwarna,
memungkinkan pengukurannya dengan teknik spektrofotometri.
Hemoglobin ditemukan dalam darah dalam berbagai bentuk, termasuk
oksihemoglobin, karboksihemoglobin, methemoglobin, dan komponen
kecil lainnya. Ini dapat diubah menjadi senyawa stabil tunggal,
cyanmethemoglobin, dengan mencampur darah dengan larutan
Drabkin (mengandung kalium ferricyanide dan kalium sianida).37,38
Sulfhemoglobin tidak diubah tetapi jarang ada dalam jumlah yang
signifikan. Absorbansi sianhemoglobin diukur dalam spektrofotometer pada
p
540 nm untuk menentukan Hb. Teknik ini digunakan baik dalam penentuan
.
manual dan penganalisis hematologi otomatis. Hb dinyatakan dalam gram
per desiliter (g/dl) darah lengkap. Kesalahan utama dalam pengukuran
p
timbul dari kesalahan pengenceran atau peningkatan kekeruhan sampel
i
karena lisis sel darah merah yang tidak tepat, leukositosis, atau peningkatan
kadar lipid atau protein dalam plasma.39–41
v
Dengan metode otomatis, presisi untuk penentuan hemoglobin adalah
/: /
<1% (CV).16
jumlah sel merah
Metode manual untuk menghitung sel darah merah telah terbukti sangat
tt p
tidak akurat, dan penghitung otomatis memberikan refleksi jumlah sel
darah merah yang jauh lebih akurat.42 Baik eritrosit maupun leukosit
dihitung setelah pengenceran darah lengkap dalam larutan isotonik. Karena
jumlah sel darah merah jauh melebihi jumlah sel darah putih (dengan faktor
h
500 atau lebih), kesalahan yang disebabkan oleh penghitungan kedua jenis
sel dapat diabaikan. Namun, bila terdapat leukositosis yang nyata, jumlah
sel darah merah dan penentuan volume mungkin salah kecuali dikoreksi
untuk sel darah putih. Ketepatan yang diamati untuk penghitungan sel
darah merah menggunakan penganalisis hematologi otomatis adalah <1%
(CV)16 dibandingkan dengan nilai estimasi minimal 11% dengan cara manual.
42
Rata-rata Volume Sel
Volume rata-rata sel darah merah adalah parameter yang berguna
yang digunakan dalam klasifikasi anemia dan dapat memberikan
wawasan tentang patofisiologi gangguan sel darah merah.43–45 MCV
biasanya diukur secara langsung dengan instrumen otomatis tetapi
juga dapat dihitung dari jumlah eritrosit dan Hct dengan
menggunakan rumus berikut15:
MCV = Hct (L/L) × 1.000 / jumlah sel darah merah (1012/L)
MCV diukur dalam femtoliter (fl, atau 10–15 L). Menggunakan metode
otomatis, nilai ini diturunkan dengan membagi penjumlahan
volume sel darah merah dengan jumlah eritrosit. CV di sebagian besar
sistem otomatis adalah sekitar 1%,16 dibandingkan dengan ~ 10% untuk
metode manual.33
Aglutinasi sel, seperti pada penyakit aglutinin dingin atau paraproteinemia,
dapat menyebabkan peningkatan MCV yang salah.46 Sebagian besar penganalisis
otomatis mengeluarkan nilai MCV di atas 360 fl, sehingga mengecualikan
sebagian besar rumpun sel darah merah, meskipun ini dapat secara keliru
menurunkan penentuan Hct. Selain itu, hiperglikemia berat (glukosa
> 600 mg/dl) dapat menyebabkan pembengkakan osmotik sel darah merah, yang
menyebabkan peningkatan MCV palsu.36,47
Berarti hemoglobin sel darah
KIA adalah ukuran kandungan hemoglobin rata-rata per sel darah merah.
Ini dapat dihitung secara manual atau dengan metode otomatis
menggunakan rumus berikut:15:
i. r
KIA = hemoglobin (g/L)/jumlah sel darah merah (1012/L)
KIA dinyatakan dalam pikogram (hal, atau 10–12 G). Dengan demikian, MCH
s
merupakan cerminan dari massa hemoglobin. Pada anemia sekunder akibat
gangguan sintesis hemoglobin, seperti anemia defisiensi besi, massa hemoglobin
s
per sel darah merah menurun, menghasilkan nilai KIA yang lebih rendah.
Pengukuran KIA mungkin salah ditinggikan oleh hiperlipidemia,41
n
karena peningkatan kekeruhan plasma akan salah meningkatkan
pengukuran hemoglobin. Sentrifugasi sampel darah untuk menghilangkan
a
kekeruhan diikuti dengan penentuan hemoglobin manual memungkinkan
is
koreksi nilai KIA. Leukositosis juga dapat meningkatkan nilai MCV secara
palsu.39 CV untuk analisis otomatis KIA adalah
<1% di sebagian besar penganalisis modern, dibandingkan dengan sekitar
r
10% untuk metode manual.33
e
Konsentrasi hemoglobin sel darah rata-rata
Konsentrasi rata-rata hemoglobin dalam volume sel darah merah atau
MCHC tertentu dapat dihitung dengan rumus berikut:15:
MCHC = hemoglobin (g/dl)/Hct (L/L)
MCHC dinyatakan dalam gram hemoglobin per desiliter sel darah
merah yang dikemas, mewakili rasio massa hemoglobin dengan
volume sel darah merah. Dengan pengecualian sferositosis herediter
dan beberapa kasus sel sabit homozigot atau penyakit hemoglobin C,
nilai MCHC tidak akan melebihi 37 g/dl. Tingkat ini mendekati nilai
kelarutan hemoglobin, dan peningkatan Hb lebih lanjut dapat
menyebabkan kristalisasi. Keakuratan penentuan MCHC dipengaruhi
oleh faktor-faktor yang berdampak pada pengukuran Hct (plasma
trapping atau adanya sel darah merah abnormal) atau hemoglobin
(hiperlipidemia, leukositosis).39 CV untuk MCHC untuk metode otomatis
berkisar antara 1,0% dan 1,5%.16
Seperti disebutkan di atas, MCV, MCH, dan MCHC mencerminkan
nilai rata-rata dan mungkin tidak cukup menggambarkan sampel
darah ketika populasi campuran sel darah merah hadir. Misalnya, pada
anemia sideroblastik, populasi sel darah merah dimorfik dari sel
hipokromik dan normokromik mungkin ada, namun indeksnya
mungkin normokromik dan normositik. Penting untuk memeriksa
apusan darah serta histogram sel darah merah untuk mendeteksi
populasi dimorfik tersebut.3 MCV adalah nilai yang sangat berguna
dalam klasifikasi anemia,16,45,48 tetapi KIA dan KIA seringkali tidak
menambahkan informasi yang signifikan dan relevan secara klinis.
Namun, KIA dan KIA memainkan peran penting dalam pengendalian
kualitas laboratorium karena nilai-nilai ini akan tetap stabil untuk
spesimen tertentu dari waktu ke waktu.49
Lebar Distribusi Sel merah
Lebar distribusi sel darah merah (RDW) adalah pengukuran sel darah merah
yang mengkuantifikasi heterogenitas volume seluler yang mencerminkan
kisaran ukuran sel darah merah dalam sampel.43,50,51,52 RDW telah
diusulkan untuk berguna dalam klasifikasi awal anemia karena menjadi

abnormal lebih dini pada anemia defisiensi nutrisi dibandingkan parameter
sel darah merah lainnya, terutama pada kasus anemia defisiensi besi.43,53
RDW sangat berguna dalam mengkarakterisasi anemia mikrositik,
memungkinkan diskriminasi antara anemia defisiensi besi tanpa
komplikasi (RDW tinggi, MCV normal hingga rendah) dan talasemia
heterozigot tanpa komplikasi (RDW normal, MCV rendah),43,53–55
meskipun tes lain biasanya diperlukan untuk mengkonfirmasi
diagnosis.56 RDW juga berguna dalam mengidentifikasi fragmentasi sel
darah merah, aglutinasi, atau populasi sel dimorfik (termasuk pasien
yang telah menjalani transfusi, memiliki anemia sideroblastik, atau
baru-baru ini dirawat karena kekurangan nutrisi).53,57
Jumlah retikulosit
Penentuan jumlah retikulosit atau sel darah merah imatur dan tidak berinti
yang masih mempertahankan RNA memberikan informasi yang berguna
tentang kapasitas sumsum tulang untuk mensintesis dan melepaskan sel
darah merah sebagai respons terhadap tantangan fisiologis, seperti anemia.
Di masa lalu, penghitungan retikulosit dilakukan secara manual
menggunakan pewarnaan supravital dengan metilen biru yang akan
menodai RNA yang diendapkan sebagai jaring atau butiran biru tua
(setidaknya dua per sel), memungkinkan retikulosit untuk diidentifikasi dan
dihitung secara manual.58 Nilai normal untuk retikulosit pada orang dewasa
adalah 0,5% hingga 1,5%, meskipun pada bayi baru lahir dapat mencapai
2,5% hingga 6,5% (turun ke tingkat dewasa pada minggu kedua kehidupan).
Karena jumlah retikulosit relatif rendah, CV untuk penghitungan retikulosit
relatif besar (10% hingga 20%).59
Untuk meningkatkan akurasi penghitungan retikulosit, metode deteksi
otomatis untuk mendeteksi pewarnaan memungkinkan lebih banyak sel
untuk dianalisis, sehingga meningkatkan akurasi dan presisi penghitungan.
18,60,61 Sebagian besar penganalisis hematologi otomatis terbaru memiliki
penghitungan retikulosit otomatis sebagai bagian dari kemampuan
pengujian dan memungkinkan jumlah retikulosit disertakan dengan
p
parameter hitung darah lengkap rutin. Retikulosit dideteksi oleh pewarna
.
fluoresen yang mengikat RNA. Perbandingan instrumen yang berdiri sendiri
dan penganalisis hematologi terintegrasi menunjukkan akurasi yang unggul
p
jika dibandingkan dengan metode penghitungan manual, dengan CV 5%
i
hingga 8%.16,62
v
/: /
Analisis Leukosit
Jumlah Sel Darah Putih
tt p
Leukosit dapat dihitung dengan metode manual atau penganalisis
hematologi otomatis. Leukosit dihitung setelah pengenceran darah dalam
pengencer yang melisiskan sel darah merah (biasanya asam atau deterjen).
Jumlah leukosit yang ada jauh lebih rendah membutuhkan pengenceran
darah yang lebih sedikit daripada yang dibutuhkan untuk jumlah sel darah
h
merah (biasanya pengenceran 1:20, meskipun mungkin lebih sedikit pada
kasus leukositopenia atau lebih banyak dengan leukositosis). Penghitungan
manual dilakukan dengan menggunakan hemositometer atau kamar
hitung. Seperti jumlah sel darah merah, jumlah leukosit manual memiliki
kesalahan yang lebih melekat, dengan CV berkisar dari 6,5% pada kasus
dengan jumlah sel darah putih normal atau meningkat hingga 15% pada
kasus dengan penurunan jumlah sel darah putih. Metode otomatis secara
khas menghasilkan CV dalam kisaran 1% hingga 3%.16 Jumlah leukosit
otomatis dapat meningkat palsu dengan adanya cryoglobulin atau
cryofibrinogen,63 trombosit agregat,64 dan sel darah merah berinti, atau
ketika ada lisis sel darah merah yang tidak lengkap, membutuhkan
penghitungan manual. Jumlah neutrofil yang rendah palsu juga telah
dilaporkan karena aglutinasi granulosit sekunder akibat interaksi
imunoglobulin permukaan.65,66
Diferensial Leukosit
Sel darah putih dianalisis untuk menemukan persentase relatif dari setiap
jenis sel dengan jumlah leukosit yang berbeda. Standar seragam untuk
Bab 1 pemeriksaan darah dan sumsum tulang 5
melakukan penghitungan leukosit diferensial manual pada apusan
darah telah diusulkan oleh CLSI67 untuk memastikan reproduktifitas
hasil antar laboratorium. Penting untuk memindai seluruh apusan
darah dengan daya rendah untuk memastikan bahwa semua sel
atipikal dan pola distribusi seluler dikenali. Pada sediaan apusan yang
didorong dengan baji, leukosit cenderung berkumpul di tepi dan
samping sediaan apus darah daripada di tengah sediaan. Sel yang
lebih besar (ledakan, monosit) juga cenderung berkumpul di tepi
apusan darah.68 Penggunaan preparat kaca penutup dan sistem
pemintal cenderung meminimalkan artefak distribusi sel ini. Untuk
apusan yang didorong dengan baji, direkomendasikan bahwa pola
benteng dari pemindaian apusan digunakan di mana seseorang
menghitung bidang dalam satu arah, kemudian mengubah arah dan
menghitung jumlah bidang yang sama sebelum mengubah arah lagi
untuk meminimalkan kesalahan distribusi.67
Dalam penghitungan leukosit manual, tiga sumber kesalahan utama
i. r
ditemukan: distribusi sel pada slide, kesalahan pengenalan sel, dan
kesalahan pengambilan sampel statistik. Persiapan dan pewarnaan apusan
darah yang buruk merupakan kontributor utama untuk pengenalan sel dan
s
kesalahan distribusi sel.69 Kesalahan statistik adalah sumber utama
kesalahan yang melekat pada penghitungan manual, karena ukuran sampel
s
yang kecil dalam hitungan 100 atau 200 sel. CV dalam penghitungan manual
adalah antara 5% dan 10% dan juga sangat bergantung pada keterampilan
n
teknisi yang melakukan diferensial. Akurasi dapat ditingkatkan dengan
meningkatkan jumlah sel yang dihitung, tetapi untuk tujuan praktis,
a
sebagian besar laboratorium akan melakukan diferensial pada 100 sel darah
Hematologi Laboratorium
is
putih.70,71
Diferensial leukosit otomatis secara nyata mengurangi waktu dan biaya
untuk melakukan pemeriksaan rutin serta meningkatkan akurasi pada CV
r
dari 3% hingga 5%.70,71,72 Namun, analisis otomatis tidak mampu secara
akurat mengidentifikasi dan mengklasifikasikan semua jenis sel dan sangat
e
tidak sensitif terhadap sel abnormal atau belum matang. Oleh karena itu,
sebagian besar penganalisis akan menandai kemungkinan populasi sel
darah putih abnormal, yang menunjukkan perlunya pemeriksaan oleh ahli
morfologi yang terampil untuk identifikasi.72 Kapasitas untuk melakukan
diferensial leukosit otomatis dimasukkan ke dalam penganalisis hematologi,
yang mengidentifikasi sel berdasarkan ukuran seluler, kompleksitas sel,
atau karakteristik pewarnaan sebagai bagian dari hitung darah lengkap,
memungkinkan untuk menghasilkan hitung diferensial lima bagian yang
menghitung neutrofil , monosit, limfosit, eosinofil, dan basofil.16
Sebagian besar sistem melakukan penghitungan sel pada spesimen
melalui analisis sitometrik aliran kontinu sampel darah di mana sel
darah merah telah dilisiskan dan sel darah putih diperbaiki. Sel-sel
disuspensikan dalam pengencer dan dilewatkan melalui sel aliran optik
dalam aliran kontinu sehingga sel tunggal dianalisis untuk ukuran sel
(hamburan maju) dan kompleksitas (hamburan cahaya medan gelap)
(Gbr. 1.1) atau karakteristik sitokimia pewarnaan mieloperoksidase
(detektor medan terang). Data diplot sebagai scattergram (Gbr. 1.2),
yang memungkinkan sel darah putih dibagi menjadi lima bagian
diferensial (neutrofil, limfosit, monosit, eosinofil, dan basofil) dan juga
menunjukkan sel besar yang tidak diwarnai atau tidak terklasifikasi.
Limfosit dicirikan sebagai sel kecil (sebar rendah). Limfosit atipikal yang
lebih besar, blas, atau sel plasma yang bersirkulasi jatuh ke dalam sel
yang lebih besar dengan saluran dengan kompleksitas rendah.
Neutrofil memiliki kompleksitas yang lebih tinggi dan muncul sebagai
sel yang lebih besar. Eosinofil tampak lebih kecil daripada neutrofil
karena mereka cenderung menyerap sebagian dari hamburan cahaya
mereka sendiri. Monosit memiliki tingkat kompleksitas yang lebih
rendah dan biasanya ditemukan di antara neutrofil dan limfosit. Untuk
menghitung basofil, yang tidak memiliki karakteristik pewarnaan
spesifik dan sulit untuk dihitung dengan teknik aliran otomatis, saluran
lobularitas basofil-nuklir dapat digunakan. Untuk penentuan ini, sel
darah merah dan sel darah putih dilisiskan secara berbeda,
meninggalkan inti leukosit kosong, dengan pengecualian basofil, yang
resisten terhadap lisis dan kemudian dapat dihitung berdasarkan
ukuran sel yang relatif besar karena sitoplasma yang tertahan.
6 Bagian I Hematologi Laboratorium
inti limfosit. Populasi sel yang abnormal akan menghasilkan tanda,
yang menunjukkan perlunya tinjauan morfologi dari apusan perifer.3
Analisis menggunakan teknik ini memeriksa ribuan sel per sampel,
meningkatkan akurasi statistik.16
Sebagian besar penganalisis hematologi saat ini memiliki pengaturan
yang memungkinkan evaluasi spesimen yang sangat hiposelular, seperti
cairan tubuh. Mereka dapat digunakan untuk analisis cairan ini untuk
penghitungan sel darah merah dan sel darah putih, serta memberikan lima
bagian hitungan diferensial sel darah putih. Karena pengambilan sampel
jumlah sel yang lebih tinggi dalam spesimen yang relatif hiposelular ini,
akurasi jumlah sel dan penghitungan diferensial adalah
ditingkatkan.30,31,73–75
Beberapa instrumen, seperti Advia 2120 dan Coulter LH755, juga
memiliki teknologi preparasi apusan darah otomatis terintegrasi yang
memungkinkan preparasi apusan langsung dari tabung tempat
analisis CBC dilakukan. Dengan demikian, tabung dimasukkan sekali ke
dalam satu mesin untuk memungkinkan analisis CBC serta persiapan
apusan darah tepi.16 Banyak produsen juga memiliki pembuat slide
dan pewarna otomatis, yang menyediakan apusan baji hingga 80 slide
per jam langsung dari tabung CBC; namun, ini umumnya merupakan
instrumen yang berdiri sendiri yang terpisah dari penganalisis
hematologi. Teknologi push smear otomatis membantu memberikan
keseragaman teknis dalam persiapan apusan darah serta pewarnaan.
Namun, ada sedikit fleksibilitas dalam menyesuaikan karakteristik
noda. Instrumen ini mengambil sampel langsung dari tabung, juga
meminimalkan penanganan sampel oleh staf teknis.
Selain teknologi yang memiliki kemampuan untuk membuat dan
mewarnai slide, beberapa teknologi diferensial otomatis melalui pencitraan
kini tersedia. Misalnya, Sysmex (CellaVision) memiliki penganalisis gambar
otomatis yang dengan pengenalan pola akan menangkap gambar digital
100 hingga 500 sel dalam noda dan mengklasifikasikannya ke dalam
kategori morfologis untuk memberikan perbedaan lima bagian. Tergantung
p
pada model yang digunakan, teknologi ini memiliki kemampuan untuk
.
melakukan antara 20 dan 60 diferensial digital otomatis per jam. Sistem
memiliki kapasitas untuk menyimpan gambar dan berguna dalam melatih
p
teknologi dalam mengenali jenis sel tertentu serta menyediakan sarana
i
yang mudah diakses dimana apusan yang diperoleh pada waktu yang
berbeda dari satu pasien dapat dibandingkan secara morfologis.76 Sistem
v
ini memiliki keterbatasan dalam kemampuan untuk mengidentifikasi sel
/: /
yang abnormal secara morfologis, sehingga spesimen dengan perubahan
displastik, varian morfologi yang tidak biasa, atau artefak yang signifikan
mungkin tidak dapat dievaluasi atau dapat memberikan data yang salah.77,
78,79 Seringkali sistem ini akan menempatkan persentase tertentu dari sel di
tt p
area yang tidak dapat diklasifikasikan, memerlukan tinjauan oleh ahli
teknologi untuk identifikasi definitif jenis sel dan penyelesaian diferensial.
Karena mikroskop diotomatisasi, ada pemindaian seragam setiap slide dan
gambar ditampilkan di layar komputer, mengurangi waktu teknisi
mikroskop dan variabilitas pola pemindaian, dan juga memungkinkan
h
kemampuan untuk memperbesar gambar yang diambil secara digital.78,80
pLateLet anaLysis
Trombosit adalah fragmen sitoplasma berinti yang berukuran 2 hingga 4 . M
m dengan diameter. Seperti komponen darah lainnya, mereka dapat
dihitung dengan metode manual atau otomatis. Metode manual melibatkan
pengenceran sampel darah dan pencacahan dalam ruang hitung atau
hemositometer menggunakan mikroskop fase kontras. Sumber kesalahan
serupa dengan teknik penghitungan manual lainnya dan termasuk
kesalahan pengenceran dan jumlah kejadian yang dihitung rendah. CV,
terutama pada pasien dengan trombositopenia, mungkin
> 15%.81,82 Trombosit dihitung dalam penganalisis hematologi otomatis setelah
pengangkatan sel darah merah dengan sedimentasi atau sentrifugasi, atau
menggunakan darah lengkap. Trombosit diidentifikasi dengan hamburan cahaya,
karakteristik impedansi, atau pewarnaan antigen trombosit.16,83 Ini memberikan
jumlah trombosit yang sangat andal dengan CV <2%. Salah rendah
Jumlah trombosit mungkin disebabkan oleh adanya gumpalan trombosit
atau aglutinin trombosit64 atau adsorpsi trombosit ke leukosit.84,85
Fragmen sel darah merah atau leukosit dapat secara salah meningkatkan
jumlah trombosit otomatis, tetapi ini biasanya menimbulkan histogram
abnormal yang mengidentifikasi hasil palsu.86,87
Penganalisis hematologi otomatis juga menentukan volume trombosit
rata-rata (MPV), yang telah berkorelasi dengan beberapa keadaan penyakit.
88,89,90 Secara umum, MPV memiliki hubungan terbalik dengan jumlah
trombosit, dengan volume trombosit yang lebih besar (sekunder untuk
produksi trombosit baru) terlihat pada pasien trombositopenia di mana
trombosit menurun karena kerusakan perifer (seperti pada purpura
trombositopenik idiopatik).90,91,92 MPV juga meningkat pada gangguan
mieloproliferatif.93 Namun, perlu dicatat bahwa trombosit cenderung
membengkak selama 2 jam pertama pada antikoagulan EDTA, menyusut
lagi dengan penyimpanan yang lebih lama.94,95 Penurunan MPV telah
dikaitkan dengan hipoplasia megakariositik dan terapi obat sitotoksik.96
i. r
Trombosit retikulat adalah trombosit yang baru dilepaskan yang
mempertahankan RNA residu, analog dengan retikulosit sel darah merah. Jumlah
trombosit retikulasi memberikan perkiraan trombopoiesis dan mungkin berguna
s
dalam membedakan sindrom penghancuran trombosit dari produksi trombosit
hipoplastik.97,98 Trombosit retikulat dapat dideteksi dengan metode flow
s
cytometric menggunakan pewarna oranye tiazol yang berikatan dengan RNA99
atau dengan penganalisis hematologi otomatis,100,101
n
meskipun tidak diukur secara rutin. Nilai normal bervariasi antara 3%
dan 20%, dan peningkatan 2,5-4,5 kali lipat dalam jumlah trombosit
a
retikulat terlihat dalam pengaturan klinis purpura trombositopenik
is
idiopatik.102 Peningkatan platelet reticulated dapat menandai
kembalinya produksi platelet setelah kemoterapi.103
r
kelebihan dan sumber
e
dari eRRoR dengan HematoLogy
otomatis
Jelas, penggunaan penganalisis hematologi otomatis telah mengurangi
biaya laboratorium dan waktu penyelesaian bertepatan dengan
peningkatan akurasi dan reproduktifitas jumlah darah. CV untuk sebagian
besar parameter yang diukur berada pada kisaran 1% hingga 2%. Tingkat
reproduktifitas ini tidak dapat dicapai dengan penggunaan sebagian besar
teknik manual (Tabel 1.1 dan 1.2).
Terlepas dari tingkat akurasi yang tinggi ini, beberapa potensi kesalahan
dapat membatalkan pengumpulan data otomatis. Kalibrasi instrumentasi
yang tepat sangat penting untuk pengumpulan data yang akurat.
Pengaturan arus yang salah, yang menentukan nilai penghitungan ambang
serta variasi dalam volume penghitungan atau karakteristik aliran sampel,
berdampak negatif pada akurasi data. Kegagalan listrik atau mekanik serta
fluktuasi tegangan kecil dapat menyebabkan kesalahan yang nyata dalam
pengumpulan data. Kalibrasi instrumentasi yang cermat pada awalnya,
diikuti dengan evaluasi reproduktifitas yang sering dilakukan dengan
analisis sampel dengan konsentrasi sel yang diketahui, merupakan ukuran
kontrol kualitas yang penting.104 Metode referensi untuk kalibrasi instrumen
telah dikembangkan oleh NCCLS dan ICSH dan digunakan secara luas oleh
rumah sakit dan laboratorium klinis untuk memastikan kepatuhan terhadap
peraturan.49,67,105
Keadaan penyakit tertentu juga dikaitkan dengan hasil yang tinggi atau
rendah, meskipun beberapa di antaranya spesifik untuk jenis instrumentasi
tertentu (diringkas dalam Tabel 1.3). Oleh karena itu, nilai individu yang
diperoleh dari penganalisis hematologi otomatis harus diinterpretasikan
dalam konteks dengan temuan klinis. Selain itu, pemeriksaan yang cermat
dari film darah yang diwarnai sering kali memberikan informasi tambahan
yang mungkin tidak tercermin dalam nilai rata-rata yang merupakan data
otomatis. Misalnya, penurunan jumlah sel darah merah, makrositosis, dan
MCHC yang sangat tinggi telah diamati pada pasien dengan penyakit
aglutinin dingin dengan amplitudo termal yang lebih tinggi dan pada
beberapa pasien dengan peningkatan viskositas serum.63 Kadar paraprotein
yang tinggi dapat menyebabkan peningkatan kadar hemoglobin yang salah,
oleh karena itu mempengaruhi KIA dan
tabel 1.3

GANGGUAN DAN KONDISI YANG DAPAT MENURUNKAN AKURASI SEL DARAHA

Komponen Gangguan/Kondisi Efek pada Jumlah Sel Alasan

sel merah Mikrositosis atau skistosit Mungkin meremehkan RBC Ambang bawah jendela penghitungan RBC
lebih besar dari ukuran mikrosit

Tubuh Howell-Jolly Dapat meningkatkan jumlah trombosit secara Badan Howell-Jolly memiliki ukuran yang mirip

palsu (hanya di penghitung trombosit darah utuh) dengan trombosit

Polisitemia Mungkin meremehkan RBC Peningkatan penghitungan kebetulan

sel darah putih Leukositosis Melebih-lebihkan RBC Peningkatan penghitungan kebetulan

Leukemia akut dan leukemia Dapat secara palsu menurunkan WBC Peningkatan kerapuhan leukosit, termasuk bentuk yang

limfositik kronis, infeksi virus belum matang

Kemoterapi leukemia akut Dapat secara artifak meningkatkan jumlah trombosit Nuklir sel leukemia atau fragmen sitoplasma

i. r
diidentifikasi sebagai trombosit

Trombosit Aglutinin trombosit Mungkin meremehkan jumlah trombosit, Penggumpalan trombosit

terkadang dengan peningkatan palsu dalam WBC Agregat dapat diidentifikasi sebagai leukosit

s
Plasma Aglutinin dingin Dapat meremehkan sel darah merah dengan Sel darah merah ganda, kembar tiga, dan

makrositosis palsu sebagainya telah meningkat volumenya

s
Krioglobulin, kriofibrinogen Variasi jumlah trombosit Endapan protein dapat diidentifikasi sebagai
trombosit

n
RBC, jumlah sel darah merah; WBC, jumlah sel darah putih.

Hematologi Laboratorium
ABeberapa contoh ini hanya memengaruhi penghitungan jika instrumen tertentu digunakan. Efeknya tergantung pada pengenceran, larutan yang digunakan, dan suhu spesimen.

is
Diadaptasi dari Koepke JA. Hematologi laboratorium. New York, NY: Churchill Livingstone, 1984.

r
perhitungan MCHC.40 Penganalisis yang lebih tua melaporkan peningkatan persiapan Apusan Darah
palsu dalam kadar hemoglobin ketika jumlah sel darah putih melebihi 30 ×

e
109/L karena peningkatan kekeruhan, tetapi ini menurun dengan sistem Film darah dapat dibuat pada slide kaca atau kaca penutup. Setiap
aliran yang lebih baru sehingga kadar hemoglobin tetap sangat akurat metode memiliki kelebihan dan kekurangan tertentu.2.109,110,111
Apusan darah sering dibuat dari sampel darah antikoagulan yang

p
dalam menghadapi jumlah sel darah putih setinggi 100 × 109/L16
tersisa setelah analisis hematologi otomatis atau disiapkan pada saat

.
Jumlah sel darah putih yang sangat tinggi juga dapat secara salah meningkatkan
analisis. Namun, artefak dalam penampilan sel dan pewarnaan dapat
jumlah sel darah merah dan Hct karena jumlah sel darah putih dimasukkan ke
diinduksi oleh antikoagulan.11

p
dalam jumlah sel darah merah. Kadar glukosa yang tinggi (>400 hingga 600 mg/

i
dl) dan hiperosmolaritas terkait menyebabkan pembengkakan sel darah merah Morfologi dan pewarnaan yang optimal diperoleh dari darah
dan menghasilkan MCV dan Hct tinggi dengan MCHC rendah palsu.36.106 nonantikoagulasi, paling sering dari prosedur fingerstick. Menyeret sel

v
Peningkatan kekeruhan yang terkait dengan hiperlipidemia juga dapat secara mekanis melintasi kaca slide atau kaca penutup dan distribusi
darah yang tidak merata juga dapat merusak sel; Namun, artefak ini

/: /
menyebabkan peningkatan kadar hemoglobin, KIA, dan MCHC yang salah.41
dapat diminimalkan dengan teknik yang tepat.2
Meskipun tingkat akurasi dan presisinya tinggi, penganalisis hematologi
otomatis biasanya memiliki data yang membuat tanda peringatan pada 10% Apusan kaca penutup (Gbr. 1.3A) dibuat dengan menggunakan grade
hingga 25% sampel, yang memerlukan pemeriksaan apusan darah secara manual. datar yang baik, no. 1, 0,5 inci persegi (atau 22× 22 mm) kaca penutup yang
bebas dari serat, debu, dan lemak. Coverslips semacam itu memungkinkan

tt p
3,4,16,107 Pemeriksaan apusan darah masih memainkan peran penting dalam
mengkarakterisasi sampel ini atau menunjukkan temuan di luar parameter yang
telah ditetapkan untuk laboratorium. Selain itu, beberapa sel memerlukan
pemeriksaan morfologi untuk mengidentifikasi, seperti sel Sézary,108 dan
morfologi sel darah merah paling baik dianalisis dengan pemeriksaan apusan
penyebaran darah yang optimal ke permukaan dan artefak yang minimal.
Biasanya, kaca penutup berkualitas tinggi tidak memerlukan pembersihan
tambahan, meskipun mungkin ada beberapa kerusakan seiring
bertambahnya usia. Penutup plastik “tidak dapat dibasahi” tidak

h
langsung.45,48
ANALISIS MORPHOLOGIC SEL DARAH
Evaluasi hati-hati dari apusan darah yang disiapkan dengan baik
merupakan bagian penting dari evaluasi penyakit hematologi.
Meskipun diagnosis spesifik mungkin disarankan oleh data yang
diperoleh dari penganalisis hematologi otomatis, banyak penyakit
mungkin memiliki jumlah darah normal tetapi morfologi seluler
abnormal. Contoh sel darah merah abnormal yang mungkin terlihat
pada pemeriksaan apusan darah tepi dan berhubungan dengan
keadaan penyakit tertentu dapat dilihat pada Tabel 1.4. Namun,
analisis morfologis mungkin sangat terhambat oleh apusan darah yang
tidak disiapkan dengan baik atau diwarnai. Persiapan apusan darah
yang memuaskan memerlukan perhatian yang cermat pada persiapan
apusan darah dan teknik pewarnaan serta pemahaman tentang
gambaran morfologis sel normal dan sel patologis.
memuaskan untuk preparat ini. Apusan dibuat dengan memegang kaca
penutup pada dua sudut yang berdekatan antara ibu jari dan jari telunjuk.
Setetes kecil darah segar atau darah antikoagulan ditempatkan di tengah
kaca penutup. Ukuran setetes darah sangat penting. Jika drop terlalu besar,
hasil smear tebal. Jika tetesan darah terlalu kecil, apusan yang sangat tipis
diperoleh. Kaca penutup kedua kemudian dipegang dengan cara yang sama
dengan tangan yang lain, diletakkan di atas kaca penutup pertama, dan
diputar 45° dengan gerakan yang mantap, cepat, dan lembut. Kedua kaca
penutup kemudian segera ditarik terpisah dan dibiarkan mengering. Jika
dilakukan dengan benar, prosedur ini menghasilkan dua kaca penutup
dengan penyebaran darah yang merata tanpa lubang atau area yang terlalu
tebal.112.113
Apusan darah juga dapat dibuat pada slide kaca bersih dengan
metode baji (Gbr. 1.3B). Hal ini sering menyebabkan distribusi sel yang
tidak teratur pada slide, kerugian yang berbeda dari prosedur kaca
penutup. Namun, slide kaca kurang rapuh, lebih mudah ditangani, dan
mungkin diberi label lebih mudah daripada kaca penutup. Untuk
membuat apusan darah preparat, setetes darah diteteskan di tengah
preparat kira-kira 1 sampai 2 cm dari salah satu ujungnya. Slide
penyebar kedua ditempatkan pada 30° ke 45° sudut dan pindah
8

tabel 1.4

sel darah merah patologis dalam pengukuran darah

Tipe Sel Merah Keterangan Perubahan yang Mendasari Asosiasi Negara Penyakit

Akantosit (sel taji) Sel darah merah yang berspikula tidak teratur dengan proyeksi Lipid membran sel yang berubah Abetalipoproteinemia, penyakit hati
dengan panjang yang bervariasi dan pusat yang padat parenkim, pascasplenektomi
bintik basofilik Inklusi basofilik tanda baca Ribosom yang diendapkan (RNA) Stippling kasar: keracunan timbal,
talasemia
Bintik halus: Berbagai anemia
Sel gigitan (degmasit) Setengah lingkaran halus diambil dari satu sisi Heinz body pitting oleh limpa Defisiensi glukosa-6-fosfat dehidrogenase,
hemolisis oksidan yang diinduksi obat

Sel burr (echinocyte) atau sel darah merah yang Sel darah merah dengan spikula pendek dengan jarak Mungkin terkait dengan lipid Biasanya artifaktual; terlihat pada uremia,

berdenyut yang sama dan pucat sentral yang dipertahankan membran yang berubah perdarahan ulkus, karsinoma lambung

i. r
Cincin cabot Inklusi melingkar, biru, seperti benang Sisa-sisa nuklir Pascasplenektomi, anemia hemolitik,
dengan titik-titik anemia megaloblastik

Ovalosit (eliptosit) Sel berbentuk elips Protein sitoskeletal Eliptositosis herediter

s
Badan Howell-Jolly Inklusi kecil, diskrit, basofilik, abnormal Sisa inti (DNA) Pascasplenektomi, anemia hemolitik,
padat; biasanya lajang anemia megaloblastik

s
Sel darah merah hipokromik Pucat pusat yang menonjol Sintesis hemoglobin berkurang Anemia defisiensi besi, talasemia,
anemia sideroblastik

n
Leptosit Sel datar, seperti wafer, tipis, hipokromik — Penyakit hati obstruktif, talasemia
Makrosit

a
Sel darah merah lebih besar dari normal (>8.5 Mm), Sel darah merah muda, pematangan sel darah Peningkatan eritropoiesis; makrosit oval pada

is
terisi penuh dengan hemoglobin merah abnormal anemia megaloblastik; makrosit bulat pada
penyakit hati

Mikrosit Sel darah merah lebih kecil dari normal (<7.0 — Sel darah merah hipokromik (lihat Bab 27)

r
Badan Pappenheimer Mm) Butiran kecil, padat, basofilik Siderosom yang mengandung Anemia sideroblastik, pascasplenektomi
besi atau sisa mitokondria

e
Polikromatofilia Rona keabu-abuan atau biru sering terlihat Bahan ribosom Retikulositosis, pelepasan sel darah merah prematur dari

pada makrosit sumsum

p
Rouleaux Agregat sel darah merah menyerupai tumpukan Penggumpalan sel darah merah dengan Paraproteinemia

.
koin sirkulasi paraprotein

Schistosit (sel helm) Sel terdistorsi dan terfragmentasi; dua atau Distorsi mekanis pada mikrovaskuler Anemia hemolitik mikroangiopati

p
tiga ujung runcing oleh untaian fibrin, gangguan oleh (koagulasi intravaskular diseminata,

i
katup jantung prostetik purpura trombositopenik trombotik, katup
jantung prostetik, luka bakar parah)

v
Sel sabit (drepanosit) Bipolar, bentuk spiculated, berbentuk sabit, Agregasi molekul HbS Gangguan sel sabit, tidak termasuk sifat S

/: /
runcing di kedua ujungnya

Sferosit Sel bulat dengan penampilan padat dan tidak Berkurangnya luas permukaan membran Sferositosis herediter, anemia
ada pusat pucat, biasanya diameternya imunohemolitik
mengecil

tt p
Stomatosit Deformitas mulut atau cuplike Cacat membran dengan permeabilitas Stomatositosis herediter,
kation abnormal anemia imunohemolitik
Sel target (kodosit) Penampilan seperti target, sering hipokromik Peningkatan redundansi membran sel Penyakit hati, pascasplenektomi,
talasemia, penyakit hemoglobin C
Sel tetes air mata (dakriosit) — Myelofibrosis, anemia myelophthisic

h
Sel berbentuk tetesan yang terdistorsi

Diadaptasi dari Kjeldsberg C, Perkins SL, ed. Diagnosis praktis gangguan hematologi, edisi ke-5. Chicago: ASCP Press, 2010.

mundur untuk melakukan kontak dengan tetesan darah. Tetesan darah teknik manual dan berguna ketika sejumlah besar apusan darah
akan menyebar di sepanjang tepi slide, dan kemudian slide spreader disiapkan.116 Secara umum, apusan yang dibuat dengan teknik
dipindahkan dengan cepat ke depan. Teknik ini membuat lapisan darah otomatis seringkali lebih rendah daripada yang dibuat oleh teknisi
sepanjang 3 sampai 4 cm. Artefak dapat diperkenalkan oleh tepi yang tidak yang berpengalaman.
beraturan pada penyebar dan oleh kecepatan di mana penyebar
dipindahkan. Preparat kaca slide telah meningkatkan insiden akumulasi sel
darah putih yang lebih besar di tepi film, menyebabkan kesalahan distribusi Pewarnaan Darah rutin
seluler. Pergerakan cepat dari penyebar menghasilkan populasi sel yang Apusan darah biasanya diwarnai dengan pewarnaan Wright atau
terdistribusi lebih seragam.112.113,114 MayGrünwald-Giemsa. Kedua noda tersebut merupakan modifikasi dari
Teknik otomatis untuk preparasi apusan darah juga telah prosedur Romanowsky.113,114 Noda dapat dibeli secara komersial atau
dikembangkan. Dua jenis pendekatan utama digunakan: sentrifugasi dapat dibuat di laboratorium. Pewarna dasar diformulasikan dari metilen
dan penyebar mekanis. Teknik sentrifugasi seringkali paling berguna biru dan eosin. Pewarnaan Giemsa menggunakan sejumlah asam bikromat
ketika sejumlah kecil sel harus dikonsentrasikan di area yang kecil, yang diketahui untuk membentuk senyawa biru yang dikonversi. Formulasi
seperti dalam mempersiapkan apusan sel dalam cairan seperti cairan pewarnaan Wright menggunakan natrium bikarbonat untuk mengubah
serebrospinal.112,115 Penyebar mekanis meniru metilen biru menjadi metilen biru, yang diwarnai

A B
Gambar 1.3. Persiapan apusan darah. Apusan darah dapat dibuat dengan kaca penutup
(A) atau metode slide wedge (B). Apusan kaca penutup dibuat dengan menempatkan setetes darah di
tengah kaca penutup dan menyebarkan darah dengan memutar kaca penutup kedua di atasnya. Apusan
baji dibuat dengan menempatkan setetes darah pada kaca objek dan menggunakan kaca objek kedua
untuk mendorong darah keluar sepanjang kaca objek. (Diadaptasi dan digambar ulang dari metode
laboratorium Bauer J. Clinical, edisi ke-9. St. Louis: CV Mosby, 1982.)
sel. Semua jenis pewarna Romanowsky tidak larut dalam air tetapi
dapat larut dalam metil alkohol. Noda harus bebas dari air, yang
menginduksi artefak sel darah merah. Artefak air dapat dihindari
dengan fiksasi slide atau kaca penutup dalam metanol anhidrat
sebelum pewarnaan.113
Kondisi pewarnaan yang optimal harus ditetapkan untuk setiap batch
pewarnaan baru. Konversi metilen biru menjadi senyawa biru terus terjadi
p
saat noda berada di dalam botol, sehingga kondisi pewarnaan dapat
.
berubah seiring waktu. Metil azure adalah pewarna dasar yang memberikan
warna ungu-biru ketika mengikat komponen asam sel, seperti asam nukleat
p
dan protein. Eosin bereaksi dengan elemen seluler dasar, memberikan
i
warna kemerahan pada komponen sitoplasma dan hemoglobin. Slide yang
diwarnai dengan benar memiliki warna merah muda. Sel darah merah akan
v
memiliki warna oranye sampai merah muda, dan leukosit memiliki inti biru
/: /
keunguan. Pewarnaan Romanowsky secara berbeda menodai granula
leukosit, yang membantu dalam analisis morfologi sel. Dengan demikian,
butiran neutrofil sedikit basa dan sedikit diwarnai dengan komponen
azurofilik. Eosinofil mengandung turunan spermin yang sangat basa dan
sangat diwarnai dengan eosin. Sebaliknya, butiran basofil mengandung
tt p
protein asam yang dominan dan menodai biru-ungu tua. Tidak boleh ada
endapan yang menutupi sel karena hal ini menunjukkan penggunaan kaca
film atau kaca penutup yang tidak dibersihkan dengan benar. Debu pada
slide juga dapat menyebabkan artefak. Larutan pewarnaan harus disaring
h
atau diganti setiap minggu jika digunakan secara berlebihan untuk
menghindari pengendapan.113,114
Kadang-kadang, warna biru sel yang berlebihan terlihat. Hal ini
mungkin disebabkan oleh waktu pewarnaan yang berlebihan,
persiapan yang tidak tepat atau buffer tua yang terlalu basa, apusan
darah yang lama, atau apusan darah yang terlalu kental. Kualitas
pewarnaan dapat ditingkatkan dengan pembilasan cepat dan kuat
dengan air suling. Jika area slide di antara sel-sel terwarnai, biasanya
menunjukkan pencucian slide yang tidak memadai, antikoagulasi
heparin, atau kemungkinan paraproteinemia. Ketika pewarnaan
tampak terlalu merah muda atau merah, masalah yang biasa terjadi
adalah buffer yang terlalu asam. Hal ini menyebabkan inti leukosit
berwarna pucat, sel darah merah yang terlalu jingga, dan butiran
eosinofil berwarna merah cerah. Penyebab lain dari pewarnaan merah
atau merah muda yang berlebihan termasuk waktu pewarnaan yang
tidak memadai atau pencucian slide yang berlebihan. Paling sering,113
Bab 1 pemeriksaan darah dan sumsum tulang 9
pemeriksaan Blood Smear
Apusan darah awalnya harus diperiksa di bawah kekuatan menengah
(10 hingga 20× objektif) untuk menilai kecukupan distribusi seluler dan
pewarnaan. Perkiraan jumlah sel darah putih juga dapat dibuat
dengan kekuatan ini, dan pemindaian elemen seluler abnormal, seperti
ledakan atau sel darah merah berinti, dapat dilakukan. Penting untuk
memindai seluruh apusan darah untuk memastikan bahwa populasi
abnormal, yang mungkin terkonsentrasi di tepi apusan, tidak
terlewatkan. Penggunaan lensa minyak imersi (50 atau 100×) atau
lensa kering berdaya tinggi (40×) biasanya cukup untuk melakukan
jumlah diferensial leukosit, meskipun 100× lensa minyak mungkin
diperlukan untuk identifikasi inklusi seluler atau butiran sitoplasma
abnormal. Evaluasi sistematis apusan darah sangat penting agar
semua jenis sel diperiksa dan dikarakterisasi. Setiap jenis sel harus
dievaluasi untuk kelainan kuantitatif dan kualitatif.117,118
i. r
Sulit untuk mengevaluasi kelainan kuantitatif sel darah merah pada
apusan darah; namun, sel darah merah harus dievaluasi untuk variasi
ukuran, bentuk, distribusi hemoglobin, dan adanya inklusi seluler. Sel
s
darah merah biasanya tidak merata di seluruh lapisan darah. Morfologi
s
sel darah merah yang optimal terlihat pada area apusan dimana sel
darah merah saling berdekatan tetapi tidak tumpang tindih. Area di
mana sel darah merah menyebar terlalu tipis atau tebal telah
n
meningkatkan artefak. Pada beberapa apusan darah, sel darah merah
tampak saling menempel, membentuk apa yang tampak seperti
Hematologi Laboratorium
is
tumpukan sel darah merah, yang disebutrouleaux. Temuan ini
mungkin mirip pada pasien normal di area apusan di mana sel darah
merah terlalu rapat. Namun, jika rouleaux terlihat bahkan di daerah
yang lebih tipis dari film darah, ini menunjukkan adanya paraprotein
r
yang melapisi sel darah merah dan menyebabkan aglutinasi karena
e
hilangnya tolakan elektrostatik normal antara sel darah merah. Area
apusan darah yang terlalu tipis akan kehilangan pucat pusat sel darah
merah, meniru sferosit.117
Sel darah merah harus seragam dalam ukuran dan bentuk dengan
diameter rata-rata 7,2 hingga 7,9 MM. Ini dapat dievaluasi dengan
menggunakan mikrometer atau dengan perbandingan dengan
diameter inti limfosit kecil, yang kira-kira berukuran sama atau sedikit
lebih kecil. Variasi ukuran sel darah merah disebutanisositosis.
Sel yang lebih besar dari 9 Mm dan hemoglobin yang baik dipertimbangkan
makrosit. Eritrosit yang kurang matang bersifat makrositik dan memiliki
warna kebiruan pada hemoglobin (polikromatofilia) atau memiliki bintik-
bintik basofilik halus pada sel karena sisa RNA dan ribosom. Mikrosit adalah
sel dengan diameter <6 MM.117,118
Sel eritroid normal berbentuk bulat. Variasi bentuk sel darah merah
disebutpoikilositosis. Sel darah merah harus memiliki area tengah
pucat (central pallor) dengan tepi hemoglobin merah hingga oranye.
Hipokromia mencerminkan hemoglobinisasi yang buruk dan
menghasilkan tepi hemoglobin yang sangat tipis atau area sentral
yang pucat. Distribusi hemoglobin yang tidak normal dapat
mengakibatkan pembentukan sel dengan titik pusat hemoglobin yang
dikelilingi oleh area pucat, yang disebutsel sasaran. Hemoglobin
abnormal juga dapat membentuk kristal. Sferosit dan makrosit tidak
memiliki area pucat pusat karena peningkatan ketebalan sel. Sel darah
merah juga dapat mengandung inklusi, seperti sisa-sisa bahan nuklir
(badan Howell-Jolly), sisa-sisa mitokondria atau siderosom (badan
Pappenheimer),118 atau agen infeksius (parasit malaria, babesiosis).119
,120 Selain itu, fragmen sel darah merah atau schistocytes sugestif
kerusakan mekanis sel darah merah lebih mudah dideteksi dengan
pemeriksaan hapusan darah.121
Jumlah trombosit dan morfologi kemudian dievaluasi. Trombosit muncul
sebagai fragmen sitoplasma biru kecil dengan butiran merah hingga ungu.
Trombosit biasanya 1 hingga 2Mdiameter m dengan variasi bentuk yang
luas. Jumlah trombosit dapat diperkirakan dari film darah. Jumlah trombosit
normal harus memiliki beberapa (5 sampai 15) trombosit per bidang
perendaman minyak atau sekitar 1 trombosit untuk 10 sampai 20 sel darah
merah.122 Perlu dicatat bahwa trombosit dapat beragregasi jika darah tidak
antikoagulasi, dengan benar, atau preparat fingerstick
10 Bagian I Hematologi Laboratorium
digunakan, dan ini dapat menyebabkan kesan palsu dari jumlah trombosit
yang rendah.122.123
Morfologi dan distribusi leukosit dianalisis terakhir. Jumlah leukosit
dapat diperkirakan dengan memindai film darah pada kekuatan
menengah. Efek mekanis yang menyebabkan distribusi abnormal sel
yang lebih besar harus disingkirkan dengan pemeriksaan tepi film
darah khususnya.2.117 Sel darah putih di tepi apusan darah mungkin
tampak lebih kecil secara artifaktual (karena penyusutan sel dan
penyebaran sel yang buruk) atau lebih besar (karena gangguan sel dan
penyebaran yang berlebihan). Perawatan harus dilakukan saat
membuat apusan karena sel, terutama sel neoplastik, mungkin lebih
mudah terganggu oleh tekanan mekanis yang berlebihan daripada
leukosit normal. Morfologi leukosit yang optimal mengharuskan
apusan darah segera dilakukan. Artefak yang signifikan mulai terlihat
dalam darah yang telah ditahan selama beberapa jam dan termasuk
vakuolasi sitoplasma, karioreksis nukleus, dan gangguan sitoplasma.11
Sel darah putih yang biasanya terlihat pada apusan darah meliputi
neutrofil, eosinofil, basofil, limfosit, dan monosit. Kehadiran sel myeloid
imatur (myelocytes, metamyelocytes, promyelocytes, dan blasts) jelas
tidak normal.118.124.125 Setidaknya 100 sel harus diidentifikasi dan
dihitung untuk menghasilkan diferensial sel darah putih manual.117,118
Selain mengidentifikasi populasi relatif sel darah putih dengan
melakukan penghitungan diferensial, sel harus diperiksa secara cermat
untuk kelainan morfologi sitoplasma dan nukleus. Misalnya, infeksi
atau terapi faktor pertumbuhan sering menyebabkan peningkatan
penonjolan granula primer (azurofilik) dalam neutrofil, yang disebut
granulasi beracun.126.127 Sebaliknya, banyak kelainan mielodisplastik
ditandai dengan hipogranularitas neutrofil selain segmentasi nukleus
yang abnormal.128 Inklusi sitoplasma dapat dilihat pada beberapa
gangguan penyimpanan, gangguan lisosom, atau infeksi.118.120.129
p
.
Cara lain untuk memeriksa Darah
p
i
Kadang-kadang, perlu untuk memeriksa darah segar sebagai
tunggangan basah. Preparat basah dibuat dengan menempatkan
v
setetes darah pada kaca objek, menutupi tetesan dengan kaca
/: /
penutup, dan mengelilingi kaca penutup dengan petroleum jelly atau
lilin parafin untuk menutup tepinya. Jika diperlukan, darah dapat
diencerkan dengan saline isotonik, atau dalam beberapa kasus,
mungkin difiksasi dengan buffer glutaraldehid untuk pemeriksaan
selanjutnya. Darah kemudian dapat dilihat dengan mikroskop kontras
tt p
cahaya atau fase. Beberapa organisme, seperti spirochetes dan
trypanosomes, dapat dideteksi dengan pergerakan pada sediaan
basah meskipun pengujian yang lebih definitif, seperti serologi atau
deteksi organisme molekuler lebih sering digunakan.130
h
Pewarnaan supravital dilakukan pada sel motil hidup dan membantu
menghindari artefak yang disebabkan oleh preparasi apusan, fiksasi, dan
pewarnaan.131 Namun, persiapan tersebut tidak permanen, kerugian yang
berbeda. Pewarnaan supravital sering digunakan untuk mendeteksi inklusi sel
darah merah. Ini termasuk pewarnaan kristal violet yang mendeteksi badan Heinz
atau inklusi hemoglobin terdenaturasi yang muncul sebagai badan ungu
berbentuk tidak teratur di dalam sel darah merah. Kresil biru cemerlang dapat
digunakan untuk mengendapkan dan mewarnai hemoglobin yang tidak stabil,
seperti hemoglobin Zurich dan hemoglobin H.132
Pewarnaan supravital yang paling umum digunakan adalah biru
metilen baru atau biru kresil cemerlang, digunakan untuk penentuan
retikulosit manual,60.133 meskipun penggunaan metode otomatis
penentuan retikulosit oleh penganalisis CBC sebagian besar telah
menggantikan metode manual.61 Retikulosit tidak diidentifikasi secara
positif pada apusan darah Wrightstained, meskipun kehadirannya
disarankan oleh polikromatofilia sel darah merah. Jumlah retikulosit
otomatis mungkin meningkatkan kesalahan dengan adanya badan
Heinz134 atau tubuh Howell-Jolly 135 dalam sel darah merah. Nilai
referensi normal untuk retikulosit dipengaruhi oleh usia pasien, jenis
kelamin, dan tingkat aktivitas fisik.136
pemeriksaan sumsum tulang
Diagnosis dan pengelolaan banyak penyakit hematologi bergantung
pada evaluasi sumsum tulang. Pemeriksaan sumsum tulang biasanya
melibatkan dua spesimen yang terpisah, tetapi saling terkait. Yang
pertama adalah preparat sitologi sel sumsum tulang yang diperoleh
dengan aspirasi sumsum dan apusan sel, memungkinkan visualisasi
yang sangat baik dari morfologi sel dan enumerasi elemen seluler
sumsum.137 Spesimen kedua adalah biopsi jarum tulang dan sumsum
terkait, yang memungkinkan evaluasi optimal seluleritas sumsum
tulang, fibrosis, infeksi, atau penyakit infiltratif.111
Indikasi pemeriksaan sumsum tulang meliputi pemeriksaan lebih
lanjut kelainan hematologi yang diamati pada apusan darah tepi;
evaluasi tumor sumsum tulang primer; pementasan untuk keterlibatan
sumsum tulang oleh tumor metastasis; penilaian proses penyakit
i. r
menular, termasuk demam yang tidak diketahui asalnya; dan evaluasi
penyakit penyimpanan metabolik. Sebelum pemeriksaan sumsum
tulang dilakukan, tujuan diagnostik yang jelas tentang informasi yang
s
akan diperoleh dari prosedur harus ditentukan dan keputusan dibuat
tentang apakah studi khusus diperlukan, untuk memastikan bahwa
s
semua spesimen yang diperlukan dapat dikumpulkan dan ditangani
dengan benar.111
n
Beberapa tempat dapat digunakan untuk aspirasi sumsum tulang
dan biopsi.138.139 Sebagian, lokasi yang dipilih mencerminkan distribusi
a
normal sumsum tulang dengan usia pasien. Saat lahir, sumsum
is
hematopoietik ditemukan di semua tulang tubuh. Namun, pada masa
kanak-kanak awal, sel-sel lemak mulai menggantikan sel-sel
hematopoietik sumsum tulang di ekstremitas sehingga orang dewasa
r
memiliki hematopoesis terbatas pada kerangka aksial dan bagian
proksimal ekstremitas.138 Dengan demikian, anak-anak yang lebih
e
muda mungkin memiliki pemeriksaan sumsum dari daerah tibialis
medial anterior, sedangkan sampel sumsum orang dewasa paling baik
diambil dari sternum di ruang interkostal kedua atau dari daerah krista
iliaka anterior atau posterior. Sumsum tulang belakang tidak
memungkinkan biopsi dilakukan, dan beberapa kemungkinan
komplikasi, termasuk perdarahan dan tamponade perikardial, dapat
terjadi jika bagian dalam tulang dada ditembus oleh jarum di area
selain ruang interkostal kedua. Ruang sumsum tulang dada pada
orang dewasa hanya setebal kira-kira 1 cm pada ruang interkostal
kedua, jadi harus berhati-hati untuk menghindari penetrasi rongga
dada, meskipun jarum sumsum tulang sternum memiliki pelindung
untuk mencegah penetrasi jarum di luar lempeng sternum. Sebaliknya,
sedikit morbiditas dikaitkan dengan aspirasi dan biopsi krista iliaka,140
Krista iliaka anterior dapat digunakan jika radiasi, pembedahan, atau
ketidaknyamanan sebelumnya tidak memungkinkan pendekatan
posterior.139
Aspirasi Sumsum Tulang dan Biopsi
Sumsum tulang setengah cair dan mudah disedot melalui jarum. Banyak
jenis jarum telah digunakan untuk melakukan aspirasi sumsum. Sebagian
besar berukuran 14 sampai 18, dan banyak yang memiliki obturator yang
dapat dilepas, yang mencegah penyumbatan jarum sebelum aspirasi, dan
stilet yang dapat digunakan untuk mengekspresikan sampel biopsi sumsum
tulang (Gbr. 1.4). Beberapa model, terutama digunakan untuk prosedur
aspirasi sumsum tulang sternum, memiliki pelindung yang dapat
disesuaikan yang membatasi tingkat penetrasi jarum dan mengurangi
morbiditas.140 Sebagian besar jarum sumsum tulang dibuang setelah satu
kali penggunaan, dan jarum khusus yang lebih panjang yang dapat
digunakan untuk pasien obesitas dan bor mekanis untuk membantu
penetrasi tulang tersedia secara komersial.
Dalam kebanyakan kasus, aspirasi sumsum dan biopsi dapat
dilakukan dengan sedikit risiko ketidaknyamanan pasien, asalkan
anestesi lokal yang memadai digunakan. Pasien yang khawatir dapat
dibius sebelum prosedur.139,141 Prosedur ini dilakukan dalam kondisi
steril. Kulit di tempat biopsi dicukur,

Gambar 1.4. Aspirasi sumsum tulang Jamshidi dan jarum biopsi. Jenis hol-
jarum rendah dengan ujung miring (A) memuaskan untuk biopsi perkutan dari sumsum tulang.
Jarum dimasukkan dengan obturator (B) di tempat. Biopsi diekspresikan dari jarum
menggunakan gaya (C).
jika perlu, dan dibersihkan dengan larutan desinfektan. Kulit, jaringan
subkutan, dan periosteum di area biopsi dibius dengan anestesi lokal,
seperti lidokain 1%, menggunakan jarum ukuran 25. Perawatan harus
dilakukan untuk membius sepenuhnya periosteum, di mana sebagian
besar serat nyeri tulang berada. Setelah anestesi bekerja, sayatan kecil
dibuat di kulit di atas tempat biopsi, dan jarum aspirasi sumsum
dimasukkan melalui kulit, jaringan subkutan, dan korteks tulang
dengan sedikit gerakan memutar. Masuknya jarum ke dalam rongga
sumsum tulang harus dirasakan sebagai sedikit memberi atau
meningkatkan kecepatan kemajuan jarum. Obturator jarum dilepas,
dan jarum dipasang pada spuit 10 atau 20 ml. Aspirasi sumsum dicapai
dengan pengisapan cepat dengan spuit sehingga 0. 2 sampai 2,0 ml
cairan berdarah diperoleh. Aspirasi dapat menyebabkan rasa sakit
yang sangat singkat dan tajam. Jika tidak ada rasa sakit dan tidak ada
sumsum yang diperoleh, jarum dapat diputar dan dilakukan suction
lagi. Jika tidak ada sumsum
diperlukan.1
tt p
h
A B
Gambar 1.5. Apusan aspirasi sumsum tulang diwarnai dengan pewarnaan Wright-giemsa. Aspirasi sumsum tulang menunjukkan spikula sentral dengan dispersi
sel prekursor hematopoietik di sekitar spikula. Persiapan memungkinkan untuk evaluasi optimal fitur sitologi sel prekursor sumsum tulang.Panel A (daya rendah)
menunjukkan distribusi sel hematopoietik di dekat spikula sumsum tulang yang berwarna gelap dalam aspirasi sumsum tulang. Panel B (daya tinggi) menunjukkan
fitur sitologi sel hematopoietik aspirasi sumsum tulang.
aPter 1 pemeriksaan darah dan sumsum tulang 11
Bahan yang diaspirasi biasanya diberikan kepada asisten teknis, yang
membuat apusan bahan (Gbr. 1.5) dan menilai kualitas bahan dengan
memperhatikan adanya cules sumsum. Apusan harus dibuat dengan
cepat untuk menghindari penggumpalan dengan cara yang sama seperti
yang dijelaskan untuk apusan darah menggunakan kaca penutup atau
kaca objek untuk menyebarkan sumsum (Gbr. 1.3). Setelah telinga
dibuat, aspirasi dapat dibiarkan menggumpal untuk membentuk bagian
bekuan histologis untuk diproses. Dalam beberapa kasus, di mana
preparasi slide mediasi tidak tersedia, sumsum tulang dapat diaspirasi ke
dalam tabung yang berisi sejumlah kecil antiagulan untuk menghambat
pembekuan. Aspirat kemudian dapat disaring d diserahkan untuk
pemrosesan histologis menjadi bagian gumpalan partikel.
n. EDTA adalah antikoagulan terbaik untuk digunakan karena memperkenalkan
jumlah paling sedikit artefak morfologi untuk spesimen.137 Jika bahan
tambahan diperlukan untuk flow cytometry, cytogenetics, culture, atau
i. r
studi khusus lainnya, aspirasi tambahan dapat dilakukan dengan
menarik jarum dan memposisikannya kembali di tempat baru dan
menarik sumsum ke dalam tabung yang berisi antikoagulan.
s
Pemeriksaan morfologi memerlukan sampel terbaik dan aspirasi untuk
studi tambahan harus dilakukan setelah aspirasi awal untuk
s
pemeriksaan tersebut. Kadang-kadang, sebagian dari aspirasi sumsum
yang antikoagulasi diputar ke bawah untuk mendapatkan buffy coat,
n
sehingga mengkonsentrasikan elemen seluler. Dalam beberapa kasus,
tidak ada sumsum yang dapat diaspirasi (keran kering). Dalam kasus
ia
ini, penting untuk membuat apusan dari bahan di ujung jarum dan
juga membuat preparat sentuh dari biopsi, seperti diuraikan di bawah,
Hematologi Laboratorium
untuk memungkinkan pemeriksaan sitologi elemen sumsum tulang.
137,139
Biopsi sumsum tulang (Gbr. 1.6) dapat dilakukan dengan menggunakan
sayatan kulit yang sama jika aspirasi telah dilakukan di daerah krista iliaka.
Jarum biopsi terpisah yang sedikit lebih besar dari jarum yang digunakan
untuk aspirasi dapat digunakan, atau jarum yang sama yang digunakan
untuk aspirasi sumsum tulang dapat digunakan kembali. Perawatan harus
dilakukan untuk memposisikan ulang situs biopsi jarum jauh dari daerah di
mana aspirasi dilakukan untuk menghindari pengumpulan spesimen
dengan artefak yang luas yang disebabkan oleh prosedur aspirasi.139,142
Penggunaan jarum biopsi mungkin memerlukan lebih banyak tekanan
untuk memasuki tulang karena ukuran lubang yang lebih besar. Setelah
jarum ditempatkan di tulang, stilet dapat dimasukkan untuk memberikan
perkiraan ukuran bijih tulang di dalam jarum. Jarum biopsi diputar dan
dengan lembut
12
A B
Gambar 1.6. Biopsi inti sumsum tulang. Persiapan histologis biopsi inti sumsum tulang setelah fiksasi dan dekalsifikasi. Biopsi diwarnai dengan hematoxylin dan
eosin. Persiapan ini memungkinkan untuk evaluasi optimal seluleritas sumsum tulang dan interaksi sel sumsum tulang dengan trabekula tulang dan membantu dalam
mengevaluasi fitur ekstrinsik seperti tumor metastatik atau fibrosis di sumsum.Panel A (daya rendah) menunjukkan spikula tulang dan sumsum pada bagian biopsi
inti sumsum tulang. Panel B (daya tinggi) menunjukkan detail morfologi jaringan hematopoietik dalam bagian tersebut.
diguncang untuk membebaskan biopsi dari tulang di sekitarnya dan
kemudian maju sedikit lebih jauh. Biopsi kemudian dikeluarkan dari
tulang dengan menarik jarum, dan sedikit tekanan positif dapat
diterapkan menggunakan jarum suntik. Biopsi diekspresikan dari
jarum oleh stilet. Persiapan sentuh dari biopsi tulang harus dilakukan,
terutama jika tidak ada aspirasi yang diperoleh, untuk memungkinkan
p
pemeriksaan sitologi dari elemen sumsum tulang. Inti tulang
.
kemudian difiksasi, didekalsifikasi, dan diproses untuk pemeriksaan
histologis.138.143 Pengujian tambahan sering dapat dilakukan pada inti
p
sumsum tulang tambahan ketika tidak ada bahan yang dapat
i
diaspirasi, sehingga pengumpulan lebih dari satu biopsi inti mungkin
diperlukan.
v
Setelah biopsi selesai, tekanan manual diterapkan ke situs selama
/: /
beberapa menit untuk mencapai hemostasis. Tempat tersebut kemudian
dibalut dan pasien diinstruksikan untuk tetap berbaring sehingga
memberikan tekanan lebih lanjut selama kurang lebih 30 sampai 60 menit.
Jika pasien mengalami trombositopenia, perban tekan harus dipasang dan
tempat tersebut sering diperiksa untuk mengetahui adanya perdarahan
tt p
yang berkepanjangan.
Pewarnaan dan evaluasi aspirasi Sumsum
Tulang dan sediaan sentuh
h
Aspirasi sumsum tulang atau slide preparasi sentuh diwarnai dengan
pewarnaan Wright atau May-Grünwald-Giemsa, mirip dengan apusan darah.
Pewarnaan ini memungkinkan detail morfologi yang sangat baik dan
memungkinkan penghitungan diferensial dilakukan. Apusan yang tidak
ternoda harus dipertahankan untuk kemungkinan noda khusus jika
diindikasikan.137,139
Evaluasi aspirasi sumsum tulang memberikan sedikit informasi tentang
selularitas total sumsum tulang karena fluktuasi jumlah sel yang disebabkan
oleh kontaminasi darah perifer dari spesimen sumsum tulang dan artifak
preparasi. Kesan keseluruhan selularitas dapat diberikan (yaitu, selular atau
paucicellular). Evaluasi yang lebih akurat dari selularitas sumsum tulang
memerlukan pemeriksaan biopsi sumsum tulang atau bagian gumpalan
partikel, meskipun biopsi mewakili sebagian kecil dari total sumsum dan
juga dapat menyebabkan kesalahan pengambilan sampel.111.139,144 Apusan
aspirasi yang diwarnai akan memiliki zona sentral dari partikel dan stroma
sumsum gelap yang dikelilingi oleh area yang lebih tipis dari sel sumsum
tulang dan sel darah merah yang tersebar (Gbr. 1.5). Pemeriksaan daya
rendah memungkinkan evaluasi kecukupan selularitas dan
i. r
s
s
a n
is
adanya megakariosit. Sel tumor atau granuloma juga dapat dilihat
dengan memindai apusan aspirasi dengan daya rendah.137
r
Apusan aspirasi memungkinkan pemeriksaan sitologi sel sumsum
tulang. Minimal 500 sel berinti harus dievaluasi di bawah pembesaran
e
minyak imersi di sebagian besar sumsum. Hanya sel utuh yang
dievaluasi; semua inti telanjang dikecualikan. Penghitungan dilakukan
di area di mana terdapat sedikit inti kosong dan sel tidak tumpang
tindih, ditemukan dalam kelompok, atau terdistorsi secara artifak
karena penyebaran artifak. Ini biasanya di zona sel tersebar yang
berdekatan dengan spikula. Perlu dicatat bahwa spikula mungkin tidak
ada di sumsum pediatrik di mana sel-sel sumsum akan tersebar
merata. Rentang referensi untuk persentase jenis sel sumsum tulang
sangat bervariasi antar laboratorium dan hanya digunakan sebagai
panduan untuk apa yang diharapkan dalam sampel sumsum tulang
normal137 (lihat Tabel 1.5 untuk contoh rentang referensi). Proporsi
setiap jenis sel dan perkembangan urutan maturasi untuk elemen
myeloid dan eritroid ditentukan dari hitungan diferensial. Selain itu,
rasio myeloid-to-eritroid dapat dihitung.
Perbedaan hasil diferensial sel antara bayi, anak-anak, dan orang
dewasa ada (Tabel 1.6).137,139,144,145 Secara umum, limfosit lebih sering
terlihat di sumsum anak-anak, terutama mereka yang berusia kurang
dari 4 tahun, di mana mereka dapat menyusun hingga 40% dari
selularitas sumsum.146 Sel plasma jarang ditemukan di sumsum bayi
dan anak-anak. Limfosit jauh lebih sedikit di sumsum tulang dewasa,
biasanya membentuk
<20% dari selularitas sumsum dewasa. Jumlah limfosit dan sel plasma pada
orang dewasa cenderung cukup bervariasi, mungkin mencerminkan
kecenderungan sel-sel ini untuk didistribusikan secara tidak merata di
sumsum tulang orang dewasa. Seringkali, sel limfoid ditemukan dalam
agregat nodular pada orang dewasa yang lebih tua, dan sel plasma
cenderung berhubungan dengan pembuluh darah.111
Selama bulan pertama kehidupan, sel eritroid sumsum tulang
menonjol karena kadar eritropoietin yang tinggi147;
setelah itu, sel-sel eritroid membentuk 10% sampai 40% dari sel-sel
sumsum. Relatif sedikit prekursor eritroid awal (normoblas) biasanya
terlihat, dan bentuk yang lebih matang mendominasi. Sel-sel eritroid
harus diperiksa untuk kelainan morfologi serta kandungan zat besi
karena fitur-fitur ini sering berubah dalam keadaan patologis. Sel
myeloid biasanya merupakan elemen sumsum tulang yang dominan,
dan sel-sel yang lebih matang mendominasi myeloblasts. Anak-anak
cenderung memiliki yang lebih tinggi
tabel 1.5

perbedaan jumlah aspirasi sumsum tulang dari 12 pria sehat

Berarti (%) Rentang yang Diamati (%) 95% Keyakinan (%)

Seri neutrofilik (total) 53.6 49.2–65.0 33.6–73.6

Myeloblast 0.9 0,2–1,5 0,1–1,7
Promielosit 3.3 2.1–4.1 1.9–4.7
Mielosit 12,7 8.2–15.7 8.5–16.9
Metamielosit 15.9 9.6–24.6 7.1–24.7
Pita 12.4 9,5-15,3 9.4–15.4
tersegmentasi 7.4 6.0–12.0 3.8–11.0
Seri eosinofilik (total) 3.1 1.2–5.3 1.1–5.2
Mielosit 0.8 0.2–1.3 0,2–1,4
Metamielosit 1.2 0,4–2,2 0,2–2,2
Pita 0.9 0.2–2.4 0–2,7
tersegmentasi 0,5 0–1.3 0–1.1
Sel basofilik dan sel mast <0.1 0-0.2 —
Seri eritrositik (total) 25.6 18,4–33,8 15.0–36.2
Pronormoblas 0.6 0.2–1.3 0.1–1.1
Basofilik 1.4 0,5–2,4 0,4–2,4
Polikromatofilik 21.6 17.9–29.2 13.1–30.1
Ortokromatik 2.0 0,4–4,6 0,3–3,7
Limfosit 16.2 11.1–23.2 8,6–23,8
sel plasma 1.3 0,4–3,9 0–3.5

Hematologi Laboratorium
Monosit 0,3 0-0,8 0-0,6
Megakariosit <0.1 0-0,4 —
Sel retikulum 0,3 0-0,9 0-0,8
Rasio myeloid-ke-eritroid 2.3 1,5–3,3 1.1–3.5

jumlah eosinofil dan sel prekursor eosinofilik daripada orang dewasa,
meskipun banyak obat atau alergi dapat meningkatkan jumlah
eosinofil sumsum tulang. Megakariosit merupakan jenis sel yang
paling sedikit terlihat di sumsum tulang, biasanya membentuk <1%
dari sel.137,139
Selain sel hematopoietik yang disebutkan di atas, berbagai sel lain
dapat terlihat pada aspirasi sumsum tulang dalam proporsi yang
bervariasi. Ini termasuk makrofag, sel mast, sel stroma, dan sel lemak.
Pada anak-anak, osteoblas dan osteoklas dapat terlihat, meskipun sel-
sel ini jarang terjadi pada orang dewasa dan kehadirannya dapat
mengindikasikan penyakit tulang metabolik.137,139,144
Biasanya, sel-sel lain ini membentuk <1% dari total selularitas sumsum;
namun, mereka dapat meningkat dalam berbagai proses reaktif dan
patologis. Apusan aspirasi sangat baik untuk evaluasi hemofagositosis
makrofag148 atau gangguan penyimpanan.137
pemeriksaan Bagian histologis Sumsum
Tulang
Biopsi inti sumsum tulang dan bekuan yang diperoleh dari prosedur
aspirasi biasanya difiksasi dalam formalin atau dalam fiksatif
koagulatif, seperti formalin B5 atau seng. Inti tulang akan
membutuhkan dekalsifikasi sebelum pemrosesan histologis. Bahan
tetap diproses dan tertanam dalam parafin atau plastik, dan bagian
dibuat untuk pemeriksaan. Biopsi sumsum tulang dan bagian bekuan
diwarnai dengan pewarnaan hematoxylin dan eosin atau Giemsa untuk
pemeriksaan morfologi139,144
(Gbr. 1.6).
Biopsi sumsum tulang berguna dalam evaluasi seluler dari sampel
sumsum tulang. Beberapa peringatan harus diingat ketika menilai
selularitas. Studi menunjukkan variasi seluleritas bahkan dalam situs
biopsi yang sama145 serta antara situs anatomi yang berbeda. Namun,
perbandingan
proporsi relatif sel myeloid, eritroid, dan megakariositik tampak
konstan bahkan di lokasi biopsi yang terpisah jauh.139,145 Pada pasien
yang lebih tua, daerah subkortikal seringkali hiposelular, dan harus
hati-hati untuk mendapatkan biopsi yang cukup besar untuk
memungkinkan evaluasi sumsum tulang yang memadai dari daerah ini.
145 Bagian biopsi sumsum tulang memberikan representasi terbaik dari
sumsum tulang dan hubungan anatomisnya, seperti lokalisasi normal
sel myeloid imatur yang berdekatan dengan trabekula tulang. Evaluasi
elemen nonhematopoietik, seperti trabekula tulang, pembuluh darah,
dan stroma, memerlukan spesimen biopsi.
Bagian bekuan, yang dibuat dari bahan aspirasi sumsum tulang,
memiliki tingkat artefak yang melekat karena sumsum tulang
dikeluarkan dari hubungan normalnya dengan tulang, pembuluh
darah, dan elemen stroma lainnya. Secara khusus, perkiraan selularitas
dapat meningkat secara salah akibat kolapsnya jaringan stroma
normal pada bagian bekuan darah.139
Selain memberikan informasi tentang distribusi anatomi dan
hubungan sel hematopoietik, biopsi sumsum tulang berguna untuk
evaluasi proses infiltratif seperti karsinoma, limfoma, tumor lain,
inflamasi granulomatosa, dan fibrosis.111.139 Kadang-kadang, sumsum
sangat terlibat dengan proses infiltrasi sehingga tidak ada aspirasi
yang dapat diperoleh (keran kering), dan biopsi menyediakan satu-
satunya bahan diagnostik.149.150
noda khusus
Beberapa pewarnaan khusus dapat dilakukan pada apusan darah tepi,
apusan aspirasi sumsum tulang, preparat sentuh sumsum tulang, dan
bahan biopsi sumsum tulang dan akan memberikan informasi
tambahan tentang garis keturunan sel di luar apa yang diperoleh
dengan pewarnaan standar dengan Giemsa atau hematoxylin.
14

tabel 1.6

perubahan jumlah sumsum tulang yang berbeda dengan usia

Kelahiran 1 Bulan–1 Y 1-4 Tahun 4–12 Tahun Dewasa

Seri neutrofilik Berarti (%) 60 33 50 52 57

95% batas 42–78 17–47 32–68 35–69 39–79
Seri eosinofilik Berarti (%) 3 3 6 3 3
95% batas 1-5 1-5 2–10 1-5 1-5
Limfosit Berarti (%) 14 47 22 18 17
95% batas 3–25 34–63 8–36 12–28 10–24
Eritrositik Berarti (%) 14 8 19 21 0
95% batas 2–28 2–16 11–27 11–31 10–30
Myeloid-ke-eritroid Rasio rata-rata 4.3 4.0 2.6 2.5 2.6

Rata-rata dan batas kepercayaan 95% dalam tabel ini dihitung dengan menggabungkan data yang dipublikasikan di Osgood EE, Seaman AJ. Komposisi seluler sumsum tulang seperti yang diperoleh oleh sternum
tusukan. Physiol Rev 1939;24:105–114, dengan data pada Tabel 1.5.

dan pewarnaan eosin. Pewarnaan khusus umumnya terbagi dalam dua
kategori: pewarnaan sitokimia yang menggunakan reaksi enzimatik
seluler untuk memberikan pewarnaan dan pewarnaan imunositokimia
yang mengidentifikasi epitop antigen spesifik sel. Pewarnaan ini sangat
berguna dalam karakterisasi keganasan hematologi primer atau
metastasis.
Noda Sitokimia
Pewarnaan sitokimia sangat berguna dalam diagnosis dan klasifikasi
leukemia akut, meskipun kegunaan ini telah dikurangi dengan
identifikasi penanda spesifik garis keturunan dengan flow cytometry.
Mereka memungkinkan identifikasi leukemia myeloid dan limfoid akut,
serta memberikan satu dasar untuk subklasifikasi leukemia myeloid
akut. Pewarnaan ini banyak digunakan dalam subklasifikasi morfologi,
seperti French-American-British (FAB)151 tetapi dengan penggunaan
yang luas dari flow cytometric dan tes tambahan lainnya tidak banyak
digunakan untuk tujuan klasifikasi di era klasifikasi Organisasi
Kesehatan Dunia (WHO) saat ini.152 Pewarnaan sitokimia biasanya
dilakukan pada film darah tepi, aspirasi sumsum tulang, atau sediaan
sentuh yang dibuat dari biopsi sumsum tulang. Hasil terbaik diperoleh
dengan menggunakan bahan yang baru diperoleh; namun, beberapa
reaksi dapat dilakukan pada bahan yang berumur beberapa tahun.153
Sudan Hitam B
Sudan black B mewarnai lipid dan fosfolipid intraseluler. Pola
pewarnaan sangat mirip dengan reaksi mieloperoksidase, dengan
pewarnaan positif pada sel granulosit dan eosinofil, pewarnaan
monositik lemah, dan tidak ada pewarnaan limfosit, meskipun
beberapa hal positif dapat terlihat pada granula azurofilik limfoblas.
Sudan black B memiliki keunggulan dibandingkan myeloperoxidase
karena dapat digunakan untuk menodai darah lama atau apusan
sumsum tulang, dan noda memudar dari waktu ke waktu.154
Spesifik (Naphthol AS-D Chloroacetate) Esterase
Pewarnaan spesifik (naftol AS-D kloroasetat) esterase, juga disebut
noda leder, digunakan untuk mengidentifikasi sel-sel dari seri
granulosit.154 Itu tidak menodai limfosit dan monosit. Karena stabilitas
enzimatik dalam formalin, jaringan tertanam parafin, pewarnaan ini
sangat berguna untuk mengidentifikasi granulosit dan sel mast di
bagian jaringan dan sangat membantu dalam diagnosis tumor myeloid
ekstrameduler (sarkoma granulositik, kloroma) dari ledakan yang
ditemukan di jaringan.153 Enzim esterase seluler menghidrolisis
substrat naftol AS-D kloroasetat.154 Produk reaksi ini kemudian
digabungkan ke garam diazo untuk membentuk produk reaksi merah-
merah muda cerah di lokasi aktivitas enzimatik. Aktivitas enzim
dihambat oleh adanya merkuri, larutan asam, panas, dan iodin yang
dapat menimbulkan hasil pewarnaan negatif palsu.

Mieloperoksidase
Granula primer neutrofil dan granula sekunder eosinofil mengandung
mieloperoksidase. Granula lisosom monositik sedikit positif. Limfosit
dan sel darah merah berinti kekurangan enzim.154 Pewarnaan
disebabkan oleh oksidasi 3-amino-9-ethylcarbazole atau 4-chloro-1-
naphthol155 substrat oleh mieloperoksidase dalam sel untuk
membentuk endapan berwarna coklat.
Enzim myeloperoxidase sensitif terhadap cahaya, dan apusan harus
segera diwarnai atau terlindung dari cahaya. Aktivitas enzimatik dalam
sel dapat berkurang seiring waktu, sehingga pewarnaan tidak boleh
dilakukan pada apusan darah atau apusan sumsum tulang yang lebih
lama dari 3 minggu. Permount media pemasangan kaca penutup
(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) dapat menyebabkan noda memudar.
Myeloperoxidase juga sensitif terhadap panas dan perlakuan metanol.
Sel eritroid dapat diwarnai untuk peroksidase setelah pengobatan
metanol karena interaksi nonenzimatik antara reagen pewarnaan dan
hemoglobin.pseudoperoksidase atau reaksi lepehne). Antibodi
terhadap mieloperoksidase tersedia untuk analisis aliran sitometrik
dan pewarnaan imunohistokimia di bagian jaringan tetap.156
Tidak spesifik (A-Naftil Butirat atau A-Naftil
Asetat) Esterase
Tidak spesifik (A-naftil butirat atau A-Pewarnaan naphthyl acetate)
esterase digunakan untuk mengidentifikasi sel monositik tetapi tidak
menodai granulosit atau eosinofil.154.157 Limfosit T matang diwarnai
dengan pola fokal yang khas, seperti titik. Pewarnaan juga bereaksi
dengan makrofag, histiosit, megakariosit, dan beberapa karsinoma. NS
A-Pewarnaan naftil butirat dianggap lebih spesifik, meskipun sedikit
kurang sensitif, dibandingkan dengan pewarnaan naftil butirat A-
pewarnaan naftil asetat.154 Pewarnaan diferensial dengan esterase
yang berbeda terlihat pada megakarioblas, yang tidak diwarnai dengan
A-naftil butirat, tetapi diwarnai dengan A-substrat naftil asetat.153
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase
Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) adalah enzim intranuklear
yang mengkatalisis penambahan deoxynucleotide triphosphate ke 3-
ujung hidroksil oligonukleotida atau

polideoksinukleotida tanpa memerlukan untai cetakan.158 TdT
ditemukan secara normal dalam nukleus timosit dan sel limfoid imatur
di dalam sumsum tulang, tetapi tidak ditemukan pada limfosit matur,
dan merupakan penanda yang berguna dalam mengidentifikasi
leukemia limfoblastik akut dan limfoma.152 Aktivitas TdT ditemukan
pada sekitar 90% leukemia limfoblastik akut serta pada sebagian kecil
leukemia myelogenous akut.159,160 Kadar TdT dapat diukur secara
biokimia, dengan pewarnaan sitokimia dengan teknik deteksi
imunofluoresen, dengan flow cytometry setelah permeabilisasi sel
yang baru dikumpulkan, atau dengan metode imunohistokimia.161-163
Pewarnaan imunofluoresen tidak langsung sangat sensitif dan dapat
diterapkan pada sampel yang dikeringkan di udara beberapa minggu
setelah pengumpulan, meskipun tidak lagi sering digunakan dengan
penggunaan flow cytometry secara luas.162 Metode imunohistokimia
untuk deteksi TdT berguna pada bagian jaringan yang tertanam
parafin dan dapat digunakan pada persiapan sentuh.161
Leukosit Alkaline Phosphatase
Aktivitas alkali fosfatase ditemukan dalam sitoplasma neutrofil,
osteoblas, sel endotel vaskular, dan beberapa limfosit. Tingkat alkaline
phosphatase dari neutrofil darah tepi dihitung dengan skor leukosit
alkaline phosphatase (LAP) dan berguna sebagai tes skrining untuk
membedakan leukemia myelogenous kronis dari reaksi leukemoid dan
gangguan mieloproliferatif lainnya.164 Skor PAP biasanya dilakukan
dengan menggunakan prosedur Kaplow.165 Metode ini menggunakan
naftol AS-BI fosfat sebagai substrat, yang digabungkan dengan garam
cepat violet B oleh enzim untuk menghasilkan produk reaksi merah
terang yang divisualisasikan di atas neutrofil. Skor LAP ditentukan
dengan evaluasi intensitas pewarnaan (berkisar dari 0 hingga 4+) dari
100 neutrofil atau pita yang dihitung. Skor PAP normal berkisar antara
15 hingga 130, tetapi mungkin ada variasi dalam rentang ini antar
laboratorium. Banyak keadaan penyakit yang berbeda dapat
menyebabkan elevasi atau depresi skor PAP (Tabel 1.7). Pasien dengan
leukemia myelogenous kronis memiliki skor LAP yang rendah
(biasanya antara 0 dan 13). Hemoglobinuria nokturnal paroksismal dan
beberapa sindrom myelodysplastic juga dapat ditandai dengan skor
LAP yang rendah.93,164
tabel 1.7
kondisi yang berhubungan dengan skor
pHospHatase (Lap) Leukosit yang abnormal
Skor PAP Rendah (<15)
CML
Hemoglobinuria nokturnal paroksismal
Neoplasma hematologi (jarang)
Neoplasma mielodisplastik
Infeksi langka atau paparan racun
Skor PAP Tinggi (>130)
Infeksi
Terapi faktor pertumbuhan
Neoplasma mieloproliferatif selain
gangguan inflamasi CML
Kehamilan, kontrasepsi oral
Stres
Obat-obatan (litium, kortikosteroid, estrogen)
CML, leukemia myelogenous kronis.
Bab 1 pemeriksaan darah dan sumsum tulang 15
aktivitas alkali fosfatase dalam sampel yang diambil dalam
antikoagulan EDTA.165 Tes ini dilakukan secara optimal pada apusan
darah kapiler segar atau pada darah yang diantikoagulasi dengan
heparin dan harus dilakukan dalam waktu 48 jam setelah pengambilan
sampel. Apusan darah dapat disimpan dalam freezer selama 2 sampai
3 minggu dengan sedikit kehilangan aktivitas.
Asam fosfatase
Fosfatase asam ditemukan di semua sel hematopoietik, tetapi kadar
tertinggi ditemukan di makrofag dan osteoklas. Pola seperti titik yang
terlokalisasi terlihat di banyak T-limfoblas, tetapi pola pewarnaan ini
tidak dapat diandalkan. Asam fosfatase tahan tartrat (TRAP) adalah
isoenzim asam fosfatase yang ditemukan dalam kadar tinggi dalam sel-
sel leukemia sel berbulu.166 dan osteoklas. Beberapa metode
pengukuran aktivitas TRAP telah dijelaskan, tetapi metode yang
menggunakan asam fosfat AS-BI naftol yang digabungkan dengan GBC
garnet cepat dapat diandalkan dan dapat direproduksi.167 Tidak semua
kasus pewarnaan leukemia sel berbulu untuk TRAP, dan intensitas
pewarnaan dapat bervariasi. Pewarnaan TRAP positif juga dapat dilihat
pada beberapa limfosit T yang diaktifkan, makrofag, beberapa histiosit
(seperti sel Gaucher), sel mast, dan beberapa limfoma zona marginal.
168 Pewarnaan TRAP juga dapat dideteksi dengan metode
imunohistokimia pada bagian jaringan yang difiksasi.169
Hematologi Laboratorium
Asam Periodik–Schiff
Pewarnaan periodik acid-Schiff (PAS) mendeteksi glikogen intraseluler dan
mukopolisakarida netral, yang ditemukan dalam jumlah yang bervariasi di
sebagian besar sel hematopoietik.154,170 Pewarnaan PAS terlihat pada blas
baik leukemia limfoblastik akut maupun leukemia myelogenous akut,
meskipun terdapat variabilitas yang besar antar kasus.170
Eritroleukemia menunjukkan kepositifan sitoplasma difus yang intens
dengan PAS, yang dapat membantu dalam diagnosis.152 Selain itu,
pewarnaan PAS sangat berguna dalam menunjukkan akumulasi
glukoserebrosidase abnormal pada penyakit Gaucher.171
Besi
Besi seluler ditemukan sebagai feritin atau hemosiderin. Hal ini diidentifikasi
dalam sel oleh Perls atau reaksi biru Prusia, di mana besi ionik bereaksi
dengan asam ferrocyanide untuk memberikan warna biru.154,170,172
pewarnaan digunakan untuk mengidentifikasi besi dalam sel darah
merah berinti (sideroblasron) dan histiosit (besi retikuloendotelial) atau
untuk mengidentifikasi badan penheimer dalam eritrosit. Biasanya,
prekursor sel darah merah mengandung satu atau lebih kecil (<1Mm)
butiran biru di 20% hingga 50% sel. Ketika peningkatan jumlah granula ini
mengelilingi setidaknya dua pertiga dari nukleus prekursor sel darah
merah, sel disebutsideroblas bercincin.173 Noda paling baik digunakan pada
apusan aspirasi sumsum tulang tetapi juga dapat digunakan pada apusan
darah dan bagian jaringan bekuan aspirasi. Dekalsifikasi dari biopsi inti
sumsum tulang dapat menyebabkan hilangnya zat besi dari sel, yang
menyebabkan kesan palsu tentang zat besi yang rendah.
Toluidin Biru
Biru toluidin secara khusus menandai basofil dan sel mast dengan bereaksi
dengan mukopolisakarida asam dalam butiran sel untuk membentuk
kompleks metakromatik. Sel mast atau basofil ganas mungkin memiliki
kadar mukopolisakarida asam yang rendah dan mungkin tidak bereaksi
dengan pewarna ini.174 Penanda imunohistokimia spesifik, seperti
pewarnaan untuk tryptase sel mast mungkin lebih spesifik dalam identifikasi
sel mast daripada pewarnaan toluidine blue.175
Noda imunositokimia
Pewarnaan imunositokimia didasarkan pada penggunaan antibodi
yang mengenali epitop antigenik spesifik pada sel. Ada tingkat
kekhususan yang tinggi. Secara umum, noda ini dapat diterapkan pada:
16 Bagian I Hematologi Laboratorium
apusan darah, aspirasi sumsum tulang, suspensi seluler, atau potongan
jaringan. Tidak semua preparat antibodi sama efektifnya pada semua jenis
spesimen, dan prosedur pewarnaan dapat bervariasi tergantung pada jenis
spesimen. Berbagai macam antibodi spesifik untuk antigen seluler
hematopoietik tersedia secara komersial. Beberapa antibodi yang lebih baru
telah menggantikan pewarnaan sitokimia klasik dan mungkin berguna pada
spesimen yang lebih tua atau tetap.
Pewarnaan imunositokimia dari darah segar atau suspensi sel
sumsum tulang atau suspensi sel dari jaringan dan analisis dengan
flow cytometry adalah modalitas pengujian tambahan umum yang
digunakan ketika keganasan hematologi dicurigai.176.177 Flow
cytometer mendeteksi data hamburan cahaya dan keberadaan
antibodi berlabel fluorokrom spesifik yang telah terikat pada
permukaan sel. Penggunaan fluorokrom yang berbeda dapat
memungkinkan lebih dari satu antibodi untuk dipelajari secara
bersamaan pada sel yang sama melalui panjang gelombang eksitasi
yang berbeda. Studi penanda permukaan sel ini memungkinkan
analisis limfoma dan leukemia yang cepat dan akurat, penghitungan
subset sel T, dan identifikasi sel tumor. Selain itu, kemajuan terbaru
telah memungkinkan deteksi antigen intracytoplasmic atau nuklir,
seperti myeloperoxidase dan TdT, dengan analisis aliran cytometric.176
Dalam banyak kasus, terutama pada leukemia akut, analisis aliran
sitometrik leukemia akut memberikan informasi prognostik penting
yang tidak tersedia melalui pewarnaan sitokimia dan berguna dalam
mendeteksi penyakit residual minimal.159,178 Aspek klinis dan teknis
analisis aliran sitometrik tumor hematologi dibahas secara rinci dalam
Bab 2.
Pewarnaan imunohistokimia adalah penggunaan probe antibodi
spesifik pada bagian jaringan atau apusan darah dan sumsum tulang.
Ini memungkinkan lokalisasi epitop antigenik spesifik ke permukaan
sel, sitoplasma, atau nukleus. Ikatan antigen kemudian dapat dideteksi
dengan imunofluoresensi, yang memerlukan mikroskop fluoresensi
khusus, atau dengan pembentukan enzimatik dari produk reaksi
berwarna yang terkait dengan kompleks antigen-antibodi. Teknik
pewarnaan imunoenzim meliputi teknik imunoperoksidase,
immunoalkaline phosphatase, dan avidin-biotin.179,180
Prosedur ini memungkinkan studi spesimen dengan mikroskop cahaya
standar dan memberikan catatan pewarnaan permanen yang dapat
diperiksa ulang. Di masa lalu, repertoar antibodi yang tersedia untuk
digunakan pada jaringan tertanam parafin terbatas, dan banyak antibodi
memerlukan bagian beku dari jaringan segar untuk digunakan. Seiring
waktu, bagaimanapun, telah terjadi peningkatan besar dalam jumlah
antibodi yang dapat digunakan pada jaringan tetap dan diproses.181.182
Instrumen imunostaining otomatis telah tersedia yang memungkinkan hasil yang
sangat dapat direproduksi dan membutuhkan lebih sedikit waktu dan keahlian
teknisi untuk pewarnaan yang sangat dapat direproduksi.179,183
studi LaboRatoRy lainnya
Analisis sitogenetik
Banyak keganasan hematologi dan kondisi pra keganasan
berhubungan dengan perubahan sitogenetik spesifik.152.184.185,186.187
Ini termasuk perubahan khas dalam jumlah kromosom, translokasi,
dan inversi materi genetik. Perubahan kromosom ini sering dikaitkan
dengan aktivasi atau peningkatan transkripsi onkogen dan dapat
berkontribusi pada perolehan fenotipe ganas.188 Analisis sitogenetik
merupakan elemen penting dalam diagnosis gangguan hematologi,
mengidentifikasi subkelompok prognostik spesifik, dan pemantauan
perkembangan penyakit atau penyakit residual setelah terapi, dan
merupakan bagian integral dari klasifikasi keganasan hematologi
terkini, seperti klasifikasi WHO.152.159,189,190.191 Baik preparat
kromosom standar dan teknik hibridisasi in situ berlabel fluoresen
dapat digunakan untuk analisis sitogenetik dari perubahan kromosom.
192.193 Rincian lebih lanjut tentang teknik dan analisis sitogenetik
disediakan di Bab 3.
Genetika Molekuler
Selain analisis morfologi dan sitogenetika standar, telah dikembangkan
teknologi yang memungkinkan analisis perubahan molekuler pada
keganasan hematologi.189,190,194.195 Dengan menggunakan teknik
Southern blot dan polymerase chain reaction (PCR), proliferasi
hematopoietik dapat dipelajari untuk perubahan genetik yang terkait
dengan perkembangan keganasan.196 Analisis genetik molekuler pada
awalnya digunakan untuk mengidentifikasi monoklonalitas pada
neoplasma limfoid dengan mengidentifikasi pengaturan ulang gen
imunoglobulin (sel B) atau reseptor sel T.197,198 Temuan ini sangat
berguna dalam klasifikasi gangguan limfoproliferatif yang mungkin
sulit didiagnosis berdasarkan morfologi saja atau yang tidak memiliki
penanda fenotipik spesifik.197 Dalam beberapa tahun terakhir, telah
terjadi ledakan dalam penggunaan teknik molekuler untuk mendeteksi
translokasi yang sebelumnya hanya terdeteksi oleh sitogenetika
konvensional. Tes umum termasukBCRABL1 translokasi terlihat pada
leukemia myelogenous kronis dan leukemia akut dan digunakan untuk
memantau kemanjuran pengobatan,189.199
BCL2 karakteristik translokasi limfoma folikular,200 translokasi t (15;17)
terkait dengan leukemia promyelocytic akut,201,202 JAK2 translokasi
terkait dengan gangguan mieloproliferatif,203.204 dan NPM1 dan FLT3
mutasi, yang merupakan faktor prognostik pada leukemia myeloid
akut.205–207 Pada leukemia myelogenous kronis, BCR-ABL1 Analisis
mutasi domain kinase dapat dilakukan untuk mendeteksi mutasi yang
menyebabkan resistensi imatinib208.209. Ketika karakterisasi molekuler
dan profil genetik dari kelainan hematologi spesifik berkembang,
seperti melalui analisis microarray,210–212 dapat diantisipasi bahwa
lebih banyak PCR dan tes molekuler akan dikembangkan. Studi
molekuler memiliki keunggulan dibandingkan analisis morfologi dan
sitogenetik konvensional karena dapat mendeteksi populasi sel ganas
yang sangat kecil (sedikitnya 1% hingga 5% dari sel dalam sampel),
memungkinkan kuantifikasi transkrip tingkat rendah untuk
memungkinkan pemantauan status penyakit, dan dapat mengarah
pada penyelesaian tes yang lebih cepat (terutama dengan pengujian
berbasis PCR).199.201 Tes molekuler paling berguna ketika entitas
spesifik yang diketahui sedang diuji atau dalam memantau penyakit
residual karena tidak memberikan kemampuan skrining yang efektif
untuk perubahan genetik tambahan yang dapat mempengaruhi
prognosis, seperti halnya analisis sitogenetik konvensional.184.192,213
Tingkat sensitivitas yang tinggi membuat pengujian molekuler,
terutama dengan PCR atau hibridisasi in situ, sangat menarik untuk
tujuan pemantauan persistensi tumor atau kekambuhan setelah terapi.
Sebelumnya, studi genetik molekuler membutuhkan koleksi bahan
diagnostik segar atau beku; namun, banyak pengujian yang lebih baru
dapat menggunakan bahan yang difiksasi formalin dengan sensitivitas
yang serupa dengan bahan segar atau beku.214.215 Hal ini
memungkinkan analisis dilakukan pada cakupan kasus yang lebih luas,
termasuk bahan arsip. Topik genetika molekuler dibahas secara lebih
rinci dalam Bab 4.
mikroskop elektron
Mikroskop elektron memungkinkan pemeriksaan detail ultrastruktural
sel. Di masa lalu, mikroskop elektron digunakan sebagai alat penelitian
dan, kadang-kadang, sebagai alat diagnostik untuk diagnosis
hematologi yang sulit. Namun, dengan munculnya peningkatan jumlah
pewarnaan imunositokimia spesifik, penggunaan mikroskop elektron
sebagai alat diagnostik untuk proses hematopatologi sebagian besar
telah dihentikan.
Laju Sedimentasi eritrosit
Tingkat sedimentasi eritrosit (ESR) adalah tes umum tetapi tidak
spesifik yang sering digunakan sebagai indikator penyakit aktif. Ini
mencerminkan kecenderungan sel darah merah untuk menetap lebih
cepat dalam menghadapi beberapa keadaan penyakit, biasanya karena
peningkatan fibrinogen plasma, imunoglobulin, dan protein reaksi fase
akut lainnya. Selain itu, perubahan bentuk sel darah merah atau

nomor dapat mempengaruhi ESR. Sel sabit dan gangguan polisitemia cenderung
menurunkan LED, sedangkan anemia dapat meningkatkannya. ESR juga
meningkat seiring bertambahnya usia pada orang sehat (walaupun cenderung
turun pada orang dewasa yang lebih tua dari usia 75 tahun)216 dan cenderung
lebih tinggi pada wanita. Orang dengan penyakit hati, karsinoma, atau penyakit
serius lainnya mungkin memiliki LED normal hingga rendah karena
ketidakmampuan memproduksi protein fase akut.217
Penyebab umum peningkatan ESR adalah infeksi, tetapi gammopati
monoklonal harus disingkirkan pada pasien yang memiliki peningkatan ESR
persisten yang tidak dapat dijelaskan. ESR yang meningkat juga terlihat
pada kehamilan, keganasan, penyakit vaskular kolagen, penyakit jantung
rematik, dan keadaan penyakit kronis lainnya, termasuk infeksi human
immunodeficiency virus.218–220 ESR adalah tes skrining yang buruk pada
individu tanpa gejala, mendeteksi peningkatan pada 4% hingga 8% orang
dewasa normal dan, karenanya, tidak boleh digunakan untuk menyaring
orang tanpa gejala untuk penyakit.220 Tes ini mungkin paling baik digunakan
dalam skenario klinis pasien dengan keluhan samar-samar untuk
membantu dalam keputusan klinis untuk menjalani pengujian lebih lanjut
atau sebagai alat untuk mengikuti perjalanan penyakit klinis di arteritis
temporal, rheumatoid arthritis, polymyalgia rheumatica, atau limfoma.220
ESR diukur dengan metode Westergren atau Wintrobe atau dengan
modifikasi tes ini.221 Keduanya diukur dalam milimeter per jam, tetapi
nilai normal untuk setiap metode bervariasi karena perbedaan panjang
dan bentuk tabung. Kedua metode memerlukan koreksi untuk anemia
pasien. Beberapa variasi teknis metode penentuan ESR telah
diperkenalkan, termasuk metode mikro, sedimentasi pada sudut 45°,
dan laju sedimentasi zeta. Laju sedimentasi zeta mengukur
pengemasan eritrosit dalam empat siklus dispersi dan pemadatan
selama 45 detik dalam tabung kapiler. Ini memerlukan instrumen
khusus, Zetafuge (Coulter Electronics, Hialeah, FL), tetapi memberikan
hasil yang dapat direproduksi pada jumlah darah yang sangat kecil dan
tidak terpengaruh oleh anemia pasien.222
plasma dan Viskositas Darah
Pengukuran viskositas plasma dianjurkan oleh beberapa penulis sebagai
lebih unggul daripada pengukuran ESR untuk memantau keadaan penyakit,
terutama pada penyakit autoimun dan penyakit yang ditandai dengan
sekresi sejumlah besar imunoglobulin ke dalam plasma (seperti diskrasia sel
plasma).223 Pengukuran viskositas plasma memiliki keuntungan karena
tidak ada pengaruh sel darah merah pada nilai yang diperoleh dan
menghasilkan rentang referensi yang lebih sempit dari nilai normal
daripada yang diamati dengan ESR.224 Namun, viskositas plasma digunakan
lebih jarang daripada ESR, mungkin mencerminkan keakraban klinis dengan
tes terakhir. Seperti halnya ESR, viskositas plasma dapat meningkat seiring
bertambahnya usia.223 Pengukuran langsung protein fase akut, seperti
protein C-reaktif, juga dapat digunakan untuk memantau perjalanan
penyakit inflamasi dan risiko jantung.225.226 Namun, tes ini biasanya lebih
mahal daripada penentuan ESR dan mungkin tidak memberikan informasi
klinis tambahan yang cukup untuk membenarkan biaya tambahan.227
Pengukuran viskositas darah secara keseluruhan memiliki penggunaan
klinis yang terbatas karena viskositas darah yang diukur mungkin memiliki
sedikit pengaruh pada viskositas darah dalam sirkulasi. Peningkatan
viskositas darah dapat berkontribusi pada morbiditas dan mortalitas pasien
dengan penyakit sel sabit, polisitemia, dan penyakit vaskular iskemik.
Pengukuran Volume Darah
Dalam kebanyakan kasus, jumlah total eritrosit berkaitan erat dengan
konsentrasi sel darah merah atau Hct. Namun, volume darah mungkin
tidak selalu mencerminkan konsentrasi eritrosit, termasuk segera
setelah perdarahan hebat, dehidrasi berat, atau overhidrasi. Untuk
menilai secara akurat volume darah pada pasien ini, volume plasma
atau massa sel darah merah atau volume harus ditentukan,44,228
meskipun tes ini jarang dilakukan. Volume plasma diukur dengan
metode pengenceran menggunakan a
Bab 1 pemeriksaan darah dan sumsum tulang 17
zat yang terbatas pada kompartemen plasma intravaskular, seperti
pewarna biru Evans,229 131Albumin berlabel I, atau transferin berlabel
indium radioaktif, disuntikkan dan volume distribusi dihitung dari
tingkat pengenceran zat yang disuntikkan selama 15 sampai 30 menit.
Albumin berlabel radio adalah yang paling umum digunakan, tetapi
koreksi harus dilakukan karena label secara bertahap dikeluarkan dari
sirkulasi ke ruang ekstravaskular, yang menyebabkan kesalahan 10%
atau lebih dalam penentuan volume plasma.230 Volume plasma juga
dapat diperkirakan dari volume sel darah merah.231
Total volume sel darah merah dihitung dengan teknik Ashby, yang
menggunakan sel darah merah berlabel radio. Sejumlah radioisotop dapat
digunakan, tetapi51Cr dan 99mTc adalah yang paling umum. Sel biotinilasi
juga dapat digunakan.232 Volume sel darah merah kemudian dihitung
dengan pengenceran sel berlabel dari waktu ke waktu menggunakan rumus
berikut:
Volume sel darah merah = cpm isotop yang disuntikkan/cpm/ml sel darah merah
konsentrasi per satuan volume dalam sampel
Biasanya, pengukuran dilakukan setelah interval 15 menit, meskipun
periode yang lebih lama mungkin diperlukan dengan viskositas darah tinggi
karena Hcts tinggi untuk memastikan pencampuran sel berlabel lengkap.
Pengukuran volume sel darah merah total harus dikoreksi dengan
pembesaran limpa sekunder untuk sekuestrasi sel berlabel dalam organ ini.
Volume sel darah merah juga dapat dihitung dari volume plasma total dan
Hematologi Laboratorium
diukur Hct dengan menggunakan persamaan berikut:
Volume sel darah merah = Hct × volume plasma/100 – Hct
Volume plasma total mungkin berguna dalam memantau penggantian cairan dan darah.
Pengukuran volume sel darah merah digunakan untuk mendokumentasikan polisitemia
yang sebenarnya, meskipun beberapa penulis menganjurkan penggunaan kadar
eritropoietin dan pertumbuhan koloni sel darah merah sebagai tes pengganti yang
kurang invasif untuk pengukuran volume sel darah merah atau massa sel darah merah.
44 Volume darah total dapat dihitung dari jumlah total volume sel darah merah dan
pengukuran volume plasma.
referensi yang dipilih
Daftar referensi lengkap untuk bab ini dapat ditemukan dalam versi online.
2. CLSI. Sasaran kinerja untuk kontrol kualitas internal penganalisis hematologi multisaluran;
Standar yang Disetujui. Dokumen CLSI H26-A. Institut Standar Klinis dan Laboratorium,
1996.
3. Barnes PW, McFadden SL, Machin SJ, dkk. Kelompok konsensus internasional untuk
tinjauan hematologi: kriteria yang disarankan untuk tindakan berikut analisis diferensial
CBC dan WBC otomatis. Lab Hematol 2005;11(2):83–90.
4. Novis DA, Walsh M, Wilkinson D, dkk. Produktivitas laboratorium dan tingkat tinjauan
apusan darah tepi manual: studi Q-Probes College of American Pathologists dari 95.141
penentuan hitung darah lengkap yang dilakukan di 263 institusi. Arch Pathol Lab Med
2006;130(5):596–601.
5. Froom P, Havis R, Barak M. Tingkat tinjauan apusan darah tepi manual pada pasien rawat
jalan. Clin Chem Lab Med: CCLM/FESCC 2009;47(11):1401–1405.
6. Cheng CK, Chan J, Cembrowski GS, dkk. Diagram interval referensi hitung darah lengkap
yang diturunkan dari NHANES III: stratifikasi berdasarkan usia, jenis kelamin, dan ras. Lab
Hematol 2004;10(1):42–53.
11. CLSI. Tabung dan aditif untuk pengumpulan spesimen darah vena, edisi ke-5. Standar yang
Disetujui, 2003.
12. CLSI. Evaluasi kinerja presisi metode pengukuran kuantitatif, 2nd ed. Pedoman yang
Disetujui, 2004.
13. CLSI. Evaluasi awal prosedur pengukuran laboratorium klinis kuantitatif, edisi ke-3.
Pedoman yang Disetujui, 2006.
15. Wintrobe M. Hematokrit sederhana dan akurat. J Lab Clin Med 1929;15: 287–289.
16. Bourner G, Dhaliwal J, Sumner J. Evaluasi kinerja penganalisis hematologi otomatis terbaru
dalam pengaturan laboratorium komersial besar: studi 4 arah, berdampingan. Lab
Hematol 2005;11(4):285–297.
18. Davis BH, Bigelow NC. Analisis retikulosit otomatis. Praktik klinis dan parameter baru
terkait. Hematol Oncol Klinik UtaraAm 1994;8(4):617–630.
19. Kang SH, Kim HK, Ham CK, dkk. Perbandingan empat penganalisis hematologi, CELL-DYN
Sapphire, ADVIA 120, Coulter LH 750, dan Sysmex XE-2100, dalam hal kegunaan klinis. Int
J Lab Hematol 2008;30(6):480–486.
30. Harris N, Jou JM, Devoto G, dkk. Evaluasi kinerja penganalisis hematologi ADVIA 2120: uji
klinis multicenter internasional. Lab Hematol 2005;11(1):62–70.
31. Harris N, Kunicka J, Kratz A. Sistem hematologi ADVIA 2120: analisis aliran darah dan cairan
tubuh berbasis sitometri di laboratorium hematologi rutin. Lab Hematol 2005;11(1):47–61.
18 Bagian I Hematologi Laboratorium
33. Fairbanks VF. Tidak ada ekuivalensi indeks hematokrit dan eritrositik otomatis dan manual.
Am J Clin Pathol 1980;73(1):55–62.
34. Pearson TC, Guthrie DL. Plasma terperangkap dalam mikrohematokrit. Am J Clin Pathol
1982;78(5):770–772.
36. Beautyman W, Bills T. Surat: kesalahan osmotik dalam pengukuran volume sel darah
merah. Lancet 1974;2(7885)::905–906.
38. NCCLS. Referensi dan prosedur terpilih untuk penentuan kuantitatif hemoglobin dalam
darah, edisi ke-3. Standar yang Disetujui. Dokumen NCCLS H15-A3. Wayne, PA, 2000.
39. Cornbleet J. Hasil palsu dari penganalisa sel hematologi otomatis. Lab Med 1983;14:509–
514.
40. Linz LJ. Peningkatan hemoglobin, MCH, dan MCHC oleh paraprotein: cara mengenali dan
memperbaiki gangguan. Clin Lab Sci 1994;7(4):211–212.
41. Campbell NR, Edwards AL, Brant R, dkk. Efek pada lipid, hitung darah lengkap dan protein
darah dari persiapan standar untuk pengambilan darah: uji coba terkontrol secara acak.
Clin Invest Med 2000;23(6):350–354.
42. Metode referensi untuk pencacahan eritrosit dan leukosit. Dewan Internasional untuk
Standardisasi Hematologi; disiapkan oleh Panel Ahli Sitometri. Clin Lab Hematol
1994;16(2):131-138.
43. Bessman JD, Gilmer PR Jr, Gardner FH. Peningkatan klasifikasi anemia oleh MCV dan RDW.
Am J Clin Pathol 1983;80(3):322–326.
44. Tefferi A. Diagnosis polisitemia vera: tes baru dan diktum lama. Praktik Terbaik Res Clin
Haematol 2006;19(3):455–469.
45. Hermiston ML, Mentzer WC. Pendekatan praktis untuk evaluasi anak anemia. Klinik Pediatr
North Am 2002;49(5):877–891.
48. Tefferi A, Hanson CA, Inwards DJ. Bagaimana menafsirkan dan mengejar jumlah sel darah
lengkap yang abnormal pada orang dewasa. Mayo Clin Proc 2005;80(7):923–936.
49. CLSI. Validasi, verifikasi, dan jaminan kualitas penganalisis hematologi otomatis, edisi ke-2.
Standar yang Disetujui. Dokumen CLSI H26-A2. Wayne, PA: Institut Standar Klinis dan
Laboratorium, 2010.
50. Rekomendasi ICSH untuk analisis kurva distribusi ukuran sel darah merah, sel darah putih
dan trombosit: I prinsip umum. J Clin Pathol 1982;35(12): 1320–1322.
51. Rekomendasi ICSH untuk analisis kurva distribusi ukuran sel darah merah, sel darah putih
dan trombosit. Metode untuk menyesuaikan distribusi referensi tunggal dan menilai
kecocokannya. Komite Internasional untuk Standardisasi Hematologi. Panel Pakar ICSH
tentang Sitometri. Clin Lab Hematol 1990;12(4):417–431.
58. Usulan metode referensi untuk penghitungan retikulosit berdasarkan penentuan rasio
retikulosit terhadap sel darah merah. Panel Ahli Sitometri Dewan Internasional untuk
Standardisasi Hematologi. Clin Lab Hematol 1998;20(2):77–79.
63. Fohlen-Walter A, Jacob C, Lecompte T, dkk. Identifikasi laboratorium cryoglobulinemia dari
jumlah sel darah otomatis, sampel darah segar, dan film darah. Am J Clin Pathol
2002;117(4):606–614.
64. Lombarts AJ, de Kieviet W. Pengakuan dan pencegahan pseudotrombositopenia dan
pseudoleukositosis bersamaan. Am J Clin Pathol 1988;89(5):634–639.
67. CLSI. Referensi leukosit (WBC) diferensial count (proporsional) dan evaluasi metode
instrumental, 2nd ed. Standar yang Disetujui. Dokumen CLSI H20-A2. Wayne, PA, 2007.
70. Koepke JA, Dotson MA, Shifman MA. Evaluasi kritis dari metode penghitungan leukosit
diferensial manual/visual. Sel Darah 1985;11(2):173–186.
71. Rumke C. Variabilitas yang diharapkan secara statistik dalam penghitungan diferensial.
Skokie, IL: Kolese Ahli Patologi Amerika, 1978.
78. Briggs C, Longair I, Slavik M, dkk. Dapatkah analisis film darah otomatis menggantikan
diferensial manual? Evaluasi sistem analisis gambar otomatis CellaVision DM96. Int J Lab
Hematol 2009;31(1):48–60.
90. Noris P, Klersy C, Zecca M, dkk. Ukuran trombosit membedakan antara
makrotrombositopenia bawaan dan trombositopenia imun. J Thromb Haemost
2009;7(12):2131–2136.
93. Michiels JJ, De Raeve H, Berneman Z, dkk. Organisasi Kesehatan Dunia 2001 dan kriteria
klinis dan patologis Eropa yang diperbarui untuk diagnosis, klasifikasi, dan pementasan
kelainan mieloproliferatif kronis kromosom negatif Philadelphia. Semin Thromb Hemost
2006; 32(4 Pt 2):307–340.
100. Koike Y, Miyazaki K, Higashihara M, dkk. Signifikansi klinis deteksi trombosit imatur:
perbandingan antara persentase trombosit retikulat yang dideteksi oleh flow cytometry
dan fraksi trombosit imatur yang dideteksi dengan pengukuran otomatis. Eur J Haematol
2010;84(2):183–184.
104. Bentley SA. Kontrol kualitas dan jumlah leukosit diferensial. Clin Lab Hematol 1990;12(Suppl
1):101–109.
105. Rekomendasi Dewan Internasional untuk Standardisasi Hematologi untuk Antikoagulasi
Asam Ethylenediaminetetraacetic Darah untuk Penghitungan dan Ukuran Sel Darah.
Dewan Internasional untuk Standardisasi Hematologi: Panel Ahli Sitometri. Am J Clin
Pathol 1993;100(4): 371–372.
106. Savage RA, Hoffman GC. Signifikansi klinis kesalahan matriks osmotik dalam hematologi
otomatis: frekuensi kesalahan matriks osmotik hiperglikemik menghasilkan makrositosis
palsu. Am J Clin Pathol 1983;80(6):861–865.
107. Sireci A, Schlaberg R, Kratz A. Metode untuk mengoptimalkan dan memvalidasi kriteria
penandaan khusus institusi untuk penghitung sel otomatis. Arch Pathol Lab Med
2010;134(10):1528–1533.
108. Hoyer JD. Diferensial leukosit. Mayo Clinic Proc 1993;68(10):1027–1028.
109. Vives Corrons JL, Van Blerk M, Albarede S, dkk. Pedoman untuk menyiapkan skema
penilaian kualitas eksternal untuk interpretasi apusan darah. Bagian II: persiapan survei,
evaluasi statistik dan pelaporan. Clin Chem Lab Med: CCLM/FESCC 2006;44(8):1039–1043.
111. Hasserjian RP. Sumsum tulang reaktif versus neoplastik: masalah dan jebakan. Arch Pathol
Lab Med 2008;132(4):587–594.
114. Houwen B. Persiapan film darah dan prosedur pewarnaan. Clin Lab Med 2002;22(1):1–14.
115. McGoogan E, Colgan TJ, Ramzy I, dkk. Metode preparasi sel dan kriteria kecukupan sampel.
Ringkasan Satuan Tugas Akademi Sitologi Internasional. Sitologi Diagnostik Menuju Abad
21: Konferensi dan Tutorial Pakar Internasional. Acta Cytol 1998;42(1):25–32.
117. Barth D. Pendekatan penilaian film darah tepi untuk ahli patologi. Semin Diagn Pathol
2012;29(1):31–48.
119. Prokocimer M, Potasman I. Nilai tambah morfologi sel darah tepi dalam diagnosis dan
tatalaksana penyakit menular—bagian 1: konsep dasar. Pascasarjana Med J
2008;84(997):579–585.
131. Schwind JL. Metode supravital dalam studi sitologi sel darah dan sumsum. Darah
1950;5(7):597–622.
137. Bain BJ, Bailey K. Kesalahan dalam memperoleh dan menafsirkan aspirasi sumsum tulang:
berbuat salah adalah manusiawi. J Clin Pathol 2011;64(5):373–379.
138. Hyun BH, Stevenson AJ, Hanau CA. Dasar-dasar pemeriksaan sumsum tulang. Hematol
Oncol Klinik Am Utara 1994;8(4):651–663.
139. Riley RS, Hogan TF, Pavot DR, dkk. Perspektif ahli patologi tentang aspirasi dan biopsi
sumsum tulang: I. Melakukan pemeriksaan sumsum tulang. J Clin Lab Anal 2004;18(2):70–
90.
143. Wilkins BS, Clark DM. Memaksimalkan biopsi trephine sumsum tulang. Histopatologi
2009;55(6):631–640.
146. Rosse C, Kraemer MJ, Dillon TL, dkk. Populasi sel sumsum tulang bayi normal; Dominasi
limfosit. J Lab Clin Med 1977;89(6)::1225-1240.
152. SIAPA. Klasifikasi tumor jaringan hematopoietik dan limfoid oleh Organisasi Kesehatan
Dunia, edisi ke-4. Lyon, Prancis: IARC Press, 2008.
155. Laboratorium Hematologi. Dalam: Chanarin I, ed. Hematologi laboratorium: penjelasan
tentang teknik laboratorium. London: Church Livingstone, 1989:170-172.
159. McGregor S, McNeer J, Gurbuxani S. Di luar klasifikasi Organisasi Kesehatan Dunia 2008:
peran laboratorium hematopatologi dalam diagnosis dan pengelolaan leukemia
limfoblastik akut. Semin Diagn Pathol 2012;29(1):2–11.
170. Crook L, Liu PI, Cannon A, dkk. Histokimia aspirasi sumsum tulang. Ann Clin Lab Sci
1980;10(4):290–304.
176. Davis BH, Holden JT, Bene MC, dkk. 2006 Bethesda International Consensus rekomendasi
pada analisis aliran cytometric immunophenotypic neoplasia hematolymphoid: indikasi
medis. Sitometri B Clin Cytom 2007;72(Suppl 1):S5–13.
177. Bendung EG, Borowitz MJ. Flow cytometry dalam diagnosis leukemia akut. Semin Hematol
2001;38(2):124-138.
179. Leong TY, Cooper K, Leong AS. Imunohistologi - masa lalu, sekarang, dan masa depan. Adv
Anat Pathol 2010;17(6):404–418.
181. Lu J, Chang KL. Imunohistokimia praktis dalam hematopatologi: tinjauan antibodi yang
berguna untuk diagnosis. Adv Anat Pathol 2011;18(2):133-151.
182. Garcia CF, Swerdlow SH. Praktik terbaik dalam imunohistokimia diagnostik kontemporer:
pendekatan panel untuk proliferasi hematolimfoid. Arch Pathol Lab Med 2009;133(5):756–
765.
184. Studi Swansbury J. Sitogenetik pada keganasan hematologi: gambaran umum. Metode Mol
Biol 2003;220:9–22.
185. KwonWK, Lee JY, Mun YC, dkk. Utilitas klinis analisis FISH selain kariotipe G-banded pada
keganasan hematologi dan proposal pendekatan praktis. Korean J Hematol
2010;45(3):171–176.
190. Kolialexi A, Tsangaris GT, Kitsiou S, dkk. Dampak studi sitogenetik dan sitogenetik
molekuler pada keganasan hematologi. Antikanker Res 2005;25(4):2979–2983.
191. Arber DA, Stein AS, Carter NH, dkk. Dampak prognostik klasifikasi leukemia myeloid akut.
Pentingnya deteksi kelainan sitogenetik berulang dan displasia multilineage pada
kelangsungan hidup. Am J Clin Pathol 2003;119(5):672–680.
192. Bain BJ. Gambaran. Analisis sitogenetik dalam hematologi. Praktik Terbaik Res Clin
Haematol 2001;14(3):463–477.
193. Dewald GW, Brockman SR, Paternoster SF. Studi sitogenetik molekuler untuk keganasan
hematologi. Cancer Treat Res 2004;121:69-112.
196. Morgan GJ, Pratt G. Diagnostik molekuler modern dan pengelolaan keganasan
hematologis. Clin Lab Hematol 1998;20(3):135–141.
198. Gleissner B, Thiel E. Deteksi penyusunan ulang gen rantai berat imunoglobulin pada
keganasan hematologi. Pakar Rev Mol Diagn 2001;1(2):191–200.
200. Kunci D, Montoto S, Fitzgibbon J. Tanda tangan molekuler dalam diagnosis dan
pengelolaan limfoma folikular. Curr Opin Hematol 2010;17(4): 333–340.
202. Hasan SK, Lo-Coco F. Pemanfaatan fenotipe molekuler untuk mendeteksi kekambuhan dan
mengoptimalkan pengelolaan leukemia promyelocytic akut. Limfoma Klinik Myeloma
Leuk 2010;10(Suppl 3):S139–143.
222. Banteng BS, Brailsford JD. Rasio sedimentasi zeta. Darah 1972;40(4):550–559.
224. Lowe GD. Haruskah viskositas plasma menggantikan ESR? Sdr J Haemotol 1994;86(1):6–11.
 Bab 2

CLiniCaL Flow Cyto metri

anna Porwit

Definisi sinar cahaya satu per satu. Flow cytometers mengukur jumlah cahaya
yang dipancarkan oleh fluorochrome yang terkait dengan sel atau
partikel individu (Gbr. 2.1). Sitometer aliran baru memiliki tiga hingga
Salah satu arti dari kata mengalir adalah "bergerak dengan pergeseran
empat laser.12 Untuk aplikasi di FCM, antibodi terkonjugasi dengan
terus-menerus dari partikel komponen." Istilah sitometri mengacu
fluorokrom, pewarna yang menyerap cahaya dari laser dan
pada penghitungan (metrik) sel (sito). Dengan demikian, flow
memancarkan cahaya pada panjang gelombang yang lebih panjang.
cytometry (FCM) adalah metode yang menggunakan aliran cairan
Daftar fluorokrom yang biasa digunakan dalam FCM klinis diberikan
untuk membawa sel melalui penghitung. FCM mengevaluasi beberapa
pada Tabel 2.1.13 Cahaya yang dipancarkan difokuskan oleh lensa ke
parameter sel individu (atau partikel lain) dengan mengukur
kabel serat optik dan ditransmisikan ke detektor segi delapan (Gbr.
karakteristik cahaya yang mereka hamburkan atau foton yang mereka
2.1). Filter di depan setiap rangkaian detektor membatasi cahaya yang
pancarkan saat mengalir melalui sumber cahaya. Kekuatan teknologi
mencapai detektor hanya pada rentang panjang gelombang tertentu
ini terletak pada throughputnya yang tinggi (pengukuran jumlah sel
yang kecil (disebut sebagai saluran). Sensor mengubah foton menjadi
yang tinggi dalam waktu singkat) dan kemampuannya untuk
impuls listrik yang sebanding dengan jumlah foton yang diterima dan
menangkap banyak parameter per sel, menilainya satu per satu. Saat
jumlah molekul fluorokrom yang terikat pada sel. Emisi fluoresen
ini, aplikasi utama FCM dalam praktik klinis adalah penghitung sel rutin
memiliki intensitas rendah dan harus diperkuat oleh tabung
dan imunofenotipe. Bab ini berfokus pada aplikasi klinis FCM dalam
photomultiplier (PMT). PMT menghitung foton spesifik dan cahaya
hematologi, terutama dalam diagnosis keganasan hematologi. Namun,
yang tersisa dipantulkan ke filter berikutnya, di mana proses ini
beberapa tes fungsional (misalnya, fosforilasi, sekresi sitokin,
diulang. Dengan demikian, sebagian besar fluoresensi terkait sel yang
terdeteksi dalam saluran tertentu dipancarkan oleh antibodi yang

Hematologi Laboratorium
digabungkan dengan fluorokrom atau reagen fluoresen lainnya yang
menarik. Impuls listrik dari fotoelektron yang dikumpulkan oleh PMT
Latar belakang sejarah diubah menjadi sinyal digital. Data FCM yang diperoleh disimpan
secara elektronik dalam apa yang disebut file mode daftar yang
FCM berasal dari pekerjaan yang dilakukan di Stockholm oleh T. Caspersson merupakan bagian dari rekam medis pasien.14
dan rekan kerja, yang pada 1930-an menunjukkan bahwa kandungan DNA,
Sepasang saluran hamburan cahaya memberikan ukuran perkiraan
diukur dengan ultraviolet dan penyerapan cahaya tampak dalam sel yang
ukuran sel (FS) dan granularity (SS). FS dan SS digunakan untuk menetapkan
tidak diwarnai, berlipat ganda selama siklus sel.1,2 Pada tahun 1950, Coons
ambang batas untuk memisahkan puing-puing, eritrosit, dan trombosit dari
dan Kaplan melaporkan deteksi antigen dalam jaringan menggunakan
sel berinti yang layak. Sel hidup menyebarkan lebih banyak cahaya daripada
metode antibodi terkonjugasi fluorescein, yang mendorong penggunaan
sel mati dan apoptosis dan karena itu memiliki FS yang lebih tinggi. SS
mikroskop fluoresensi secara luas.3 Pada tahun 1953, WH Coulter
dikumpulkan bersama-sama dengan cahaya fluoresen pada sudut siku-siku
mematenkan apa yang disebut prinsip Coulter dan membangun mesin FCM
terhadap sinar dan disebabkan oleh cahaya yang dipantulkan dari struktur
pertama, di mana sel-sel darah dalam suspensi garam melewati satu per
internal sel. Sel dengan granularitas tinggi atau vakuola seperti granulosit
satu melalui lubang kecil dan dideteksi dengan perubahan impedansi listrik
atau monosit akan memiliki SS lebih tinggi daripada sel tanpa granula
di lubang tersebut.4 Setelah kertas pertama di Sains oleh M.Fulwyler,5 era
seperti limfosit atau sel blast.
penggunaan standar FCM untuk penyortiran sel dimulai, dimulai dengan
Sebagian besar sel memiliki jumlah molekul fluoresen asli yang rendah yang
publikasi dari LA Herzenberg Laboratory di Stanford University, CA, USA
menentukan fluoresensi latar belakangnya. Beberapa cahaya mungkin berasal
pada awal 1970-an.6 Segera setelah itu, flow cytometers pertama tersedia
dari
secara komersial dari Becton Dickinson (sekarang BD Biosciences), diikuti
oleh perusahaan lain. FCM mulai digunakan secara klinis pada akhir 1980-
an, pada awalnya hanya di laboratorium khusus. Pada 1990-an dan awal
2000-an, analisis tiga dan empat warna menjadi metode diagnostik standar
untuk imunofenotipe sampel hematologi. Banyak solusi klinis dan upaya
standardisasi diinisialisasi oleh A. Orfao dan rekan kerja, dari Universitas
Salamanca, Spanyol.7,8 Pada tahun 2010, FCM delapan dan sepuluh warna
menjadi metode klinis standar.9,10

Dalam pengaturan penelitian, aplikasi yang menggunakan FCM 19-parameter

yang menggabungkan 17 saluran fluoresensi dengan hamburan maju (FS) dan
hamburan samping (SS) telah dilaporkan.11

PRINSIP-PRINSIP Flow Cytometry

Untuk analisis yang andal, spesimen harus dalam suspensi
monodispersi. Dalam flow cytometer, cairan isotonik dipaksa di bawah
tekanan ke dalam tabung yang mengirimkannya ke sel aliran, di mana
kolom fluida dengan aliran laminar dan laju aliran tinggi dihasilkan
(disebut cairan selubung). Sampel dimasukkan ke dalam sel aliran
dengan jarum suntik yang digerakkan komputer di tengah cairan Gambar 2.1. Prinsip-prinsip sitometri aliran warna-warni. Suspensi sel tunggal bersifat hidrodi-
namically terfokus dengan cairan selubung untuk memotong laser (sistem tiga laser ditampilkan). Sinyal
selubung, menciptakan aliran koaksial di dalam aliran (yang disebut
fluoresensi dikumpulkan oleh beberapa detektor emisi fluoresensi, terpisah untuk setiap laser. Contoh
aliran inti sampel). Tekanan aliran selubung hidrodinamis fluorokrom yang dideteksi oleh laser yang berbeda diberikan menurut Tabel 2.1. Sinyal yang terdeteksi
menyelaraskan sel atau partikel sehingga mereka disajikan ke diperkuat oleh tabung photomultiplier dan diubah ke bentuk digital untuk analisis.

19
20

tabel 2.1

Tabel fLuorocHrome yang biasa digunakan di cLinicaL Flow cyTomeCoba

Menguji Contoh (nm) Em (nm) MW Akronim/Komentar

Probe Reaktif dan Terkonjugasi

R-Fikoeritrin 480;565 578 240k pe
Merah 613 480;565 613 PE-Texas Merah

Fluorescein isothiocyanate 495 519 389 FITC

Rhodamin isothiocyanate X- 547 572 444 TRITC
Rhodamine 570 576 548 XRITC
Protein klorofil peridinin 490 675 PerCP
Texas Red 589 615 625 TR
Allophycocyanin 650 660 104 k APC
BenarMerah 490.675 695 PerCP-Cy5.5
Alexa Fluor 647 650 668 1250
Alexa Fluor 700 696 719
Alexa Fluor 750 752 779
Sianin 5 (625);650 670 792 Cy5
Sianin 5.5 675 694 1128 Cy5.5
Sianin 7 743 767 818 Cy7
PE-TR-X 595 620 625 PAUD
Konjugat PE-Cy5 480;565;650 670 Cychrome, Tri-Color, Quantum Red
Konjugat PE-Cy7 480;565;743 767 PE-Cy7
Konjugat APC-Cy7 650;755 767 APC-CY7

Probe Asam Nukleat

4,6-Diamidino-2-phenylindole 345 455 DAPI, AT-selektif
SYTOX Biru 431 480 ~400 DNA
SYTOX Hijau 504 523 ~600 DNA
Etidium bromida 493 620 394
7-Aminoaktinomisin D 546 647 7-AAD, CG-selektif
jeruk akridin 503 530/640 DNA/RNA

Tiazol Jeruk 510 530 UNTUK (RNA)

Propidium iodida 536 617 668.4 PI

Em, panjang gelombang emisi puncak (nm); Mis, panjang gelombang eksitasi puncak (nm); MW, berat molekul.

dalam saluran yang berbeda. Interferensi dikoreksi dengan menerapkan
kompensasi fluoresensi berdasarkan data dari sampel bernoda tunggal. Ini
biasanya dilakukan dengan menggunakan sel atau manik-manik sebelum
atau selama fase akuisisi data. Namun, perangkat lunak analisis data FCM
modern juga memungkinkan pengumpulan data tanpa kompensasi dan
menerapkan kompensasi selama analisis. Sebelum akuisisi data, partikel
referensi standar (mikrosfer fluoresen) harus digunakan untuk
menyesuaikan pengaturan tegangan PMT sehingga manik-manik jatuh di
sekitar lokasi yang sama atau "saluran target" yang sama, yang telah
ditentukan sebelumnya untuk setiap fluorokrom.
Penyortiran Sel
Ruang aliran melekat pada kristal piezoelektrik, yang
bergetar pada frekuensi tertentu sehingga ketika fluida yang
membawa sel melewati nozzle, membentuk pancaran di udara dengan
kecepatan 15 m/s, getaran tersebut menyebabkan pancaran pecah
menjadi butiran-butiran yang seragam, kira-kira 30.000 sampai 40.000/
S. Setiap tetesan, ketika dipisahkan dari pancaran, dapat diisi dan
dibelokkan oleh medan listrik yang stabil dan dikumpulkan dalam
wadah. Hampir setiap sel diisolasi dalam tetesan terpisah. Ketika sel
dianalisis keputusan penyortiran dibuat, dan sampai pulsa muatan
listrik yang tepat diterapkan pada tetesan yang mengandung sel, ada
waktu transit yang ditentukan oleh beberapa faktor, seperti kecepatan
aliran, pemisahan tetesan, dan persiapan sel. Jika dua sel tidak dapat
dipisahkan, penyortiran dibatalkan.

Beberapa flow cytometers mampu memisahkan sel secara fisik (penyortir

sel yang diaktifkan fluoresensi, FACS) berdasarkan perbedaan dalam Antibodi monoklonal
parameter terukur apa pun. Penyortiran dicapai dengan pembentukan
Kemajuan FCM tidak akan mungkin terjadi tanpa pengembangan antibodi
tetesan. Komponen dasar dari setiap penyortir adalah:
monoklonal (MAbs). Dengan teknologi hybridoma pemenang Hadiah Nobel
• Generator tetesan yang dikembangkan pada tahun 1975 oleh Köhler dan Milstein,15 limfosit
• Sistem pengisian dan pembelokan tetesan dari limpa tikus yang diimunisasi dapat diabadikan dengan fusi ke sel-sel
• Komponen koleksi myeloma yang telah kehilangan kemampuan untuk membuat
• Sirkuit elektronik untuk mengoordinasikan waktu dan pembangkitan imunoglobulin (Igs) mereka sendiri tetapi mampu melakukan pembelahan
pulsa pengisian tetesan mitosis tanpa batas. Melalui pengenceran terbatas, individu

garis sel (hibridoma) yang menghasilkan antibodi dengan spesifisitas,
aviditas, dan isotipe yang unik dapat ditetapkan. Pada hari-hari awal
penerapan MAbs untuk imunologi, banyak laboratorium yang
mengimunisasi tikus dengan leukosit. Hibridoma yang diperoleh
menghasilkan banyak antibodi yang bereaksi dengan leukosit, tetapi
identitas target molekuler tidak diketahui. Spektrum reaktivitas
antibodi dapat dijelaskan dengan pewarnaan beberapa jenis sel yang
berbeda, dan dalam banyak kasus antigen target dapat diisolasi
dengan imunopresipitasi atau Western blotting dan berat molekulnya
serta karakteristik struktural lainnya ditentukan.
Putaran pertama multilaboratorium, buta, analisis komparatif
antibodi dilakukan selama Lokakarya Antigen Diferensiasi Leukosit
Manusia (HLDA) pertama 1982 di Paris, Prancis.16
Analisis statistik data dari beberapa laboratorium mengungkapkan
"kelompok diferensiasi," dinamai prosedur statistik analisis cluster dan
untuk fokus pada diferensiasi leukosit. Antibodi dianggap mendeteksi
molekul yang sama, dan molekul itu sendiri, diberi sebutan "CD".17
Sebuah organisasi yang disebut Dewan Antigen Diferensiasi Leukosit
Manusia telah dibentuk dan sembilan lokakarya HLDA berikutnya telah
mengkarakterisasi 350 antigen CD. Dewan HLDA meninjau dan
memodifikasi tujuan HLDA pada tahun 2004, dan mengubah nama
organisasi menjadi Molekul Diferensiasi Sel Manusia (HCDM). Alasan di
balik perubahan nama menjadi HCDM adalah untuk mematahkan
tradisi sambil mempertahankan huruf "CD," untuk mempertahankan
penekanan pada molekul asal manusia, untuk memperluas fokus dari
leukosit ke jenis sel lain yang berinteraksi dengan leukosit seperti sel
endotel atau molekul sel stroma , dan untuk memperluas cakupan dari
molekul permukaan sel ke molekul apa pun yang ekspresinya
mencerminkan diferensiasi, dengan mengenali nilai molekul
intraseluler yang semakin meningkat. Dewan HCDM menyimpan
database molekul CD yang komprehensif (www. hcdm.org). Antigen
CD, yang paling sering digunakan dalam imunofenotipe hematologi
tercantum dalam Tabel 2.2 dan dijelaskan dalam Lampiran A.
Persiapan sampel
Sampel yang sesuai untuk FCM klinis termasuk darah tepi (PB), aspirasi
sumsum tulang (BM), jaringan terpilah termasuk kelenjar getah bening
(LN) dan biopsi jaringan lunak lainnya serta aspirasi jarum halus (FNA)
dan biopsi inti BM, cairan serebrospinal (CSF ), cairan tubuh lainnya
termasuk cairan efusi dan lavage, dan inti dari jaringan tertanam
parafin untuk uji ploidi DNA. Dengan pengecualian yang terakhir,
semua spesimen FCM klinis lainnya harus dianggap biohazardous dan
diberi label sesuai dengan standar keamanan nasional atau regional.
Formulir permintaan pengujian, baik cetak atau elektronik, harus
menyertai semua spesimen. Formulir ini harus mencakup
pengidentifikasi unik pasien, usia, jenis kelamin, diagnosis (jika telah
ditetapkan sebelumnya) atau kondisi yang dicurigai dalam
pertimbangan, nama dokter yang menyerahkan spesimen, obat yang
bersangkutan atau pengobatan terbaru (termasuk tanggal kemoterapi
atau radiasi), tanggal dan waktu pengumpulan spesimen, dan sumber
spesimen (misalnya, aspirasi sumsum tulang, CSF, dll.). Tes yang
diminta harus muncul pada label spesimen atau pada permintaan yang
menyertai spesimen. Hitung darah lengkap (CBC) harus disediakan
untuk sampel PB dan BM. Untuk PB, asam etilen-diamintetraasetat
(EDTA), natrium heparin, atau asam sitrat dekstrosa (ACD) dapat
digunakan. Untuk aspirasi BM, natrium heparin adalah antikoagulan
yang disukai, dan diperlukan jika pengujian sitogenetik akan dilakukan
pada spesimen yang sama. Semua biopsi jaringan yang dimaksudkan
untuk evaluasi FCM, termasuk LN atau biopsi jaringan lainnya harus
diangkut dalam volume yang memadai dari media transportasi yang
sesuai dalam wadah steril untuk mengoptimalkan viabilitas sel.18
Semua sampel klinis harus dianalisis sesegera mungkin. Sebagai aturan
umum, 24 jam lebih disukai tetapi 48 jam dianggap sebagai kerangka waktu
terlama yang dapat diterima untuk analisis. Jika waktu transportasi
Bab 2 sitometri aliran klinis 21
lebih lama, laporan kelayakan adalah wajib dan hasilnya harus ditafsirkan
dengan hati-hati. Suhu kamar (18°C hingga 25°C) direkomendasikan untuk
penyimpanan dan pengangkutan. Untuk spesimen yang tidak sangat
terdegenerasi, sel-sel yang tidak dapat hidup dapat dikeluarkan dari analisis
dengan FS versus SS gating yang teliti. Sel-sel mati menjebak antibodi
terkonjugasi fluorokrom dan meningkatkan fluoresensi latar belakang.
Pewarna fluoresen yang mengikat DNA (Tabel 2.1) yang dikeluarkan dari sel
yang viabel dengan membran plasma utuh dan dengan demikian positif
pada sel yang tidak dapat hidup, juga dapat diterapkan.
Analisis PB/BM keseluruhan dengan lisis eritrosit direkomendasikan
untuk imunofenotip klinis. Immunophenotyping dari sel mononuklear
terpisah gradien kepadatan (Ficoll) tidak boleh digunakan karena
hilangnya sel selektif. Untuk pewarnaan permukaan, apa yang disebut
metode “stain-lyse-wash” memberikan diskriminasi sinyal terbaik. Sel
pertama-tama diinkubasi dengan MAb yang dititrasi dalam jumlah
yang sesuai, kemudian eritrosit dilisiskan dan sel akhirnya dicuci
sebelum diakuisisi. Beberapa reagen lisis komersial, yang sebagian
besar juga mengandung fiksatif, tersedia. Sampel yang akan diwarnai
untuk sIg harus dicuci bersih sebelum diinkubasi dengan MAb, untuk
menghindari hasil negatif palsu karena adanya serum Igs.
Evaluasi epitop intraseluler, termasuk protein, modifikasi protein
epigenetik (misalnya, fosforilasi protein, metilasi, dll.), DNA, atau RNA
umumnya mengharuskan populasi sel target diperbaiki dan ditembus
untuk memungkinkan antibodi atau pewarna pengikat target untuk
Hematologi Laboratorium
menyeberang membran sitoplasma dan nukleus. Kit fiksasi dan
permeabilisasi komersial, dengan protokol yang direkomendasikan,
tersedia dari beberapa produsen.19,20 Untuk tes yang baru
dikembangkan, berguna untuk memeriksa apakah pewarnaan
intraseluler yang diperoleh dikaitkan dengan lokalisasi yang
diharapkan, menggunakan mikroskop fluoresensi. Spesifisitas antibodi
yang digunakan juga harus dipastikan. Untuk pewarnaan sitoplasma
(cyt.) atau nuklir (n), penting untuk menggunakan konjugat antibodi
yang bebas dari molekul fluorokrom tak terkonjugasi yang dapat
menempel pada protein intraseluler secara nonspesifik. Ketika deteksi
simultan epitop permukaan dan intraseluler diperlukan, pewarnaan
permukaan dilakukan terlebih dahulu, kemudian sel difiksasi dan
permeabilisasi, dan akhirnya epitop intraseluler diwarnai.
Fluorochrome dan panel
Pemilihan panel harus didasarkan pada jenis spesimen dengan
mempertimbangkan informasi yang diberikan oleh riwayat klinis,
indikasi medis, dan morfologi.21 Beberapa pedoman dan makalah
konsensus memberikan daftar antigen yang diusulkan untuk diagnosis
keganasan hematologi telah diterbitkan.21,22 Memilih kombinasi
antibodi mana yang paling baik menggambarkan, membedakan, dan
mengukur perbedaan utama dalam populasi target yang diinginkan
dan jumlah antibodi yang diukur secara bersamaan merupakan
langkah penting untuk uji FCM. Titrasi antibodi pengenceran serial
terhadap target seluler positif dan negatif diperlukan untuk optimasi
antibodi. Pilihan konjugat fluorokrom dapat memengaruhi latar
belakang, spesifisitas, dan rentang pengukuran dinamis. Biasanya,
seseorang akan memilih fluorokrom dengan efisiensi/hasil kuantum
terbaik sebagai konjugat antibodi untuk mengidentifikasi kepadatan
antigen terendah sehingga mendapatkan rasio signal-to-noise sebaik
mungkin. Sangatlah penting untuk membedakan secara andal antara
populasi sel antigen-positif dan antigen-negatif untuk mengukur
populasi sel-sel positif secara akurat. Ini bisa menjadi tantangan dalam
populasi sel yang mengekspresikan antigen dengan lemah. Kontrol
Florescence-minus-one (FMO) memberikan fluoresensi maksimum
yang diharapkan untuk populasi tertentu dalam saluran tertentu ketika
reagen yang digunakan dalam saluran tersebut dihilangkan.23 Kontrol
ini mencakup autofluoresensi sel dan limpahan yang mungkin ada
bahkan setelah koreksi kompensasi dan oleh karena itu kontrol
tersebut paling cocok untuk menentukan batas antara sel positif dan
negatif untuk setiap subset.