KARANTINA TUMBUHAN
GOLONGAN BAKTERI
Oleh
PENDAHULUAN
Jenis-jenis Bakteri
a. Bakteri Heterotrof
Bakteri ini hidup dengan memperoleh makanan berupa zat organik dari
lingkungannya karena tidak dapat menyusun sendiri zat organik yang
dibutuhkannya. Zat organik diperoleh dari sisa-sisa organisme lain. Bakteri yang
mendapatkan zat organik dari sampah, kotoran, bangkai dan juga sisa makanan,
kita sebut sebagai bakteri saprofit. Bakteri ini menguraikan zat organik dalam
makanan menjadi zat anorganik, yaitu CO2, H2O, energi dan mineral. Di dalam
lingkungan bekteri pembusuk ini berfungsi sebagai pengurai dan penyedia nutrisi
1
bagi tumbuhan. Jika Anda memperhatikan lingkungan tempat pembuangan
sampah, sering terlihat adanya makanan yang membusuk. Itu disebabkan oleh
bakteri pembusuk. Sedangkan dalam usus manusia terdapat juga bakteri yang
hidup secara saprofit (menguraikan serat-serat pada makanan) dan
menguntungkan adalah bakteri Escherichia coli. Selain bakteri heterotrof yang
saprofit, ada juga yang bersifat parasit (merugikan) baik pada manusia, hewan
maupun tumbuhan. Bakteri ini menyebabkan sakit (patogen). Beberapa contoh
bakteri yang patogen di antaranya:
b. Bakteri Autotrof
Bakteri Autotrof adalah bakteri yang dapat menyusun zat makanan sendiri dari
zat anorganik yang ada. Dari sumber energi yang digunakannya, bakteri autotrof
(auto = sendiri, trophein = makanan) dibedakan menjadi dua golongan, yaitu:
bakteri fotoautotrof dan bakteri kemoautotrof.
1. Bakteri fotoautrotof
Bakteri fotoautrotof yaitu bakteri yang memanfaatkan cahaya sebagai energi
untuk mengubah zat anorganik menjadi zat organik melalui proses
fotosintesis. Contoh bakteri ini adalah: bakteri hijau, bakteri ungu.
2. Bakteri kemoautrotof
Bakteri kemoautrotof adalah bakteri yang menggunakan energi kimia yang
diperolehnya pada saat terjadi perombakan zat kimia dari molekul yang
kompleks menjadi molekul yang sederhana dengan melepaskan hidrogen.
Contoh bakteri ini adalah: Nitrosomonas. Nitrosomonas dapat memecah NH3
menjadi NH2, air dan energi.
Energi yang diperoleh digunakan untuk menyusun zat organik. Contoh lain
adalah Nitrosococcus dan Nitrobacter. Di samping itu pada tumbuhan kacang-
kacangan antara lain kacang tanah, pada akar tanaman tersebut kita temukan bintil-
bintil. Pada bintil-bintil akar tanaman tersebut merupakan tempat bakteri Rhizobium
berada. Bakteri yang hidup pada bintil-bintil akar tanaman kacang-kacangan ini hidup
bersimbiosis, dan bintil akar tumbuh karena rangsangan dari zat tumbuh yang
dihasilkan oleh bakteri tersebut dan juga dapat menyuburkan tanah. Selain itu ada
pula beberapa jenis bakteri yang mampu memfiksasi N2 (nitrogen bebas dari udara)
di atmosfer ke dalam tanah, yang kemudian N2 ini akan dimanfaatkan oleh
tumbuhan dalam pembentukan protein. Bakteri tersebut antara lain, Azotobacter
vinelandi, Clostriddium pasteurianum dan Rhodospirillium rubrum
1. Bakteri aerob, yaitu bakteri yang menggunakan oksigen bebas dalam proses
respirasinya. Misal: Nitrosococcus, Nitrosomonas dan Nitrobacter.
2. Bakteri anaerob, yaitu bakteri yang tidak menggunakan oksigen bebas dalam
proses respirasinya. Misal: Streptococcus lactis
2
Sedangkan berdasarkan kebutuhan terhadap oksigen, bakteri dikelompokkan lagi
menjadi:
1. Bakteri aerob obligat: yaitu bakteri yang hanya dapat hidup dalam suasana
mengandung oksigen. Misal: Nitrobacter dan Hydrogenomonas.
2. Bakteri anaerob obligat: yaitu bakteri yang hanya dapat hidup dalam suasana
tanpa oksigen. Misal: Clostridium tetani.
3. Bakteri anaerob fakulatif: yaitu bakteri yang dapat hidup dengan atau tanpa
oksigen. Misal: Escherichia coli, Salmonella thypose dan Shigella.
Berdasarkan struktur sel, makhluk hidup secara garis besar dibagi atas 2
golongan yaitu Prokariot dan Eukariot. Berbeda dengan eukariot yang merupakan
makhluk hidup multiselular, prokariot adalah makhluk hidup paling sederhana yang
terdiri dari satu sel. Dengan berkembangnya ilmu pengetahuan dibidang genetika,
makhluk hidup kemudian dibedakan atas 3 golongan besar (domain) berdasarkan
sekuen nukleotida ribosomal RNA (Woese et al), yaitu Bacteria (eubacteria), Eucarya
(eukaryotes) dan Archaea (archaebacteria). Dahulunya archaea dan bacteria berada
dalam kelompok besar prokariota.
3
atau pada air dengan konsentrasi garam yang ekstrim. Archaea tidak ditemukan
menyerang tumbuhan.
Klasifikasi
Klasifikasi adalah meletakkan organisme kedalam kelompok taksonomik
berdasarkan persamaan karakter yang dimiliki. Klasifikasi Bakteri Patogen Tanaman
mengikuti Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, Ninth Edition (1994) :
KINGDOM PROKARIOT
4
Morfologi
A. Bentuk sel
- Umumnya berbentuk batang (rod shape)
- Benang bercabang (filamentous) : Streptomyces
- Seperti spiral (spirillum) : Spiroplasma
- Tidak beraturan (pleomorphic) : Phytoplasma
B. Ukuran Sel
- Sangat kecil dan bervariasi : 1,0 - 5,0 x 0,5 - 1,0 m, diameter 0,6 - 3,5 m
- Diamati dengan mikroskop pada pembesaran maksimum (100 X)
- Detil struktur sel dapat diamati dengan menggunakan mikroskop elektron
Tipikal sel bakteri dan bagian-bagiannya adalah seperti gambar di bawah ini.
3. Bagian eksternal
Kapsul
Flagela
Pili
5
Dinding sel
Dinding sel bakteri sangat tipis dan elastis ,terbentuk dari peptidoglikan yang
merupakan polimer unik yang hanya dimiliki oleh golongan bakteri. Fungsinya
dinding sel adalah- memberi bentuk sel, member perlindungan dari lingkungan luar
dan mengatur pertukaran zat-zat dari dan ke dalam sel
Bakteri Gram positif memiliki dinding sel relatif tebal, terdiri dari berlapis-lapis
polymer peptidoglycan (disebut juga murein). Tebalnya dinding sel menahan
lolosnya komplek crystal violet-iodine ketika dicuci dengan alkohol atau aseton.
Bakteri Gram negatif memiliki dinding sel berupa lapisan tipis peptidoglycan, yang
diselubungi oleh lapisan tipis outer membrane yang terdiri dari lipopolysaccharide
(LPS). Daerah antara peptidoglycan dan lapisan LPS disebut periplasmic space
(hanya ditemui pada Gram negatif) adalah zona berisi cairan atau gel yang
mengandung berbagai enzymes dan nutrient-carrier proteins. Kompleks Crystal
violet-iodine mudah lolos melalui LPS dan lapisan tipis peptidoglycan ketika sel
diperlakukan dengan pelarut. Ketika sel diberi perlakuan pewarna tandingan
Safranin O, pewarna tersebut dapat diserap oleh dinding sel bakteri Gram negatif
.
Protoplasma
Yaitu semua material yang terdapat didalam dinding sel
a. Membran sel : Terdapat dibagian dalam dinding sel, terdiri dari phospholipid
yang tersusun bilayer , dan mengandung berbagai protein yaitu:
Enzym untuk reaksi
Pori untuk proses difusi
Reseptor untuk transpor
Reseptors untuk mengenal, komunikasi, dan penempelan
b. Sitoplasma : Merupakan cairan sel yang terdapat didalam plasma membran.
Terdiri dari 80% air, ribosom, berbagai enzim, koenzim, senyawa organik
(protein, lemak, karbohidrat, dll), senyawa anorganik.
c. Ribosom : organel sel yang berfungsi sebagai pabrik protein
d. Mesosome : Invaginasi dari plasma membran, dalam bentuk vesikel, tubule,
atau lamela
e. Nukleoid : Material genetik bakteri/kromosom bakteri/DNA , berbentuk circular
(melingkar), membawa sifat yg mengatur viabilitas bakteri
f. Plasmid : Material genetik non esensial, ekstra kromosom, berbentuk
melingkar tetapi ukuran lebih kecil dari DNA, membawa sifat-sifat tambahan
ketahanan terhadap antibiotik, ultra violet, patogenisitas, produksi bakteriosin,
dll, tetapi tidak membawa sifat untuk viabilitas sel. Plasmid dapat berpindah
antar bakteri, atau dari bakteri ke sel tanaman inang (contoh pada
Agrobakterium tumefaciens)
6
Bagian eksternal
a. Flagela
Alat untuk bergerak, struktur utamanya adalah protein yang disebut flagellin,
fleksibel, ukuran diameter10-15m, panjang 10-20m
b. Pili/Fimbriae
Merupakan alat untuk menempel pada permukaan (adhesin) substrat. Pili ada
yang khusus digunakan untuk konjugasi, disebut pili sex. DNA bakteri dapat
ditransfer dari satu sel bakteri ke sel bakteri lain selama proses konjugasi.
c. Kapsul/envelope
Merupakan selubung sel bakteri berupa extracellularpolysacharide (EPS).
Berupa kapsul bila melekat erat pada dinding sel atau berupa lendir dengan
struktur longgar Berfungsi sebagai pelindung sel dari kekeringan dan
serangan mikroorganisme lain; alat untuk melekat pada permukaan; berperan
dalam penyerapan ion selektif; dan dalam interaksi inang-patogen
Reproduksi
Reproduksi dengan pembelahan biner (1 sel membelah menjadi 2). Selama proses
pembelahan, material genetik juga menduplikasi diri dan membelah menjadi dua,
dan mendistribusikan dirinya sendiri pada dua sel baru. Bakteri membelah diri dalam
waktu yang sangat singkat.Pada kondisi yang menguntungkan berduplikasi setiap 20
menit.
7
1. Gejala / Symptom
Symptom adalah eksternal dan internal manifestasi dari penyakit pada tanaman.
Bentuk atau pertumbuhan yang abnormal
Kehilangan hasil
menurunnya kualitas hasil atau nilai estetik dari produk tanaman.
Dapat diamati pada bagian tanaman seperti bercak daun, hawar daun, bercak
buah, busuk umbi,kanker batang, layu, kerdil,dll)
Gejala berbeda untuk species pathogen dan tanaman inang yang berbeda.
2. Tanda / Signs
Manifestasi keberadaan patogen pada jaringan tanaman sakit.
Bisa berupa struktur tertentu yang dihasilkan oleh patogen atau hasil interaksi
antara patogen dan tanaman inang.
Sign penting untuk membuktikan gejala yang timbul disebabkan oleh patogen
tanaman dan tidak karena faktor abiotik.
Tanda serangan bakteri patogen tanaman bisa berupa ooze, pustul
Morphologi Koloni
8
Sifat Physiologi dan Biokimia
Karakter morphology bakteri sangat sederhana sehingga sulit dipakai sebagai
alat identifikasi
Perlu dilakukan serangkaian uji terpilih untuk mengetahui ada atau tidak ada
enzym tertentu (uji biokimia dan physiologi)
Prosedur uji biasanya sudah standar dan dipakai secara luas.
Serangkaian uji yang spesifik diperlukan untuk identifikasi spesies atau
subspesies.
Uji yang sangat umum lebih spesifik
Biakan harus murni sebelum melakukan berbagai uji.
Isolasi
Untuk melakukan identifikasi, suatu bakteri harus diisolasi. Media untuk
isolasi atau media yang dipilih dan metode isolasi atau tahapan isolasi ditentukan
berdasarkan bakteri yang dicurigai. Apabila gejala penyakit yang sama disebabkan
oleh bakteri yang berbeda, maka media isolasi untuk kedua bakteri tersebut harus
digunakan.
Isolasi harus dilakukan dari bagian tanaman yang menunjukan gejala awal
penyakit. Untuk kanker dan hawar, isolasi dari batas antara jaringan yang sakit dan
sehat. Isolasi dari bercak harus dilakukan dari area kecil transparan ( water soaked),
bukan dari dari bercak coklat atau nekrotik yang lebih luas. Bakteri sekunder dan
cendawan biasanya terdapat dalam jumlah besar pada gejala lanjut.
Mikroorganisme saprofit tersebut biasanya tumbuh lebih cepat pada media agar dari
pada bakteri patogen, menghambat dan menyulitkan isolasi bakteri patogen yang
menjadi target isolasi.
9
Isolasi dapat juga dilakukan dengan melakukan maserasi jaringan tanaman
sakit. Hasil maserasi digoreskan (streak plate) pada media yang sesuai dengan loop
inokulasi untuk mendapatkan koloni tunggal. Cara lain adalah dengan meletakkan
jaringan sakit pada tabung reaksi mengandung 2 -3 ml air steril, biarkan bakteri
berdifusi pada suhu ruang selama 30 60 menit. Jika bakteri diduga adalah bakteri
layu atau busuk lunak, atau bila terdapat saprofit dalam jumlah besar, sebaiknya
dilakukan plating dengan pengenceran berseri. Pengenceran berseri 1 : 10 terhadap
sap hasil maserasi dibuat dengan menggunakan air steril/buffer saline. Plating 0.1 ml
dengan menyebarkan (spread plate) suspensi bakteri merata pada permukaan agar
yang kering menggunakan L-glass rod. Koloni tunggal yang terpisah lebih mudah
diperoleh dengan cara ini. Media yang sudah diinokulasi diinkubasi terbalik pada
25C paling kurang 72 jam.
Koloni dari patogen biasanya dominan jika isolasi dilakukan dari infeksi awal
dan dari bahan tanaman yang masih segar. Bahan tanaman dengan gejala yang
lanjut dan sampel yang terlalu lama disimpan sering diinvasi oleh cendawan dan
bakteri saprofitik yang tumbuh cepat. Keberadaan saprofit sering meragukan karena
penampilan yang menyerupai patogen. Contohnya Pantoea aglomerans dengan
pigment kuning dan fluorescent saprofitik pseudomonads menyerupai patogenik
xanthomonads dan pseudomonads.
Gerakan berenang yang cepat dan tiba-tiba adalah karakter dari bakteri
dengan polar flagela. Bakteri dengan peritrichous flagela memperlihatkan gerakan
berenang yang lambat diikuti dengan gerakan berguling yang tidak beraturan.
Pewarnaan Gram
Pengujian Gram bakteri biasanya adalah pengujian yang paling awal
dilakukan, karena pengelompokan berdasarkan uji Gram menentukan penggolongan
besar bakteri. Pewarnaan Gram menunjukan perbedaan yang mendasar dalam
organisasi struktur dinding sel bakteri atau amplop sel.
Bakteri Gram positif mempunyai dinding sel relatif tebal, terdiri dari beberapa
lapis polymer peptidoglycan (disebut juga murein). Tebalnya dinding sel menahan
lolosnya komplek crystal violet-iodine ketika dicuci dengan alkohol atau aseton.
11
Mayoritas bakteri patogen tanaman adalah Gram-negatif, aerobik, berbentuk
batang atau Gram negatif, anaerobik fakultatif, berbentuk batang. Sebagian besar
bakteri Gram positif tergolong Actinomycetes yang digolongkan kepada kelompok
Coryneform dan Actinomycetales. Hanya sedikit bakteri tanpa dinding sel yang
bersifat patogenik pada tanaman.
Reaksi Gram, bentuk sel dan ukuran sel menentukan kriteria identifikasi
selanjutnya untuk menentukan apakah bakteri kemungkinan patogen tanaman atau
tidak. Gunakan biakan yang masih muda (24 jam) untuk pewarnaan Gram. Bakteri
Gram Positif akan berwarna ungu gelap sedangkan bakteri gram negatif akan
berwarna merah.
12
CATATAN:
- Bakteri gram positif corynoform dan bakteri gram negatif patogen tanaman
berbentuk batang
- Sterptomyces mempunyai pertumbuhan seperti miselium
- Bakteri Gram negatif dan Gram positif berbentuk kokus (cocci) dan bakteri
berbentuk batang menghasilkan spora bukan bakteri pathogen tanaman.
- Sel bakteri corynoform umumnya lebih kecil dari bakteri Gram positif lainnya
(< 0.8 l dengan konfigurasi yang unik (berbentuk L dan Y).
13
Introduction to Practical Phytobacteriology (Goszczynska et al, 2000); Laboratory
Guide for Identification of Plant Pathogenic Bakteria (Schaad et all. 2001), dll.
Bakteri patogen tanaman penting antara lain dari genus Erwinia, Pantoea,
Acidovorax, Pseudomonas, Ralstonia, Burkholderia, Xanthomonas, Xylella,
Agrobacterium, Clavibacter, Clostridium, Bacillus, dan Streptomyces. Beberapa uji
sederhana untuk membedakan genus bakteri patogen tumbuhan seperti pada Tabel
di bawah ini. Untuk pengujian sampai tingkat spesies diperlukan pengujian yang
lebih mendalam terhadap sifat biokimia dari bakteri uji.
14
Postulat Koch
Reaksi Hipersensitif
Kemampuan bakteri menyebabkan penyakit (pathogenicity) bisa diketahui
dengan menginduksi penyakit pada tanaman inang (dengan menginfiltrasi bakteri
kedalam tanaman inang) atau dengan reaksi hypersensitif (dengan infiltrasi bakteri
pada tanaman bukan inang). Bila suatu bakteri patogen diinfiltrasi pada area
terbatas pada daun tanaman maka akan terjadi 3 tipe raksi tergantung kepada jenis
spesies atau patovar bakteri, yaitu :
1. Reaksi hypersensitif : terjadi kematian sel tanaman yang cepat, tanpa terjadi
penyebaran bakteri ke jaringan sekitarnya.
2. Reaksi penyakit : respon inang lambat terhadap infiltrasi bakteri, sehingga
bakteri menyebar pada bagian lain dari tanaman. Tanaman menjadi layu
bahkan mati.
3. Tidak ada reaksi
Reaksi hipersensitif tidak terjadi dengan bakteri non-phytopatogenik.
Kemampuan bakteri tanaman menghasilkan HR pada tanaman non-inang,dapat
digunakan sebagai uji patogenisitas dari isolat bakteri patogen. HR dapat digunakan
untuk hampir semua bakteri patogen tanaman termasuk yang menyebabkan
penyakit nekrotik, layu, dan beberapa bakteri penyebab busuk lunak. HR biasanya
tidak terjadi dengan bakteri erwinia busuk lunak, kelompok agrobacteria dan
Pseudomonas savastanoi subsp. savastanoi dan patogen oportunistik seperti
Pseudomonas marginalis.
15
Reaksi hypersensitif adalah respon resistensi tanaman untuk melokalisasi
bakteri sehingga tanaman dapat mengatasi serangan berbagai jenis bakteri yang
berpotensi menyebabkan penyakit.
16
Deteksi dan Identifikasi Bakteri Patogen Tanaman dengan Cara Cepat
Teknik pengujian yang dapat menjadi alternatif antara lain pengujian dengan
teknik serologi dan PCR dimana bakteri tidak perlu diisolasi dari sampel tanaman,
sehingga sangat menghemat waktu pengujian. Uji serologi dengan teknik ELISA
sangat populer untuk deteksi bakteri yang menyerang tanaman/bagian tanaman,
dimana pengujian dalam dilakukan untuk jumlah sampel yang besar. Pengujian
ELISA dan uji serologi lainnya adalah berdasarkan reaksi antara antibody dan
antigen. Sedangkan pengujian dengan teknik PCR adalah berdasarkan amplifikasi
DNA patogen secara invitro dengan menggunakan primer yang spesifik.
Analisa asam lemak dinding sel bakteri/fame (fatty accid methyl ester) dengan
menggunakan peralatan GC (gas chromatography), merupakan salah satu cara
cepat untuk identifikasi bakteri yang telah berupa isolat murni. Pola fatty acid yang
dihasilkan dengan software yang tersedia secara otomatis dibandingkan dengan
database. Sherlock MIDI System, salah satu produk alat identifikasi cepat asam
lemak bakteri, mampu mendeteksi sampel mikroorganisme dari jenis bakteri, yeast,
dan cendawan, memiliki 2000 database berdasarkan pola chromatography
mikroorganisme.
17
PENGENALAN GEJALA PENYAKIT TANAMAN
YANG DISEBABKAN OLEH BAKTERI
1. Kematian cepat sel-sel jaringan tanaman yang diinvasi oleh bakteri patogen
yang menimbulkan terakumulasinya pigmen gelap, seperti hasil oxidasi
polyphenols dan melanin seringkali berasosiasi dengan khlorosis disekitar
jaringan.
Contoh : bercak nekrotik (spot), hawar (blight), dan canker
Bakteri penyebab : kelompok xanthomonads dan pseudomonads
Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, penyebab leaf spot pada
tomat dan cabe
Pseudomonas syringae pv. tabaci, penyebab angular leaf spot dan
wildfire pada tembakau
Xanthomonas axonopodis penyebab pustul pada kedelai
Xanthomonas oryzae pv oryzae penyebab Bacterial Leaf Blight pada
padi
Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae, hawar pada anthurium
Xanthomons campestris, hawar pada ketela pohon
Xanthomonas axonopodis pv citri pada jeruk (citrus canker)
2. Invasi yang progresif jaringan vaskular yang diikuti oleh nekrosis jaringan yang
berdekatan yang bisa menyebabkan layunya tanaman inang.
Contoh : layu pembuluh, menguning
Bakteri penyebab : Clavibacter michiganensis (subsp. michiganensis, subsp.
insidiosum, subsp. sepedonicus ), Pantoea stewartii, Erwinia tracheiphila,
Ralstonia solanacearum, dan Xylela fastidiosa
3. Hancurnya jaringan tanaman karena hancurnya sel, yang dikenal sebagai gejala
busuk lunak (soft-rot).
Contoh : busuk lunak
Bakteri penyebab : Xanthomonas campestris pv. campestris, Erwinia carotovora
(subsp. atroseptica, subsp. caratovora), Erwinia chrysanthemi, Clavibacter
michiganensis subsp. sepedonicum.
18
Busuk Lunak pada kentang disebabkan oleh
Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Cabi, 2005)
Gejala puru pada pangkal batang mawar dan mossy gall pada bunga oleh Rhizobium
radiobacter (Nigel Cattlin/Holt Studios International dan Larry W. Moore, Cabi 2005)
Iustrasi gambar berikut adalah jenis gejala yang ditimbulkan oleh kelompok genus
bakteri penting patogen tanaman.
19
Tabel berikut dapat menjadi kunci diagnosis bakteri penyebab penyakit tanaman
berdasarkan gejala khas pada tanaman inang.
20
Bakteri yang menguntungkan adalah sebagai berikut :
3. Berperan dalam siklus nitrogen sebagai bakteri pengikat nitrogen yaitu Rhizobium
leguminosarum yang hidup bersimbiosis dengan akar tanaman kacang-kacangan
dan Azotobacter chlorococcum.
Nitritasi : oksidasi amonia (NH3) menjadi nitrit (NO2-) oleh bakteri nitrit. Proses
ini dilakukan oleh kelompok bakteri Nitrosomonas dan Nitrosococcus.
Nitratasi : oksidasi senyawa nitrit menjadi nitrat (NO3-) oleh bakteri nitrat.
Proses ini dilakukan oleh kelompok bakteri Nitrobacter
21
Mycobacterium tuberculosis penyebab penyakit TBC
Vibrio cholerae penyebab kolera atau muntaber
Clostridium tetani penyebab penyakit tetanus
Mycobacterium leprae penyebab penyakit lepra
22
DAFTAR PUSTAKA
Lelliott RA and Stead DE, 1987. Methods for Diagnosis of Bacterial Diseases of
Plants. Blackwell Scientific Publications, Oxford.
Schaad NW, Jones JB and Chun W. 2001. Laboratory Guide for Identification
of Plant Pathogenic Bacteria. APS Press, St. Paul, Minessota.
Sigee, DC. 1993. Bacterial Plant Pathology : Cell and Molecular Aspects.
Cambridge University Press, Cambridge.
23
24