vPerbandingan afinitas logam bergerak kromatografi Ni-NTA dan rekan

TALON untuk pemurnian rekombinan manusia eritropoietin

Yana Rubiyana1 *, Adi Santoso1, dan Irmanida Batubara2

1. protein berbasis Terapeutik dan vaksin laboratorium, Pusat Penelitian bioteknologi, lembaga
Indonesia Sains (LIPI), Bogor 16911, Indonesia
2. departemen kimia, Fakultas Matematika dan ilmu pengetahuan alam, Institut Pertanian Bogor,
Bogor 16680, Indonesia

* E-mail: yana.rubiyana@lipi.go.id

Abstrak

Pemurnian rekombinan protein adalah tahap penting dalam biofarmasi penelitian. Sebuah teknik yang umum
digunakan adalah kromatografi afinitas logam bergerak (IMAC). Salah satu keuntungan utama dari jenis
kromatografi adalah bahwa kolom dapat dengan mudah diregenerasi untuk pemurnian berikutnya bekerja.
Mekanisme IMAC didasarkan pada ikatan antara ion logam yang bergerak pada matriks dengan asam amino
tertentu. Karena interaksi kuat dari kelompok donor elektron pada cincin imidazol, histidine sering digunakan dalam
sistem pemurnian IMAC. Dua jenis komersial resin IMAC menggunakan nitrilotriacetic asam (NTA) matriks:
berbasis nikel (Ni NTA) dan berbasis kobalt (Co-NTA), lebih dikenal sebagai TALON. Studi ini adalah tujuan untuk
menyelidiki efek dari ion logam Ni2 + dan Co2 + untuk memurnikan manusia eritropoietin rekombinan (rhEPO)
dinyatakan dalam sistem ragi Pichia pastoris. Hasilnya mengindikasikan bahwa Ni-NTA maupun rekan TALON
memberikan hampir sama tingkat kemurnian protein; Namun, Ni-NTA memiliki afinitas mengikat yang lebih tinggi
daripada rekan TALON mungkin karena stabilitas tinggi kompleks Ni+. Rata-rata jumlah protein yang terikat oleh
Ni-NTA dan rekan TALON adalah 183.5 dan 38.7 g/mL, masing-masing.

Abstrak

Perbandingan bergerak logam afinitas kromatografi Ni-NTA dan rekan TALON untuk Pemurnian
Rekombinan eritropoietin Manusia. Teknik pemurnian rekombinan protein likuid tahap yang sangat penting
dalam riset biofarmasetik. Teknik yang umum ini digunakan dalan adalah kromatografi afinitas logam terimobilisasi
(IMAC). Salah satu kelebihan dari kromatografi jenis ini adalah kolom dapat dengan mudah diregenerasi untuk ini
digunakan dalan pada proses purifikasi berikutnya. Mekanisme purifikasi IMAC berdasarkan pada ikatan yang
sangat spesifik antara ion logam yang terimobilisasi pada matriks dengan asam amino titik akupunktur tertentu.
Karena interaksinya yang kuat sebagai kelompok donor elektron pada cincin imidazol, maka asam amino histidin
sering ini digunakan dalan pada sistem purifikasi IMAC. Terdapat 2 jenis resin IMAC komersial yang menggunakan
matriks nitriloasetat asam (NTA), berlaku resin IMAC berbasis-nikel (Ni-NTA) dan berbasis-kobalt (Co-NTA) atau
lebih dikenal dengan TALON. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh penggunaan ion logam Ni 2 + dan
Co2 + dalam memurnikan protein rekombinan erithropoietin manusia (rhEPO) yang diekspesikan dalam sistem ragi
Pichia pastoris. Hasil penelitian menunjukkan bahwa baik Ni-
NTA maupun rekan TALON mempunyai tingkat kemurnian yang hampir sama, namun Ni-NTA mempunyai afinitas
pengikatan yang lebih tinggi dibandingkan dengan rekan TALON kemungkinan disebabkan oleh kestabilan komplek
logam Ni yang lebih tinggi. Jumlah rata-rata protein yang diikat oleh Ni-NTA dan rekan TALON masing-masing
sebesar 183.5 g/mL dan 38.7 g/mL.

Kata kunci: TALON Co, IMAC, Ni-NTA, pemurnian, rhEPO

Pengenalan

Penelitian pada manusia eritropoietin (hEPO) telah meningkat sebagai peneliti berusaha memperoleh agen
terapeutik. Teknik ekspresi kloning dan gen telah mengembangkan

137
hEPO ke rekombinan manusia eritropoietin (rhEPO) sebagai obat. Sejak 1980, rhEPO telah komoditas utama di
industri bioteknologi; penjualan telah meningkat dari tahun ke tahun sampai mereka mencapai miliaran dolar [1 - 2].
rhEPO telah digunakan untuk perawatan klinis pasien dengan anemia akibat kanker, infeksi human
immunodeficiency virus infeksi (HIV), gagal ginjal, dan transplantasi sumsum tulang [3].

Pusat Penelitian bioteknologi, lembaga Indonesia ilmu (LIPI) dinyatakan rekombinan -hEPO dalam sistem ekspresi
ragi (Pichia pastoris) dan menunjukkan dengan teknik blotting Barat bahwa supernatant berisi rhEPO. Tahap
selanjutnya, sesuai pemurnian teknik yang diperlukan untuk mendapatkan protein murni. Teknik pemurnian yang
memanfaatkan spesifik interaksi antara protein dan ligan (ion logam) telah dikembangkan. Teknik ini dikenal
sebagai bergerak logam afinitas kromatografi (IMAC) [4-5]. Tergantung pada interaksi tertentu, IMAC dapat
digunakan untuk memurnikan protein sampai 95% kemurnian [6].

IMAC menggunakan spesifik interaksi antara sisi rantai asam amino dengan batas Lewis ion logam (seperti Cu 2 +,
Co2 +, Ni2 +dan Zn2 +) [7-11]. Ion-ion logam yang bergerak melalui chelating agen melampirkan dukungan stasioner.
Agen chelating yang paling banyak digunakan untuk aplikasi ini adalah iminodiacetic asam (IDA) dan
nitrilotriacetic asam (NTA) [12]. Target protein adalah "tagged" dengan hexahistidine (6xHis); dengan demikian,
ada spesifik mengikat antara protein rekombinan dengan ligan IMAC. Mengingat pengikatan tertentu, target protein
untuk memurnikan dapat dipisahkan dari protein lain [4,8]. Dua jenis komersial resin IMAC menggunakan NTA
matriks sebagai agen chelating, berbasis nikel (NiNTA) dan berbasis kobalt (Co-NTA) IMAC resin. Yang terakhir
dikenal sebagai TALON. Dalam studi ini, afinitas ion logam Ni2 + dan Co2 + dibandingkan untuk menemukan teknik
IMAC yang cocok untuk memurnikan rhEPO protein.

Bahan dan metode

Pilihan dari jamur transformant. Escherichia coli DH5 Alfa (Invitrogen, San Diego, CA) digunakan sebagai tuan
rumah untuk rekombinan plasmid kloning [7] percobaan dan tumbuh di media LB (tryptone 1%, 0,5% NaCl dan
0,5% ekstrak ragi, ditambah 2% agar di piring). Zeocin telah ditambahkan pada standar konsentrasi untuk screen
bakteri dan pemilihan ragi transformant, P. pastoris ketegangan X-33 (Invitrogen). Ragi dikultur dalam jamur
peptone dekstrosa (YPD) medium (ekstrak ragi 1%, peptone 2% dan 2% dekstrosa, ditambah 2% agar di piring).
Komposisi media untuk ekspresi studi adalah buffered gliserol kompleks menengah (BMGY) (1% ragi ekstrak,
peptone 2%, 1,34% YNB, 4 10-5%biotin, 1% gliserol dan 0.1 M k-fosfat, pH = 6.0) dan media kompleks buffered
metanol (BMMY) (BMGY medium yang mengandung 0,5% metanol bukan gliserol). Budaya ragi yang ditanam
pada 30 C. Memproduksi sel ketegangan dipilih berdasarkan tingkat ekspresi. Beberapa klon diputar untuk tingkat
ekspresi protein EPO dengan Barat blotting menggunakan antibodi poliklonal anti-EPO. Clone mengekspresikan
tertinggi dipilih untuk studi berikutnya.

Eritropoietin manusia rekombinan (rhEPO) produksi. Transformant P. pastoris yang mengandung gen hEPO
tumbuh pada media YPD (1% Bacto ragi, 2% Bacto peptone, 2% glukosa 20% dan 2% Bacto agar-agar) pada 30 C
selama 2 hari sampai klon muncul. Klon diputar dengan menggunakan antibodi poliklonal anti manusia-EPO
analisis blot Barat. Klon highestexpressing dipilih untuk studi. Satu koloni tumbuh di media BMGY (1% ragi,
peptone 2%, kalium fosfat 100 mM, ragi 1,34% nitrogen dasar, biotin 0.00004%, dan 1% gliserol) pada 30 C
selama 1 hari (24 h). Pertumbuhan sel kemudian dilanjutkan di konsentrasi optik kepadatan (OD) 1 dalam medium
BMMY (medium BMGY dengan 1% gliserol digantikan dengan metanol 0,5%) pada 30 C selama 2 hari. Setelah 2
hari, kultur sel disentrifugasi untuk 10 min di 2.300 g . Supernatant kemudian dianalisis dengan teknik blot Barat
[14].

Ni2 +- NTA Co2 +-TALON IMAC pemurnian. 200 mL supernatant dihasilkan dari budaya yang sama. Kemudian
10 mL supernatant dicampur dengan IMAC resin (Ni-NTA/rekan-TALON), yang telah equilibrated dengan pH
buffer fosfat 7,4 (20 mM natrium fosfat dan 500 mM NaCl) dan kemudian terguncang dengan shaker (150 rpm)
untuk 60 menit. Campuran disisipkan ke dalam kolom kosong, dan kemudian ditampung Filtrat sampel (aliran-
melalui). Kolom dicuci dengan 10 mL mencuci penyangga (20 mM natrium fosfat dan 500 mM NaCl) 1 kali. Maka
kolom eluted dengan elution buffer yang berisi 20 mM natrium fosfat, 500 mM NaCl dan imidazol 500 mM. Hasil
elution fractionated (setiap 1 mL) dan disimpan dalam tabung polypropylene 1.5 mL [15]. Proses ini adalah empat
ulang kali. Selanjutnya, solusi sebagian kecil dianalisis dengan Barat blotting dan diukur dengan menggunakan
spectrophotometer.

SDS-HALAMAN dan Barat menghapus analisis. Untuk mengkonfirmasi hasil pemurnian protein, protein
dianalisis dengan natrium lauryl sulfat Elektroforesis polyacrylamide gel (SDS-HALAMAN) dengan gel
mengandung 12% Akrilamida pisah. Barat blot analisis ini dilakukan untuk mendeteksi setiap fraksi protein setelah
pemurnian di IMAC. Setelah SDS-HALAMAN, protein dalam gel dipindahkan ke Hybond nitrocellulose membran
(GE Healthcare) dengan menggunakan electroblotting. Immunodetection dicapai dengan menggunakan antibodi
anti-hEPO (Calbiochem) sebagai yang utama antibodi dan anti-kelinci IgG peroksidase konjugat (Bio-Rad) sebagai
antibodi sekunder. Band divisualisasikan dengan nitro-biru tetrazolium klorida (Netbios) dan 5-bromo-4-chloro-3'-
indolyphosphate p-toluidine garam (BCIP) pewarnaan reaksi, maka kepadatan band rhEPO dihitung berdasarkan
area di bawah kurva (AUC) ditentukan dengan software ImageJ (http://imagej.en.softonic.com).
Perbandingan afinitas logam bergerak kromatografi 139
Analisis protein total oleh bicinchoninic asam (BCA) protein assay kit. Serangkaian standar solusi dari sapi
albumin serum (BSA) dengan konsentrasi 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500, dan 2000 g/mL disiapkan. Solusi
kerja yang disiapkan oleh pencampuran 50 mL larutan A (natrium karbonat, natrium bikarbonat dan natrium tartrat
bicinchoninic asam di 0.1 M natrium hidroksida) dengan solusi B yang mengandung 4% Cu-sulfat. Total 0, 1 mL
sampel standar, kosong pipetted ke dalam sebuah tabung uji yang bersih, dan kemudian 2 mL larutan kerja
ditambahkan ke setiap tabung dan terguncang lembut sampai tercampur dengan baik. Campuran diinkubasi dalam
penangas air dengan suhu 37 C selama 30 menit. Setelah solusi yang telah didinginkan hingga temperatur kamar,
solusi segera diukur menggunakan UV-visible spectrophotometer pada panjang gelombang dari 562 nm [16].

Hasil dan diskusi

Identifikasi klon tertinggi mengekspresikan. Ekspresi dan pemurnian berikutnya rekombinan protein yang banyak
dilakukan dalam studi molekuler dan biokimia. Metode pemurnian kuat yang melibatkan penggunaan peptida
afinitas tag, yang menyatu untuk protein yang menarik dan digunakan untuk mempercepat protein pemurnian
melalui afinitas kromatografi, secara luas diterapkan. Digunakan berdasarkan Ni IMAC komersial resin (Ni-NTA)
dan berbasis kobalt IMAC resin (Co-NTA) dibandingkan dan dianalisis. Dalam percobaan saat ini, pemurnian
rhEPO, yang telah menyatu dengan enam residu asam amino histidine di karboksi terminal, dipelajari.

Tingkat ekspresi rhEPO protein ditunjukkan dalam gambar 1. Dalam setiap lane, sebuah band ukuran yang sama
sebagai rhEPO standar, yang merupakan kDa sekitar 37, dapat diamati. Hasil ini menunjukkan bahwa protein rhEPO
yang terkandung dalam supernatant. Hasil di jalur 3 menunjukkan sejumlah besar rhEPO di klon 18. Clone
mengungkapkan tertinggi (clone nomor 18) dipilih untuk studi.

Kuantifikasi protein rhEPO. Clone 18 kemudian dinyatakan untuk analisa lebih lanjut. Untuk ide yang lebih baik
tentang bagaimana efektif penggunaan Ni-NTA TALON Co bahan resin untuk memurnikan protein, studi ekspresi
yang menggunakan nomor klon 18 diulang empat kali dari supernatant yang sama. Protein dinyatakan dan
dimurnikan kemudian dianalisis dengan blotting Barat. Hasilnya ditunjukkan pada gambar 2. Eluates protein yang
menggunakan Ni-NTA yang ditampilkan di jalur 2, 3, 4 dan 5. Eluates protein yang menggunakan resin Co TALON
berada di jalur 6, 7, 8, dan 9. Kepadatan rhEPO band dianalisis berdasarkan AUC ditentukan dengan ImageJ;
Hasilnya ditunjukkan dalam tabel 1 dan gambar 3. Analisis ini jelas menunjukkan bahwa rapatan band rhEPO
dimurnikan menggunakan Ni-NTA adalah lebih tinggi dari rekan TALON, menunjukkan bahwa lebih banyak
protein rhEPO dapat ditangkap dengan Ni-NTA daripada dengan rekan TALON.
Untuk mengukur berapa banyak protein rhEPO adalah dimurnikan menggunakan dua jenis resin, jumlah protein
eluates diperkirakan menggunakan BCA protein assay. Assay menunjukkan rata-rata jumlah protein yang
dimurnikan menggunakan Ni-NTA adalah 183.5 g/mL, sementara itu TALON rekan 38.7 g/mL (Tabel 2).
Beberapa variasi kecil yang diamati dalam replications empat; Namun, secara keseluruhan,
data ini jelas berhubungan dengan orang-orang yang ditunjukkan pada gambar 2

Gambar 1. Analisis menghapus Western rhEPO. Lane 1: Standar rhEPO, baris 2: Protein Marker, baris 3, 4, dan
5: klon supernatant rhEPO 18, 11, dan 9

Gambar 2. RhEPO Western Blot analisis dari dimurnikan. Lane

1: protein Marker, jalur 2 5: Ni-NTA Eluate
Pecahan, jalur 6 9: TALON Co Eluate pecahan

Tabel 1. Area di bawah kurva (ImageJ) dari rhEPO band Ni-NTA dan rekan TALON

Ni-NTA TALON Co
1 36533.40 6299.229
2 36717.61 10637.96
3 35299.56 6916.995
4 21125.56 10348.61
 Rata-rata 32419.03 8550.69 Area di bawah kurva (AUC) pengulangan

Gambar 3. AUC rata-rata rhEPO band untuk Ni-NTA dan rekan TALON

Tabel 2. Total Protein Eluate yang disucikan dengan Ni-NTA dan rekan TALON

Konsentrasi (g/mL)
Ni-NTA TALON Co Pengulangan
1 275.6 kenaikan
sebesar
63,7
2 145.2 41,4
3 206.7 25,4
4 106.4 24.4
Rata-rata 183.5 38.7

Gambar 4. Perak pewarnaan analisis murni rhEPO. Jalur 1 4: eluate Ni-NTA, jalur 5-7: Eluate
TALON Co

yang menunjukkan resin Ni-NTA terikat rhEPO protein lebih tinggi daripada rekan TALON. Perbedaan ligan bidang
stabilisasi energi (LSFE) dipengaruhi stabilitas geometri logam kompleks [17]. Nilai relatif LFSE Ni + lebih tinggi
daripada LFSE Co+, menyebabkan kompleks Ni lebih stabil. Oleh karena itu, NiNTA resin dapat menangkap lebih
banyak protein.

Kemurnian protein dinyatakan rhEPO. Untuk mengevaluasi rhEPO protein setelah itu adalah murni
menggunakan Ni-NTA dan TALON Co, eluates dianalisis menggunakan SDSPAGE dan patri menggunakan Silver
staining (Fermentas). Hasil (gambar 4) menunjukkan bahwa rhEPO protein dengan jelas diamati ukuran, sekitar 37
kDa. Jumlah rhEPO yang disucikan ketika Ni-NTA digunakan adalah jauh lebih tinggi daripada ketika rekan
TALON digunakan. Data ini berkorelasi dengan data yang ditampilkan di angka 2 dan 3 dan tabel 1 dan 2, di mana
Ni-NTA resin lebih efisien TALON bahwa rekan, menunjukkan bahwa resin Ni-NTA memiliki kapasitas mengikat
lebih daripada CoTALON.

Dengan munculnya rekayasa genetika, telah menjadi mudah untuk merancang protein yang memiliki struktur untuk
prosedur disederhanakan pemurnian. Salah satu cara yang paling populer untuk dilakukan adalah dengan
menambahkan histidines 6-10 pada ujung N protein [18-20]. Protein kemudian disucikan oleh kemampuannya untuk
mengikat erat ke kolom yang berisi chelated Ni2 + atau Co2 + yang dapat dicuci dan kemudian eluted dengan gratis
imidazol atau menurunkan pH 5.9, mana histidine menjadi sepenuhnya protonated dan tidak mengikat logam
chelated.

Namun, meskipun IMAC teknologi sangat menjanjikan dan unggul untuk afinitas kromatografi, tingkat kemurnian
protein yang diperoleh (gambar 4) ini tidak mutlak. Protein kotoran masih dapat dikenali dalam perak bernoda gel.
Kotoran ini mungkin berasal dari media atau protein sel inang yang mengandung histidine residu. Selanjutnya,
protein ini dapat mengikat IMAC resin.

Meskipun histidine jarang terjadi (2% dari semua residu protein yang histidine), beberapa protein selular mungkin
berisi residu berdekatan histidine dua atau lebih. Protein ini memiliki afinitas untuk matriks IMAC dan mungkin
coelute dengan protein menarik, mengakibatkan kontaminasi yang signifikan dari produk akhir. Jenis ini kenajisan
Masalahnya lebih umum dalam sel-sel eukariotik daripada dalam sel-sel prokariotik. Hal ini karena sel-sel mamalia
memiliki kelimpahan alam yang lebih tinggi protein yang mengandung residu histidine berturut-turut. Selain adanya
alam histidine berturut-turut residu, pembentukan ikatan disulfida antara protein yang menarik dan protein lain juga
dapat mengakibatkan kontaminasi [8, 21]. Dengan demikian, meskipun IMAC adalah metode serbaguna yang dapat
mengakibatkan 100-fold enrichments dalam langkah satu pemurnian [22] dan dapat mencapai hingga 95%
kemurnian, kemungkinan kotoran itu tetap ada, terutama jika protein menarik eukariotik berasal.

Morganti et al. (2002) melaporkan bahwa ligan aromatik nitrogencontaining (misalnya, histidine dan triptofan)
dianggap batas Lewis basis. Ion-ion logam pada batas asam keras-lembut seperti Co, Zn, Cu, dan Ni dapat
berkoordinasi dengan atom nitrogen aromatik (perbatasan base) dan atom belerang (base lembut) [9]. Oleh karena
itu, Ni dan Co dapat mengikat dalam koordinasi dengan protein lain dari media atau host sel-sel yang juga memiliki
histidine atau triptofan residu. Namun, Ni afinitas lebih besar dari Co Penambahan Ni rhEPO mengikat protein juga
dapat mengikat untuk protein lain lebih.
Perbandingan afinitas logam bergerak kromatografi 141
Hal ini membuat protein total menghasilkan pemurnian dengan NiNTA yang lebih besar dengan rekan TALON.

Pemurnian protein sangat sangat menantang, terutama ketika seseorang menganggap campuran makromolekul hadir
dalam ekstrak sel. Dalam studi ini, keuntungan dari afinitas kromatografi, khususnya penggunaan nya tag sistem,
dijelaskan. Namun, kehadiran kotoran dengan jelas menunjukkan bahwa kombinasi dari beberapa teknik
kromatografi lain yang diperlukan untuk pemurnian efektif dan hasil yang dapat diterima.

Kesimpulan

Kedua IMAC resin dapat memurnikan protein cukup, meskipun tidak sepenuhnya. Oleh karena itu, studi pemurnian
tambahan diperlukan. Ni-NTA resin dapat menangkap lebih banyak protein rhEPO daripada resin TALON Co.
Dalam penelitian ini, rata-rata total protein adalah g/mL 183.5 dengan Ni-NTA dan 38.7 g/mL dengan rekan
TALON. Dalam pengalaman kami, protein yang dihasilkan dari pemurnian ini prosedur cukup memadai untuk
analisis secara in vitro. Dengan kombinasi dari ukuran pengecualian kromatografi kami menemukan bahwa protein
murni bahkan cocok untuk analisis biologis percobaan.

Referensi

[1] Sorisio, E., Strom, S. 2004. Inovasi dan pasar yang dinamis di pasar EPO. Program penelitian kesehatan
ekonomi. Universitas Oslo. Norwegia. PP.1-30.
[2] Sytkowsky, AJ 2004. Eritropoietin: darah, otak, dan seterusnya. Wiley-VCH Verlag. Weinheim. p.12.
[3] Park, J.H., Kim, C., Kim, W.B., Kim, Y.K., Lee, S.Y., Yang, J.M. 2000. Efisiensi promotor dan sel baris dalam
ekspresi tingkat tinggi eritropoietin. Biotechnol. Biochem appl. 32 (3): 162-172, doi: 10.1042/BA20000057.
[4] Charlton, A., Zachariou, M. 2008. Bergerak kromatografi afinitas ion logam dari histidinetagged fusion
proteinsin. Di M. Zachariou (Eds.), afinitas kromatografi: Metode dan protokol, 2nd ed. Humana Press.
Totowa. Ms. 137-140.
[5] Zatloukalova, E., Kucerova, Z. 2004. Pemisahan kobalt mengikat protein oleh kromatografi afinitas logam
bergerak. J. Chromatogr. B. 808(1): 99-103, doi:10.1016/j.jchromb.2004.03.066.
[6] Janknecht, R., de Martynoff, G., Lou, J., Hipskind, R.A., Nordheim, A. Stunnenberg, Hg 1991. Cepat dan efisien
pemurnian asli histidinetagged protein dinyatakan oleh vaccinia rekombinan virus. Sci. Acad. Natl. proc 88
(20): 8972-8976.
[7] Herawati Santoso, A., N., Rubiyana, Y. 2012. Pengaruh metanol induksi dan inkubasi waktu pada ekspresi
manusia eritropoietin di methylotropic jamur Pichia pastoris. Jurnal Makara Teknologi. 16 (1): 29-34
[8] Porekar, V., Menart, V. 2001. Perspektif kromatografi afinitas bergerak-logam. J. Biochem. Biophys. Shabu-
shabu. 49(1-3):335-360, doi:10.1016 / S0165-022 X (01) 00207-X.
[9] Ueda, E.K.M., asam urat, Tithes, Morganti, L. 2002. Sekarang ada dan calon aplikasi mengikat logam
ionprotein. J. Chromatogr. A. 988 (1): 1-23, doi:10.1016 / S0021-9673 (02) 02057-5.
[10] Sidenius, U., Farver, O., Jons, O. Gammelgaard, B. 1999. Perbandingan ion logam transisi yang berbeda untuk
bergerak logam afinitas kromatografi selenoprotein P dari plasma manusia. J. Chromatogr. B 735 (1): 85-91,
doi:10.1016 / S03784347 (99) 00401-6.
[11] Hefti, M.H., van der Toorn, C.J., Dixon, R. Vervoort, J. 2001. Metode pemurnian novel untuk histidine-tagged
protein yang mengandung lokasi pembelahan trombin. Anal. Biochem. 295 (2): 180-185,
doi:10.1006/abio.2001.5214.
[12] Zhao, Y.J., Sulkowski, E., Porath, J. 1991. Topografi permukaan histidine residu dalam lysozymes. EUR. J.
Biochem. 202 (3): 1115-1119, doi:10.1111/j.14321033.1991.tb16478.x.
[13] Pearson, RG 1968. Hard dan soft asam dan basa, HSAB, Bagian II: teori yang mendasari. J. Chem. komedi 45
(10): 643-648, doi:10.1021 / ed045p643.
[14] Invitrogen. 2001. mudah pilih pichia ekspresi kit: manual metode untuk ekspresi rekombinan protein,
menggunakan pPICZ dan pPICZ dalam Pichia pastoris. Carlsbad. California. p.95.
[15] G.E kesehatan. 2011. instruksi Batch/columnPurification. Tersedia dari: http://gelifesciences.
com/aptrix/upp00919.NSF/Content/F9FC9706568 B DD2C1257628001D20A0/$file/28401039AC.pdf.
[16] Pierce. 2011. instruksi BCA protein assay. Tersedia dari: http://abhayjere.com/Documents/ BCA.pdf.
[17] Bayoumi, H.A., Alaghaz, PT Damarus, Aljahdali, M. 2013. Kompleks Cu(II), Ni(II), Co(II) dan Cr(III) dengan
N2O2-chelating schiff di dasar ligan menggabungkan azo dan gugus sulfonamide: spektroskopi, elektrokimia
perilaku dan studi dekomposisi termal. Int. J. Electrochem. 8:9399-9413.
[18] Hochuli, E., Bannwart, W., Dobeli, H., Gentz, R. Stuber, D. 1988. Genetik pendekatan untuk memfasilitasi
pemurnian rekombinan protein dengan novel Adsorben khelat logam. Biotechnol alam. 6 (1): 1321-1325,
doi:10.1038 / nbt1188-1321.
[19] Ford, CF, Suominen, I., Glatz, C.E. 1991. Fusi ekor untuk pemulihan dan pemurnian rekombinan protein.
Protein Expr. Purif. 2(2-3):95-107.
[20] Porath, J. 1992. Bergerak Ion logam afinitas kromatografi. Protein Expr. Purif. 3 (4): 263281, doi:10.1016 /
1046-5928 90001-D. (92)
[21] Parsy, C.B., Chapman, C.J., Barnes, A.C., Robertson,
J.F., Murray, A. 2007. Dua langkah metode untuk mengisolasi
target rekombinan protein dari penggabungan murni bakteri kontaminan SlyD setelah immobilised logam
afinitas kromatografi. J. Chromatogr. B. 853(1-2):314319, doi:10.1016/j.jchromb.2007.03.046.

[22] Schmitt, J., Hess, H., Stunnenberg., Hg 1993. Afinitas pemurnian histidine