Definisi Spektroskopi.

Spektroskopi adalah ilmu yang mempelajari materi dan atributnya berdasarkan

cahaya, suara atau partikel yang dipancarkan, diserap atau dipantulkan oleh materi
tersebut. Pada abad pertengahan 19 kimiawan Jerman Robert Wilhelm Bunsen (1811-
1899) dan fisikawan Jerman Gustav Robert Kirchhoff (1824-1887) berkerjasama
mengembangkan spektrometer, mereka menemukan unsur yaitu rubidium dan cesium.
Spektroskopi banyak berperan penting dalam penemuan gas mulia.

Spektrofotometri adalah ilmu yang mempelajari tentang penggunaan

spektrofotometer. Spektriofotometer adalah alat yang terdiri dari spektrofotometer dan
fotometer. Spektofotometer adalah alat yang digunakan untuk mengukur energi secara
relative jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan, atau diemisikan sebagai fungsi
dari panjang gelombang. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spectrum dengan
panjang gelombang tertentu, dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang
ditransmisikan atau yang diabsorpsi.
Metode dengan bantuan spektrometer adalah spektroskopi. Spektometer terdiri
dari sumber sinar, prisma, sel sampel, detektor dan pencatat. Fungsi prisma adalah untuk
memisahkan sinar polimkromatis di sumber cahaya menjadi sinar monokromatis. Dalam
spektrometer modern, sinar yang datang pada sampel diubah panjang gelombangnya
secara kontinyu. Hasil percobaan diungkapkan dalam spektrum dengan absisnya
menyatakan panjang gelombang (atau bilangan gelombang atau frekuensi) sinar datang
dan ordinatnya menyatakan energi yang diserap sampel. Radiasi cahaya atau
elektromagnet dapat dianggap menyerupai gelombang. Beberapa sifat fisika cahaya
paling baik diterangkan dengan ciri gelombangnya, sedangkan sifat lain diterangkan
dengan sifat partikel. Jadi cahaya dapat bersifat ganda. Diagram suatu gelombang yang
ditandai dengan cirri yang penting dapat dilihat dalam gambar berikut :
 = panjang gelombang, yaitu jarak yang ditempuh oleh gelombang selama satu siklus
(Cycle), dengan satuan : satuan panjang/ siklus A = amplitude gelombang, yaitu
perpindahan maksimum dari poros horizontal, satuan : satuan panjang T = periode, waktu
yang dibutuhkan untuk satu siklus sempurna, satuan : detik/ siklus = frekuensi osilasi,
jumlah siklus dalam tiap detik, satuan : siklus/detik atau Hertz.
1. TEORI SPEKTROSKOPI INFRA MERAH

Spektrofotometri Infra Red atau Infra Merah merupakan suatu metode yang
mengamati interaksi molekul dengan radiasi elektromagnetik yang berada pada daerah
panjang gelombang 0,751.000 m atau pada bilangan gelombang 13.00010 cm -1.
Metode ini banyak digunakan pada laboratorium analisis industri dan laboratorium riset
karena dapat memberikan informasi yang berguna untuk analisis kualitatif dan kuantitatif,
serta membantu penerapan rumus bangun suatu senyawa.
Konsep radiasi inframerah diajukan pertama kali oleh Sir Wiliam Hershel (tahun
1800) melalui percobaannya mendespersikan radiasi matular dengan prisma.Ternyata
pada daerah sesudah sinar merah menunjukkan adanya kenaikan temperature tertinggi
yang berarti pada daerah X radiasi tersebut banyak kalori(energy tinggi).Daerah spectrum
tersebut selanjutnya disebut inframerah(IR diseberang atau diluar merah).
A. Prinsip dasar Spektroskopi IR
Jika senyawa organik dikenai sinar infra-merah yang mempunyai frekwensi
tertentu (bilangan gelombang 500 -4000 Cm-1), sehingga beberapa frekwensi tersebut
diserap oleh senyawa tersebut. Berapa banyak frekwensi tertentu yang melewati senyawa
tersebut diukur sebagai 'persentasi transmitasi' (percentage transmittance). Persentasi
transmitasi dengan nilai 100 berarti semua frekwensi dapat melewati senyawa tersebut
tanpa diserap sama sekali. Transmitasi sebesar 5% mempunyai arti bahwa hampir semua
frekwensi tersebut diserap oleh senyawa itu.
Kedudukan pita serapan dapat dinyatakan dalam satuan frekuensi, V (det-1 atau hz)
atau panjang gelombang (mikrometer) atau bilangan gelombang v (cm-1 ). Radiasi inframerah
digolongkan lagi atas 4 daerah, sepeti table :
No. Daerah inframerah Rentang panjangRentang V (cm-1) Rentang Frekuensi
gelombang (m) v (Hz)
1. Dekat 0.78 2.5 13.000 4.000 3.8 1.2 (10-14)
2.. Pertengahan 7.5 50 4000 5000 1.2 0.06 (10 -14)
3. Jauh 50 - 1000 200 - 10 6.0 0.3 (10-14)
 4. Terpakai untuk analisis2.5 15 4000 670 1.2 0.2 (10-14)
insrumental
Interaksi radiasi IR dengan molekul
Radiasi IR yang dipakai untuk analisis instrumental adalah radiasi IR yang
rentang bilangan gelombangnya (V ) antara 4000 hingga 670 cm-1.
Radiasi IR tersebut terbagi lagi atas dua daerah ,yaitu :
Daerah gugus fungsi pada rentang (V ) antara 4000 hingga600 cm-1
Daerah sidik jari pada rentang V antara 1600 hingga 670 cm-1
B. Transisi yang menghasilkan absorpsi Infra merah
Vibrasi Regangan (Streching)
Dalam vibrasi ini, atom bergerak terus sepanjang ikatan yang menghubungkannya
sehingga akan terjadi perubahan jarak antara keduanya, walaupun sudut ikatan tidak
berubah. Vibrasi regangan ada dua macam, yaitu:
a) Regangan Simetri, yaitu unit struktur bergerak bersamaan dan searah dalam satu bidang
datar.
b) Regangan Asimetri, yaitu unit struktur bergerak bersamaan dan tidak searah tetapi masih
dalam satu bidang datar

Vibrasi Bengkokan (Bending)

Jika sistem tiga atom merupakan bagian dari sebuah molekul yang lebih besar,
maka dapat menimbulkan vibrasi bengkokan atau vibrasi deformasi yang mempengaruhi
osilasi atom atau molekul secara keseluruhan. Vibrasi bengkokan ini terbagi menjadi
empat jenis, yaitu :
a) Vibrasi Goyangan (Rocking), unit struktur bergerak mengayun asimetri tetapi masih dalam bidang datar
b) Vibrasi Guntingan (Scissoring), unit struktur bergerak mengayun simetri dan masih dalam bidang datar
c) Vibrasi Kibasan (Wagging), unit struktur bergerak mengibas keluar dari bidang datar
d) Vibrasi Pelintiran (Twisting), unit struktur berputar mengelilingi ikatan yang menghubungkan dengan
molekul induk dan berada di dalam bidang datar
 Selain vibrasi peregangan, molekul juga mengalami vibrasi pelenturan yaitu
rocking, scissoring, wagging dan twisting.

C. Daerah Spektrum Infra merah

Spektra yang akan diinterpretasikan harus memenuhi persyaratan berikut :
1) Resapan satu sama lainnya harus terpisah dan mempunyai intensitas yang memadai.
2) Spektra harus berasal dari zat murni.
3) Spektrofotometer harus dikalibrasi.
4) Tehnik preparasi sampel harus nyata, selain itu posisi resapan, bentuk, dan tingkat
intensitas sering membantu karna spesifik untuk gugus tertentu.
5) Serapan Khas Beberapa Gugus fungsi
Gugus Jenis Senyawa Daerah Serapan (cm-1)
C-H alkana 2850-2960, 1350-1470
C-H alkena 3020-3080, 675-870
C-H aromatik 3000-3100, 675-870
C-H alkuna 3300
C=C Alkena 1640-1680
 C=C aromatik (cincin) 1500-1600
C-O alkohol, eter, asam karboksilat, ester 1080-1300
C=O aldehida, keton, asam karboksilat, ester 1690-1760
O-H alkohol, fenol(monomer) 3610-3640
O-H alkohol, fenol (ikatan H) 2000-3600 (lebar)
O-H asam karboksilat 3000-3600 (lebar)
N-H amina 3310-3500
C-N Amina 1180-1360
-NO2 Nitro 1515-1560, 1345-1385

D. Instrumentasi Spektrofotometer IR
Bagian pokok dari spektrofotometer inframerah adalah sumber cahaya inframerah
monokromator dan detector. Cahaya dari sumber dilewatkan melalui cuplikan, dipecah
menjadi frekuensi-frekuensi individunya dalam monokromator dan intensitas relative dan
frekuensi individu diukur oleh detector.
Instrumentasi spektrofotometer IR susunannya hampir sama dengan
spektrofotometer UV-VIS. Perbedaannya adalah sampel berhadapan langsung dengan
sumber radiasi.

Secara singkat :
Ket :
SR = Sumber radiasi
SK = Sampel kopartemen
M = Monokromator
D = Detektor
A = Amplifier/penguat
VD = Visual display /meter
 E. Cara Penanganan Instrument IR
Berikut cara penanganan yang disederhanakan terhadap alat inframerah dan
diagram double beam(berkas rangkap). Spektrofotometer IR sbb :

F. Aplikasi Spektrometri Inframerah

Spektrofotometer infra merah dapat digunakan untuk beberapa hal berikut ini :
a. Identfikasi gugus fungsional
b. Dengan mempertimbangkan adanya informasi lain seperti titik lebur, titik didih, berat
molekul dan refractive index maka dapat menentukan stuktur dan dapat mengidentifikasi
senyawa
c. Dengan menggunakan komputer, dapat mengidentifikasi senyawa bahkan campuran
senyawa.
Komponen dasar spektrofotometer IR sama dengan UV tampak , tetapi
sumber,detektor dan komponen optiknya sedikit berbeda. Mula-mula sinar infra marah di
lewatkan melaui sampel dan laritan pambanding kemudian di laewatkan pada
monokromator untuk menghilangkan sinar yang tidak diinginkan. Berkas ini kemudian
dididspersikan melalui prisma atau gratting. Dengan melewatkannya melalui slit, sinar
akan di fokuskan pada detektor. Alat IR biasanya dapat merekam sendiri absorbansinya
sendiri. Temperatur dan kelembpan juga harus di atur yaitu maksimum 50% dan apabial
melebihi bats tersebut maka menbuat permukaan prisma dan sel alkali halida menjadi
suram.
Sumber radiasi yang serin di gunakan adalah Nernest atau lampu Glower yang di
buat dari oksida-oksida zirkonium dan natrium, berupa batang berongga denga diameter
2mm dan panjang 30mm. Batang ini di panaskan sampai suhu1500-20000C dan akan
memberikan radiasi diatas 7000cm-1. Sumber Glower juga di gunkan dalam instrumen
dengan absorbansi sekitar 5200cm-1.
 Monokromator yang di gunakkan dalam infra merah terbuat dari berbagai macam
bahan antara lain gelas, lelehan silika, LiF, CaF 2, BaF2,NaCl, AgCl, KBr, Csl. Tetapi pada
ummnya prisma NaCl di gunakan yuntuk daerah 4000-6000cm- 1 dan prisma Kbruntuk
400cm-1.
Untuk detektor dalam infra merah digunakan detektor termal. Di antara detektor
termal , termokopellah yang banyak di gunakan. Bolometer memberikan sinyal listrik
sebagai hasil perubahan dalam tahanan konduktor metal dengan temperatur .
Untuk intrumen yang di gunakan umumnya ada 2 macam intrumen yaitu u tuk
analisis kuantitatif dan untuk analisis kualitatif. Karena kompleksnya spektrum IR maka
di gunakan recorder . umunya alat IR digunaka berkas ganda yang di rancang lebih
sederhana drai pada berkas tunggal. Dalam semua instrumen selalu ada chopper frekuensi
rendah untuk menyesuaikan output sumber. Rancangan optisnya mirip denga
spektrofotometer UV-tampk kecuali tempat sampel dan pembandingan di tempatkan di
antara sumber dan monokromator untuk menghamburkan sinar yang berasal dari sampel
dan untuk mencegah terjadinya penguraian secara fotokimia. Sumber sinar di bagi
menjadi dua berkas , satu di ewatkan pada sampel dan yang satu melewati pembanding,
kemudain secara berturt-turut melewati attenuator dan chopper. Setelah melalui prisma,
berkas jatuh pad detektor dan di ubah menjadi sinyal listrik yang di rekam oleh recorder.
Kadang kadang di perlukan amplifier bila sinyal lemah. Pada pengukuran kuantitatif
model berkas ganda kurang begitu memuaskan karena banyak ganguan dari sirkuit
elektronik dan pengaturan titik nol besar sehinngga menyebabkan kesalahan.
Sinar dari sumber dibagi dalam 2 berkas yang sama, satu berkas melalui cuplikan
dan satu berkas lainnya sebagai baku. Fungsi model berkas ganda adalah mengukur
perbedaan intensitas antara 2 berkas pada setiap panjang gelombang. Kedua berkas itu
dipantulkan pada chopper yang berupa cermin berputar. Hal ini menyebabkan berkas
cuplikan dan berkas baku dipantulkan secara bergantian ke kisi difraksi. Kisi difraksi
berputar lambat, setiap frekuensi dikirim ke detektor yang mengubah energi panas
menjadi energi listrik.
Jika pada suatu frekuensi cuplikan menyerap sinar maka detektor akan menerima
intensitas berkas baku yang besar dan berkas cuplikan yang lemah secara bergantian. Hal
ini menimbulkan arus listrik bolak-balik dalam detektor dan akan diperkuat oleh
amplifier. Jika cuplikan tidak menyerap sinar, berarti intensitas berkas cuplikan sama
dengan intensitas berkas baku dan hal ini tidak menimbulkan arus bolak-balik, tetapi arus
searah. Amplifier dibuat hanya untuk arus bolak-balik.
Arus bolak-balik yang terjadi ini digunakan untuk menjalankan suatu motor yang
dihubungkan dengan suatu alat penghalang berkas sinar yang disebut baji optik. Baji
optik ini oleh motor dapat digerakkan turun naik ke dalam berkas baku sehingga akan
mengurangi intensitasnya yang akan diteruskan ke detektor. Baji optik ini digerakkan
sedemikian jauh ke dalam berkas baku sehingga intensitasnya dikurangi dengan jumlah
yang sama banyaknya dengan jumlah pengurangan intensitas berkas cuplikan, jika
cuplikan melakukan penyerapan. Gerakan baji ini dihubungkan secara mekanik dengan
pena alat rekorder sehingga gerakan baji ini merupakan pita serapan pada spektrum
tersebut.
Secara singkat sistem kerjanya seperti ini sebuah cuplikan ynag ditempatkan di
dalam spektrofotometer infra merah dan dikenai radiasi infra merah yang berubah
panjang gelombangnya secara berkesinambungan menyerap cahaya jika radiasi yang
masuk bersesuaian dengan energi getaran molekul tertentu. Spektrofotometer infra merah
memayar daerah rentangan dan lenturan molekul. Penyerapan radiasi dicatat dan
menghasilkan sebuah spektrum infra merah. Hadirnya sebuah puncak serapan dalam
daerah gugus fungsi sebuah spektrum infra merah hampir selalu merupakan petunjuk
pasti bahwa beberapa gugus fungsi tertentu terdapat dalam senyawa cuplikan. Demikian
pula, tidak adanya puncak dalam bagian tertentu dari daerah gugus fungsi sebuah
spektrum infra merah biasanya berarti bahwa gugus tersebut yang menyerap pada daerah
itu tidak ada.
2. TEORI SPEKTROSKOPI UV-VISIBLE

Spektrofotometri UV-Vis adalah anggota teknik analisis spektroskopik yang

memakai sumber REM (radiasi elektromagnetik) ultraviolet dekat (190-380 nm) dan
sinar tampak (380-780 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer.
Spektrofotometri UV-Vis melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul
yang dianalisis, sehingga spektrofotometri UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis
kuantitatif dibandingkan kualitatif. Spektrofotometer Uv-Vis adalah alat yang digunakan
untuk mengukur transmitansi, reflektansi dan absorbsi dari cuplikan sebagai fungsi dari
panjang gelombang. Spektrofotometer sesuai dengan namanya merupakan alat yang
terdiri dari spektrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum
dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya
yang ditransmisikan atau yang diabsorbsi. Jadi spektrofotometer digunakan untuk
mengukur energi cahaya secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan
atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang. Suatu spektrofotometer tersusun
dari sumber spektrum sinar tampak yang sinambung dan monokromatis. Sel pengabsorbsi
untuk mengukur perbedaan absorbsi antara cuplikan dengan blanko ataupun pembanding.
Spektrofotometer Uv-Vis merupakan spektrofotometer yang digunakan untuk
pengukuran didaerah ultra violet dan didaerah tampak. Semua metode spektrofotometri
berdasarkan pada serapan sinar oleh senyawa yang ditentukan, sinar yang digunakan
adalah sinar yang semonokromatis mungkin.
Spektrofotometer UV-Vis (Ultra Violet-Visible) adalah salah satu dari sekian
banyak instrumen yang biasa digunakan dalam menganalisa suatu senyawa kimia.
Spektrofotometer umum digunakan karena kemampuannya dalam menganalisa begitu
banyak senyawa kimia serta kepraktisannya dalam hal preparasi sampel apabila
dibandingkan dengan beberapa metode analisa.
Spektrofotometri UV/Vis melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada
molekul yang dianalisis, sehingga spetrofotometer UV/Vis lebih banyak dpakai ntuk
analisis kuantitatif dibanding kualitatif.
Spektrofotometri UV-vis adalah pengukuran serapan cahaya di daerah ultraviolet
(200350 nm) dan sinar tampak (350 800 nm) oleh suatu senyawa. Serapan cahaya uv
atau cahaya tampak mengakibatkan transisi elektronik, yaitu promosi elektron-elektron
dari orbital keadaan dasar yang berenergi rendah ke orbital keadaan tereksitasi berenergi
lebih tinggi.
A. Prinsip Dasar Spektroskopi UV-Vis
Cahaya yang berasal dari lampu deuterium maupun wolfram yang bersifat
polikromatis di teruskan melalui lensa menuju ke monokromator pada spektrofotometer
dan filter cahaya pada fotometer. Monokromator kemudian akan mengubah cahaya
polikromatis menjadi cahaya monokromatis (tunggal). Berkas-berkas cahaya dengan
panjang tertentu kemudian akan dilewatkan pada sampel yang mengandung suatu zat
dalam konsentrasi tertentu. Oleh karena itu, terdapat cahaya yang diserap (diabsorbsi)
dan ada pula yang dilewatkan. Cahaya yang dilewatkan ini kemudian di terima oleh
detector. Detector kemudian akan menghitung cahaya yang diterima dan mengetahui
cahaya yang diserap oleh sampel. Cahaya yang diserap sebanding dengan konsentrasi zat
 yang terkandung dalam sampel sehingga akan diketahui konsentrasi zat dalam sampel
secara kuantitatif.
Pengukuran spektrofotometri menggunakan alat spektrofotometer yang
melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga
spektrofotometer UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan
kualitatif. Spektrum UV-Vis sangat berguna untuk pengukuran secara kuantitatif.
Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa ditentukan dengan mengukur absorban pada
panjang gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer. Hukum
Lambert-Beer menyatakan hubungan linieritas antara absorban dengan konsentrasi
larutan analit dan berbanding terbalik dengan transmitan. Dalam hukum Lambert-Beer
tersebut ada beberapa pembatasan, yaitu :
- Sinar yang digunakan dianggap monokromatis
- Penyerapan terjadi dalam suatu volume yang mempunyai penampang yang sama
- Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak tergantung terhadap yang lain
dalam larutan tersebut
- Tidak terjadi fluorensensi atau fosforisensi
- Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan

Hukum Lambert-Beer dinyatakan dalam rumus sbb :

A = e.b.c
dimana :
A = absorban
e = absorptivitas molar
b = tebal kuvet (cm)
c = konsentrasi
B. Absorpsi pada spektroskopi UV-Vis
Absorbsi cahaya UV-Vis mengakibatkan transisi elektronik, yaitu promosi
electron-electron dari orbital keadaan dasar yang berenergi rendah ke orbital keadaan
tereksitasi berenergi lebih tinggi. Energi yang terserap kemudian terbuang sebagai cahaya
atau tersalurkan dalam reaksi kimia. Absorbsi cahaya tampak dan radiasi ultraviolet
meningkatkan energi elektronik sebuah molekul, artinya energi yang disumbangkan oleh
foton-foton memungkinkan electron-electron itu mengatasi kekangan inti dan pindah ke
luar ke orbital baru yag lebih tinggi energinya. Semua molekul dapat menyerap radiasi
dalam daerah UV-tampak karena mereka mengandung electron, baik sekutu maupun
menyendiri, yang dapat dieksitasi ke tingkat energi yang lebih tinggi.
Absorbsi untuk transisi electron seharusnya tampak pada panjang gelombang
diskrit sebagai suatu spectrum garis atau peak tajam namun ternyata berbeda. Spektrum
UV maupun tampak terdiri dari pita absorbsi, lebar pada daerah panjang gelombang yang
lebar. Ini disebabkan terbaginya keadaan dasar dan keadaan eksitasi sebuah molekul
dalam subtingkat-subtingkat rotasi dan vibrasi. Transisi elektronik dapat terjadi dari
subtingkat apa saja dari keadaan dasar ke subtingkat apa saja dari keadaan eksitasi.
Karena berbagi transisi ini berbeda energi sedikit sekali, maka panjang gelombang
absorpsinya juga berbeda sedikit dan menimbulkan pita lebar yang tampak dalam
spectrum itu.
Absorptivitas (a) merupakan suatu konstanta yang tidak tergantung pada
konsentrasi, tebal kuvet dan intensitas radiasi yang mengenai larutan sampel.
Absorptivitas tergantung pada suhu, pelarut, struktur molekul, dan panjang gelombang
radiasi. Satuan a ditentukan oleh satuan-satuan b dan c. Jika satuan c dalam molar (M)
maka absorptivitas disebut dengan absorptivitas molar dan disimbolkan dengan dengan
satuan M -1cm-1 atau liter.mol-1cm-1. Jika c dinyatakan dalam persen berat/volume
(g/100mL) maka absorptivitas dapat ditulis dengan E1%1cmA1%1cm
C. Daerah spektrum UV-Vis
Data-data yang dikeluarkan oleh UV atau VIS dapat berupa absorbansi atau
transmitansi yang langsung dibaca pada spektrofotometer. Namun untuk UV, VIS, UV-
VIS dan IR data yang dikeluarkan dapat berupa spektrum jika telah dihubungkan dengan
komputer.
Spektrum yang dikeluarkan oleh UV, VIS dan UV-VIS berupa pita yang lebar
sedangkan pada pita yang dikeluarkan oleh IR berupa garis atau puncak tajam.
Pita melebar dari UV-VIS disebabkan karena energi yang dimiliki selain
menyebabkan transisi elektronik terjadi pula rotasi dan vibrasi elektron dalam molekul.
Sedangkan pada IR hanya terjadi vibrasi elektron maka spektrum yang dihasilkan berupa
garis atau puncak tajam. Selain pada IR, spektrum berupa garis dapat terjadi pula pada
spektroskopi NMR karena hanya terjadi rotasi elektron.
Spektrum yang dihasilkan dari setiap spektroskopi berbeda antara satu dengan
yang lainnya. Para kimiawan spektrum UV, VIS maupun IR dapat dibedakan dengan
mudah. Spektrum yang dihasilkan oleh UV, VIS dan UV-VIS tidak berbeda jauh namun
sangat sangat berbeda bila dibanding spektrum IR. Untuk membedakannya dapat dilihat
pada gambar:
 Gambar spektrum UV. Namun spektrum dari spektrofotometer VIS dan UV-VIS
menyerupai spektrum UV
D. Instrumen
Pada umumnya terdapat dua tipe instrumen spektrofotometer, yaitu single-beam
dan double-beam. gambar Single-beam instrument dan Double-beam instrument
1. Single-beam instrument
Single-beam instrument dapat digunakan untuk kuantitatif dengan mengukur
absorbansi pada panjang gelombang tunggal. Single-beam instrument mempunyai
beberapa keuntungan yaitu sederhana, harganya murah, dan mengurangi biaya yang ada
merupakan keuntungan yang nyata. Beberapa instrumen menghasilkan single-beam
instrument untuk pengukuran sinar ultra violet dan sinar tampak. Panjang gelombang
paling rendah adalah 190 sampai 210 nm dan paling tinggi adalah 800 sampai 1000 nm
(Skoog, DA, 1996).
2. Double-beam instrument
Double-beam dibuat untuk digunakan pada panjang gelombang 190 sampai 750
nm. Double-beam instrument dimana mempunyai dua sinar yang dibentuk oleh potongan
cermin yang berbentuk V yang disebut pemecah sinar. Sinar pertama melewati larutan
blangko dan sinar kedua secara serentak melewati sampel, mencocokkan foto detektor
yang keluar menjelaskan perbandingan yang ditetapkan secara elektronik dan
ditunjukkan oleh alat pembaca (Skoog, DA, 1996).
Spektrofotometer UV-VIS seperti yang tertera pada gambar.
Secara sederhana Instrumen spektrofotometri yang disebut spektrofotometer terdiri dari :

sumber cahaya monokromator sel sampel detektor read out (pembaca).

E. Cara kerja instrumen
Cara kerja spektrofotometer secara singkat adalah sebagai berikut. Tempatkan
larutan pembanding, misalnya blangko dalam sel pertama sedangkan larutan yang akan
dianalisis pada sel kedua. Kemudian pilih foto sel yang cocok 200nm-650nm (650nm-
1100nm) agar daerah yang diperlukan dapat terliputi. Dengan ruang foto sel dalam
keadaan tertutup nol galvanometer didapat dengan menggunakan tombol dark-current.
Pilih h yang diinginkan, buka fotosel dan lewatkan berkas cahaya pada blangko dan nol
galvanometer didapat dengan memutar tombol sensitivitas. Dengan menggunakan tombol
transmitansi, kemudian atur besarnya pada 100%. Lewatkan berkas cahaya pada larutan
sampel yang akan dianalisis. Skala absorbansi menunjukkan absorbansi larutan sampel.
Proses Absorbsi Cahaya pada Spektrofotometri
Ketika cahaya dengan panjang berbagai panjang gelombang (cahaya polikromatis)
mengenai suatu zat, maka cahaya dengan panjang gelombang tertentu saja yang akan
diserap. Di dalam suatu molekul yang memegang peranan penting adalah elektron valensi
dari setiap atom yang ada hingga terbentuk suatu materi. Elektron-elektron yang dimiliki
oleh suatu molekul dapat berpindah (eksitasi), berputar (rotasi) dan bergetar (vibrasi) jika
dikenai suatu energi.
Jika zat menyerap cahaya tampak dan UV maka akan terjadi perpindahan elektron
dari keadaan dasar menuju ke keadaan tereksitasi. Perpindahan elektron ini disebut
transisi elektronik. Apabila cahaya yang diserap adalah cahaya inframerah maka elektron
yang ada dalam atom atau elektron ikatan pada suatu molekul dapat hanya akan bergetar
(vibrasi). Sedangkan gerakan berputar elektron terjadi pada energi yang lebih rendah lagi
misalnya pada gelombang radio.
Atas dasar inilah spektrofotometri dirancang untuk mengukur konsentrasi suatu suatu
yang ada dalam suatu sampel. Dimana zat yang ada dalam sel sampel disinari dengan
cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu. Ketika cahaya mengenai sampel
sebagian akan diserap, sebagian akan dihamburkan dan sebagian lagi akan diteruskan.
Pada spektrofotometri, cahaya datang atau cahaya masuk atau cahaya yang mengenai
permukaan zat dan cahaya setelah melewati zat tidak dapat diukur, yang dapat diukur
adalah It/I0 atau I0/It (perbandingan cahaya datang dengan cahaya setelah melewati
materi (sampel)).
F. Aplikasi spektroskopi UV-Vis
Spektrofotometer infra merah dapat digunakan untuk beberapa hal berikut ini :
Identfikasi gugus fungsional
Dengan mempertimbangkan adanya informasi lain seperti titik lebur, titik didih, berat
molekul dan refractive index maka dapat menentukan stuktur dan dapat mengidentifikasi
senyawa Dengan menggunakan komputer, dapat mengidentifikasi senyawa bahkan
Spekra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan sekaligus dapat digunakan
untuk analisis kuantitatif.
Analisis Kualitatif
Penggunaan alat ini dalam analisis kuantitatif sedikit terbatas sebab spektrum sinar
tampak atau sinar UV menghasilkan puncak-puncak serapan yang lebar sehingga dapat
disimpulkan bahwa spektrum yang dihasilkan kurang menunjukan puncak-punca serapan.
Namun, walaupun puncak yang dihasilkan bebentuk lebar, puncak tersebut masih dapat
digunakan untuk memperoleh keterangan ada atau tidaknya gugus fungsional tertentu
dalam suatu molekul organik.
 Analisis Kuantitatif
Penggunaan sinar UV dalam analisis kuantitatif memberikan beberapa keuntungan,
diantaranya ;
Dapat digunakan secara luas
Memiliki kepekaan tinggi
Keselektifannya cukup baik dan terkadang tinggi
Ketelitian tinggi
Tidak rumit dan sepat
Penerapan spektrofotometer UV-VIS dalam bidang Farmasi
3. TEORI SPEKTROSKOPI FLUOROMETRI

Fluoresensi adalah proses pemancaran radiasi cahaya oleh suatu materi setelah
tereksitasi oleh berkas cahaya berenergi tinggi. Emisi cahaya terjadi karena proses
absorbsi cahaya oleh atom yang mengakibatkan keadaan atom tereksitasi. Keadaan atom
yang tereksitasi akan kembali keadaan semula dengan melepaskan energi yang berupa
cahaya (de-eksitasi). Fluoresensi merupakan proses perpindahan tingkat energi dari
keadaan atom tereksitasi (S1 atau S2) menuju ke keadaan stabil (ground states). Proses
fluoresensi berlangsung kurang lebih 1 nano detik sedangkan proses fosforesensi
berlangung lebih lama, sekitar 1 sampai dengan 1000 mili detik.
Teknik analisis spektrofluorometri adalah termasuk salah satu tenik analisis
instrumental disamping teknik kromatografi dan elektroanalisis kimia. Teknik tersebut
memanfaatkan fenomena interaksi materi dengan gelombang elektromagnetik seperti
sinar-x, ultraviolet, cahaya tampak dan inframerah. Fenomena interaksi bersifat spesifik
baik absorpsi maupun emisi. Interaksi tersebut menghasilkan signal-signal yang disadap
sebagai alat analisis kualitatif dan kuantitatif. Contoh teknik spektroflourometri absorpsi
adalah UV/VIS, inframerah (FT-IR) dan absorpsi atom (AAS). Sedang contoh
spektrofluorometri emisi adalah spektrofluorometri nyala dan inductively coupled plasma
(ICP), yang merupakan alat ampuh dalam analisis logam. Masih banyak teknik lain yang
didasarkan pada hamburan atau difraksi cahaya seperti turbidimetri dan sinar-x.
A. Prinsip Dasar Spektroskopi Flourmetri
Prinsip-prinsip umum dapat diilustrasikan dengan diagram Jablonski (Veberg,
2006), seperti yang ditunjukkan pada Gambar di bawah. Menurut diagram Jablonski
energi emisi lebih rendah dibandingkandengan eksitasi. Ini berarti bahwa emisi
fluoresensi yang lebih tinggi terjadi padapanjang gelombang dari penyerapan (eksitasi).
Perbedaan antara eksitasi dan panjanggelombang emisi dikenal sebagai pergeseran Stoke.
 Langkah pertama (i) adalah eksitasi, di mana cahaya diserap oleh molekul,yang
ditransfer ke keadaan tereksitasi secara elektronik yang berarti bahwa sebuahelektron
bergerak dari keadaan dasar singlet, S0, ke keadaan singlet tereksitasiS1. Inidiikuti
dengan relaksasi getaran atau konversi internal (ii), dimana molekul inimengalami
transisi dari elektronik atas ke yang lebih rendahS 1, tanpa radiasiapapun. Akhirnya,
emisi terjadi (iii), biasanya 10 - 8 detik setelah eksitasi, ketika kembali elektron
kekeadaan dasar lebih stabil, S0, memancarkan cahaya pada panjanggelombang yang
sesuaidengan perbedaan energi antara kedua negara elektronik.
Dalam molekul, masing-masing kondisi elektronik memiliki beberapa
kondisibagian getaran terkait. Dalam keadaan dasar, hampir semua molekul
menempatitingkat vibrasi terendah. Dengan eksitasi dengan sinar UV atau terlihat,
adalahmungkin untuk mempromosikan molekul yang tertarik ke salah satu tingkat
getaranbeberapa tingkat tereksitasi secara elektronik yang diberikan. Ini berarti bahwa
emisifluoresensi tidak hanya terjadi pada satu panjang gelombang tunggal,
melainkanmelalui distribusi panjang gelombang yang sesuai untuk transisi vibrasi
beberapasebagai komponen dari transisi elektronik tunggal. Inilah sebabnya mengapa
eksitasidan spektrum emisi diperoleh untuk menggambarkan secara rinci
karakteristik molekul fluoresensi
1. Luminesensi.
Yaitu emisi fotons dari keadaan tereksitasi elektronik. Terdapat dua tipe luminesensi
antara lain : a. Relaksasi dari keadaan eksitasi singlet excited. b. Relaksasi dari keadaan
eksitasi triplet.
2. Keadaan singlet dan triplet stated.
Yaitu keadaan dasar dua elektron perorbital.
 Keadaan eksitasi singlet : elektron pada orbital tinggi memiliki arah spin berlawanan
relative terhadap elektron dalam orbital lebih rendah.
Keadaan eksitasi triplet : elektron valence tereksitasi secara spontan berbalik arah
spinnya. Proses ini disebut intersystem crossing. Elektron dalam kedua orbital sekarang
memiliki arah spin yang sama.
3. Jenis emisi
Diman fluoresensi kembali dari keadaan eksitasi singlet ke keadaan dasar, tidak
memerlukan perubahan arah spin. Fosforesensi yaitu kembali dari keadaan eksitasi triplet
ke keadaan dasar, elektron perlu perubahan arah spin. Laju emisi fluoresensi beberapa
tingkat lebih cepat dari pada fosforesensi.
Proses fluorosensi dalam keadaan tereksitasi, elektron akan di promosikan
ke orbital anti-bonding menjadikan atom dalam ikatan kurang kuat terikat sehingga
bergeser ke kanan kurva energi potensial S1 akibatnya elektron terpromosikan ke level
energi vibrational eksitasi S1 lebih tinggi dari pada level vibrational dalam keadaan dasar.
Deteksi vibrational berlangsung lewat tabrakan intermolekul pada skala waktu 10-12s
(lebih cepat dari pada proses fluoresensi).
B. Absorbsi
Ketika suatu atom atau molekul mengabsorbsi energi cahaya sebesar hA maka
elektron-elektron pada kondisi dasar (ground sate) S0akan berpindah ke tingkat energi
yang lebih tinggi ke tinggat S1 atau S2. Waktu yang dibutuhkan untuk proses tersebut
kurang dari 1piko detik.

Atom akan mengalami konversi internal atau relaksasi pada kondisi S1 dalam
waktu yang sangat singkat sekitar 10-1ns, kemudian atom tersebut akan melepaskan
sejumlah energi sebesar hfyang berupa cahaya. Karenanya energi atom semakin lama
semakin berkurang dan akan kembali menuju ke tingkat energi dasar S0 untuk mencapai
keadaan suhu yang setimbang (thermally equilibrium). Emisi fluoresensi dalam bentuk
spektrum yang lebar terjadi akibat perpindahan tingkat energi S1 menuju ke sub-tingkat
energi S0 yang berbeda-beda yang menunjukan tingkat keadaan energi dasar vibrasi atom
0, 1, dan 2 berdasarkan prinsip Frank-Condon.
C. Instrumen

Pengukuran intensitas fluoresensi dapat dilakukan dengan suatu fluorometer filter

sederhana. Fluorometri adalah suatu metode analisis yang erat hubungannya dengan
spektrofluorometri. Energi yang di serap oleh molekul untuk transisi elektronik ke level
energi yang lebih tinggi harus dilepaskan kembali pada waktu kembali ke level energi
terendah. Energi yang dilepaskan ini dapat berupa panas dan untuk beberapa molekul
tertentu sebagian dari energi yang diserap dipancarkan kembali berupa cahaya
(fluoresensi).
D. Penerapan dari Spektroskopi Fluoresensi
Hanya sedikit ion anorganik yang berpendar, yang paling dikenal adalah
ionuranil, UO22+. Umumnya alanisis fluorometrik melibatkan molekul organik.
Adabeberapa senyawa kelat logam yang berpendar yang memberikan metode yang
pekauntuk beberapa ion logam. Seringkali kelat logam diekstraksi dari dalam
larutanberair menjadi suatu pelarut organik sebelum pengukuran, suatu proses dan
sekaligusmemisahkannya dari ion-ion pengganggu dan mengkonsentrasikan spesies
yangberpendar. Misalnya, banyak terdapat reagensia flourometrik untuk aluminium
danberilium. Logam-logam yang lebih berat seperti Fe2+, Co2+, Ni2+dan
Cu2+sebaliknyacenderung mematikan flourosens yang diperagakan oleh banyak zat
pengkelat itusendiri, hadinya logam itu dalam kompleks mendorong dibuangnya energi
yangdiserap secara tak radiantif.Kadang suatu analit yang tidak berpendar dapat diubah
menjadi suatu molekulyang berpendar kuat, dengan suatu reaksi yang cepat dan
 kuantitatif, yang denganmuadah digabungkan ke dalam suatu prosedur analitik
keseluruhan. Misalnya,hormon epinefrin (adrenalin) mudah diubah menjadi adrenolutin.
Dalam larutan basa,anion folat dari adrenolutin berpendar dengan kuat (eksitasi 360 nm;
pancaran 530nm). Pasien dengan tumor tertentu pada kelenjar adrenalin dan juga
beberapa penderita tekanan darah tinggi menunjukkan kadar efinefrina yang meningkat
dalamair seninya. Hormon yang terdapat pada kadar yang sangat rendah dapat
dipekatkandari dalam volume besar air seni dengan suatu prosedur penukar ion pada
suatu pHdimana nitrogen amino diprotonkan untuk membentuk suatu kation RNH 2-
CH2,dielusi dalam sedikit volume dengan ditukar-ganti dengan H+dan diolah seperti
diatas untuk membentuk flourofor itu.
Beberapa vitamin dapat ditetapkan secara fluorometrik. Oksidasi lembuttiamina
(vitamin B1) oleh Fe(CN)63-, misalnya akan menghasilkan suatu produk yangdisebut
tiokrom yang memperagakan fluoresens biru pada kondisi yang tepat. Jikapancaran
pendaran itu diukur terhadap dua porsi sampel, satu diolah denganferisianida dan yang
lain tidak, orang dapat mengurangi kontribusi pengganggu non-tiamina yang berpendar
untuk meningkatkan selektivitas. Riboflavin (vitamin B1) danpiridoksin (B6) merupakan
vitamin lain yang dapat ditetapkan oleh fluoresensi.Meskipun kebanyakan asam amino
tidak berpendar, tetapi mudah bereaksidengan reagen fluoresamina untuk membentuk
senyawa yang sangat berpendar yangtelah digunakan dalam biokimia untuk mendeteksi
kuantitas.Metode fluoresensi sangat baik untuk menetapkan beberapa hidrokarbon
aromatik polisiklik yang telah dikelompokkan sebagai polutan prioritas oleh Jawatan
Perlindungan Lingkungan Amerika Serikat (EPA), yang mengatakan bahwafluoresens
memberi deteksi yang sangat peka terhadap komponen-komponen sampeltertentu dalam
kromatografi cairan. Misalnya pada produk Susu :Produk-produk susu mengandung
beberapa fluorophores intrinsik. Misalnya asamamino aromatik dan asam nukleat,
triptofan, tirosin dan fenilalanin dalam protein,vitamin A dan B2, Nikotinamida adenin
dinukleotida (NADH) dan klorofil, danberbagai senyawa lainnya yang dapat ditemukan
pada konsentrasi rendah atau sangatrendah di produk makanan.

DAFTAR PUSTAKA
Fatimah, I. 2003 Analisis Fenol Dalam Sampel Air Menggunakan Spektrofotometri Derivatif. Logika,
Vol. 9(10). Jakarta.
Fatimah, syamsul dkk, 2009. Pengaruh Uranium Terhadap Analisis Thorium Menggunakan
Spektrofotometer Uv-Vis. Seminar Nasional V Sdm Teknologi Nuklir . Yogyakarta
Hendayana, S. Kadarohman, A. Sumarna, A. dan Supriatna, A. 1994 . Kimia Analitik Instrumen, edisi
ke-1. IKIP Press. Semarang.
Khopkar, S.M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Alih bahasa: Saptorahardjo. Universitas
Indonesia Press. Jakarta
Pavia, D. L., Lampman, G. M., Kriz, G.S., dan Vyvyan, J. R. 2009. Introduction to Spectroscopi.
Sauders College: Philladelphia.
Santoni, A. 2009. Elusidasi Struktur Senyawa Metabolit Sekunder Kulit Batang Surian (Toona
sinensis) Meliaceae dan Uji Aktivitas Insektisida. Disertasi. Program Pascasarjana
Universitas Andalas: Padang.
Sitorus, M. 2009. Spektroskopi Elusidasi Struktur Molekul Organik. Graha Ilmu: Yogyakarta.
http://andriyanto507.blogspot.com/2013/12/makalah-spektrofotometri-uv-vis-infra.html (di
akses pada hari, Minggu 8 Juni 2014)
https://wanibesak.wordpress.com/tag/prinsip-kerja-spektrofotometer/ (di akses pada hari, minggu, 8
Juni 2014)
http://www.x3-prima.com/2009/08/analisis-spektrofluorometri.html (diakses pada hari, Minggu, 8
Juni 2014)
http://wocono.wordpress.com/2013/03/04/spektrofotometri-uv-vis/ (diakses pada hari, minggu, 8 juni
2014)