INSTRUKSI KERJA

No. Instruksi : 18-5-1/MU/SMM-SIG

PT Saraswanti Indo Genetech Tanggal Terbit : 2 Februari 2015
Graha SIG Jl. Rasamala No. 20 Taman Yasmin Bogor
No. Terbit :2
16006 Indonesia. Phone: + 62-251- 753 2348 (hunting)
No. Revisi :0
082 111 516 516 Fax: + 62-251- 7540 927-7540-928.
Halaman : 1 dari 6
http://www.saraswanti.com

JUDUL
DIAGRAM ALIR
PENGUJIAN VITAMIN LARUT LEMAK Disahkan oleh:
(VITAMIN A, D, DAN E)
SECARA HPLC

Acuan

AOAC Official Method 2001.13 Vitamin A (Retinol) in Foods. Liquid Chromatography. 2011
AOAC International.

1. Vitamin A, D3, dan E dalam Bahan Pangan

1.1 Preparasi Standar
a. Larutan Standar Vitamin A

Ditimbang 55±0.1 mg retinyl acetate ke dalam labu ukur 100 mL

Dilarutkan dengan <3 mL aseton sampai larut lalu ditambahkan

Etanol 95% sampai tanda tera lalu dihomogenkan
(Larutan induk Vitamin A asetat 500 mg/L stabil selama 2 minggu dalam suhu 4oC
dan terhindar dari cahaya)

Dipipet 20 mL larutan induk ke dalam piala gelas 100 mL

Ditambahkan 20 mL etanol 95% dan 50 mg asam pirogalat, dihomogenkan

Dilewatkan gas nitrogen sebelum dipanaskan

Ditambahkan KOH 50% sebanyak 10 mL

Kocok larutan dan panaskan dalam waterbath pada suhu ± 80oC

selama 45 menit, kocok setiap 10 menit

Larutan didinginkan dan ditambahkan 10 mL asam asetat glasial,

didinginkan kembali hingga suhu ruang

Dipindahkan larutan ke dalam labu ukur 100 mL, dihimpitkan larutan

 INSTRUKSI KERJA
No. Instruksi : 18-5-1/MU/SMM-SIG
PT Saraswanti Indo Genetech Tanggal Terbit : 2 Februari 2015
Graha SIG Jl. Rasamala No. 20 Taman Yasmin Bogor
No. Terbit :2
16006 Indonesia. Phone: + 62-251- 753 2348 (hunting)
No. Revisi :0
082 111 516 516 Fax: + 62-251- 7540 927-7540-928.
Halaman : 2 dari 6
http://www.saraswanti.com

JUDUL
DIAGRAM ALIR
PENGUJIAN VITAMIN LARUT LEMAK Disahkan oleh:
(VITAMIN A, D, DAN E)
SECARA HPLC

dengan THF-etanol 95% (1:1) dan dihomogenkan

Didiamkan selama 1 jam pada suhu ruang atau selama 24 jam dalam lemari pendingin
(Larutan Standar Vitamin A 100 mg/L).

b. Larutan Standar Vitamin D3

Ditimbang 25±0.1 mg cholecalcipherol ke dalam labu ukur 25 mL

Larutkan dengan metanol, himpitkan hingga tanda tera lalu dihomogenkan.

(Larutan Standar Vitamin D3 1000 mg/L)

Dipipet 1 mL larutan standar vitamin D3 1000 mg/L ke dalam labu ukur 10 mL,
encerkan dengan pelarut hingga tanda tera, lalu dihomogenkan.
(Larutan Standar Vitamin D3 100 mg/L)

Dipipet 1 mL larutan standar vitamin D3 100 mg/L ke dalam labu ukur 10 mL,
encerkan dengan pelarut hingga tanda tera, lalu dihomogenkan.
(Larutan Standar Vitamin D3 10 mg/L)

c. Larutan Standar Vitamin E

Ditimbang 25±0.1 mg tocopherol ke dalam labu ukur 25 mL

Larutkan dengan metanol, himpitkan hingga tanda tera lalu dihomogenkan.

(Larutan Standar Vitamin E 1000 mg/L)

Dipipet 1 mL larutan standar vitamin E 1000 mg/L ke dalam labu ukur 10 mL,
encerkan dengan pelarut hingga tanda tera, lalu dihomogenkan.
(Larutan Standar Vitamin E 100 mg/L)
 INSTRUKSI KERJA
No. Instruksi : 18-5-1/MU/SMM-SIG
PT Saraswanti Indo Genetech Tanggal Terbit : 2 Februari 2015
Graha SIG Jl. Rasamala No. 20 Taman Yasmin Bogor
No. Terbit :2
16006 Indonesia. Phone: + 62-251- 753 2348 (hunting)
No. Revisi :0
082 111 516 516 Fax: + 62-251- 7540 927-7540-928.
Halaman : 3 dari 6
http://www.saraswanti.com

JUDUL
DIAGRAM ALIR
PENGUJIAN VITAMIN LARUT LEMAK Disahkan oleh:
(VITAMIN A, D, DAN E)
SECARA HPLC

1.2 Preparasi Sampel

Ditimbang sampel yang telah dihomogenkan ke dalam piala gelas 100 mL (≤ 10 gram
untuk sampel dengan lemak ≤ 40%, ≤ 2 gram untuk sampel dengan lemak tinggi,
ditambahkan 3 mL air untuk sampel yang mengandung gula tinggi, 25 mL untuk
sampel cair).

Ditambahkan etanol 95% sebanyak 40 mL untuk sampel dengan lemak ≤40%, 40 mL

untuk sampel dengan lemak tinggi, 15 mL untuk sampel cair , ditambahkan asam
pirogalat sebanyak 50 mg dan dilewatkan gas nitrogen sebelum dipanaskan.

Ditambahkan KOH 50% sebanyak 10 mL

Dikocok larutan dan dipanaskan dalam waterbath pada suhu ± 80oC

selam 45 menit, dikocok setiap 10 menit

Didinginkan larutan

Ditambahkan 10 mL asam asetat glasial, didinginkan kembali hingga suhu ruang

Larutan dipindahkan ke dalam labu ukur 100 mL, dihimpitkan larutan

dengan THF-etanol 95% (1:1) dan dihomogenkan

Didiamkan selama 1 jam pada suhu ruang atau selama 24 jam dalam lemari pendingin

Disaring larutan sampel dengan PTFE 0.45 μm ke dalam vial dan

diinjeksikan ke sistem HPLC
 INSTRUKSI KERJA
No. Instruksi : 18-5-1/MU/SMM-SIG
PT Saraswanti Indo Genetech Tanggal Terbit : 2 Februari 2015
Graha SIG Jl. Rasamala No. 20 Taman Yasmin Bogor
No. Terbit :2
16006 Indonesia. Phone: + 62-251- 753 2348 (hunting)
No. Revisi :0
082 111 516 516 Fax: + 62-251- 7540 927-7540-928.
Halaman : 4 dari 6
http://www.saraswanti.com

JUDUL
DIAGRAM ALIR
PENGUJIAN VITAMIN LARUT LEMAK Disahkan oleh:
(VITAMIN A, D, DAN E)
SECARA HPLC

1.3 Kondisi Kromatografi

Kolom : Merk, Lichrosper RP-18, 4 mm x 250 mm, 5 µm
Fase gerak : A : Aquabidest
B : Metanol
Laju alir : 1,5 mL/ menit
Volume injeksi : 20 μL
Detektor : PDA, 200-400 nm
Panjang gelombang maksimum:
Vitamin A (325 nm), Vitamin D3 (264 nm),
Vitamin E (292 nm)
Suhu kolom : Ambient
Sampling rate : 1 point/sec
Sistem : Gradien

2. Vitamin E Asetat dalam Kosmetik

2.1 Preparasi Standar

Ditimbang ± 50 mg standar α – Tocopherol Acetate ke dalam labu ukur

10 mL, dilarutkan dengan isooktan, diultrasonik hingga larut, himpitkan
hingga tanda tera, homogenkan.

Dipipet larutan standar induk ke dalam tabung 50 mL,

Deret Volume Konsentrasi
Standar pemipetan (mL) Standar (mg/L)
Std 1 0.1 5000
Std 2 0.2 5000
Std 3 0.3 5000
Std 4 0.4 5000
Std 5 0.6 5000
Std 6 0.8 5000
Std 7 1 5000

Diuapkan sampai kering dengan gas N2

Direkonstitusi dengan 10 mL N – amil alkohol

 INSTRUKSI KERJA
No. Instruksi : 18-5-1/MU/SMM-SIG
PT Saraswanti Indo Genetech Tanggal Terbit : 2 Februari 2015
Graha SIG Jl. Rasamala No. 20 Taman Yasmin Bogor
No. Terbit :2
16006 Indonesia. Phone: + 62-251- 753 2348 (hunting)
No. Revisi :0
082 111 516 516 Fax: + 62-251- 7540 927-7540-928.
Halaman : 5 dari 6
http://www.saraswanti.com

JUDUL
DIAGRAM ALIR
PENGUJIAN VITAMIN LARUT LEMAK Disahkan oleh:
(VITAMIN A, D, DAN E)
SECARA HPLC

Dipanaskan di atas penangas air suhu 60° selama 30 menit

Ditambahkan 10 mL aquabides, kocok selama 5 menit

Disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit

Diambil supernatant, disaring dengan membrane filter 0.45 µm ke dalam

vial, suntikkan ke dalam sistem HPLC

2.2 Preparasi Sampel

Ditimbang 1 gram sampel ke dalam tabung 50 mL

Ditambahkan 10 mL N – amil alkohol

Dipanaskan di atas penangas air suhu 60° selama 30 menit

Ditambahkan 10 mL aquabides, kocok selama 5 menit

Disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit

Diambil supernatant, disaring dengan membrane filter 0.45

µm ke dalam vial, suntikkan ke dalam sistem HPLC

2.3 Analisa dengan HPLC

Kolom : Merk, Lichrosper RP-18, 4 mm x 250 mm, 5 µm
Fase gerak : Metanol
Laju alir : 1 mL/ menit
Volume injeksi : 10 µL
Detektor : PDA, 277 nm
Suhu kolom : 40 ± 15°C
Sampling rate : 10 point/sec
 INSTRUKSI KERJA
No. Instruksi : 18-5-1/MU/SMM-SIG
PT Saraswanti Indo Genetech Tanggal Terbit : 2 Februari 2015
Graha SIG Jl. Rasamala No. 20 Taman Yasmin Bogor
No. Terbit :2
16006 Indonesia. Phone: + 62-251- 753 2348 (hunting)
No. Revisi :0
082 111 516 516 Fax: + 62-251- 7540 927-7540-928.
Halaman : 6 dari 6
http://www.saraswanti.com

JUDUL
DIAGRAM ALIR
PENGUJIAN VITAMIN LARUT LEMAK Disahkan oleh:
(VITAMIN A, D, DAN E)
SECARA HPLC

3. Interpretasi Hasil
3.1 Perhitungan kadar vitamin A, D3, dan E dalam bahan pangan
Perhitungan kadar vitamin A, D3, dan E dalam sampel dengan menggunakan kurva
kalibrasi yang sesuai dengan luas area yang masuk ke dalam kurva standar, dengan
persamaan garis: Y= bx + a, dengan rumus sebagai berikut :

Dimana :
A.spl = Luas area sampel
a = Intercept dari kurva kalibrasi standar
b = Slope dari kurva kalibrasi standar
Fp = Faktor pengenceran sampel
V = Volume labu akhir sampel (ml)

3.2 Perhitungan kadar vitamin E Asetat dalam kosmetik

Kadar Vitamin E asetat (ppm, mg/L, mg/Kg) = (A spl-a)/b x V (ml) x fp
W spl atau V spl

A.spl = Luas area sampel

a = Intercept dari kurva kalibrasi standar
b = Slope dari kurva kalibrasi standar
Fp = Faktor pengenceran sampel
V = Volume labu akhir sampel (ml) (10)

4. Penyimpanan Diagram Alir dan Formulir Terkait

Diagram alir ini disimpan dalam bentuk berkas dan/atau file dalam komputer dengan
status legalitas yang sama. Adapun dokumen terkait yang digunakan dalam prosedur ini
adalah :
Formulir Rekaman Pengujian HPLC No: No:18-5-1.1/F-MU/SMM-SIG