UJI AKTIVITAS ANTIMIKROBA

DENGAN METODE KIRBY-BAUER (ZONA INHIBISI)

I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Mahkluk hidup yang ada di bumi tidak hanya terdiri dari mahkluk hidup yang
dapat dilihat dengan mata. Mikroorganisme merupakan jasad hidup yang
mempunyai ukuran sangat kecil. Pada ilmu mikrobiologi ini kita mempelajari
banyak tentang jasad-jasad renik yang disebut juga dengan microba atau protista,
di mana adanya, ciri-cirinya, kekerabatan antara sesamanya seperti juga dengan
kelompok organisme lainnya, penggunaan dan peranannya dalam kesehatan serta
kesejahteraan kita. Mikroorganisme sangat erat kaitannya dengan kehidupan kita,
beberapa di antaranya bermanfaat dan yang lain merugikan. Banyak di antaranya
menjadi penghuni dalam tubuh manusia. Beberapa mikroorganisme menyebabkan
penyakit dan yang lain terlibat dalam kegiatan manusia sehari-hari seperti
misalnya pembuatan anggur, keju, yogurt, produksi penicillin, serta proses-proses
perlakuan yang berkaitan dengan pembuangan limbah.
Uji sensitivitas bakteri merupakan cara untuk mengetahui dan mendapatkan
produk alam yang berpotensi sebagai bahan anti bakteri serta mempunyai
kemampuan untuk menghambat pertumbuhan atau mematikan bakteri pada
konsentrasi yang rendah.
Metode uji sensitivitas bakteri adalah metode cara bagaimana mengetahui dan
mendapatkan produk alam yang berpotensi sebagai bahan anti bakteri serta
mempunyai kemampuan untuk menghambat pertumbuhan atau mematikan bakteri
pada konsentrasi yang rendah. Uji sentivitas bakteri merupakan suatu metode
untuk menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri dan untuk
mengetahui senyawa murni yang memiliki aktivitas antibakteri.

1.2 Tujuan
1. Mampu membuat kultur cair bakteri untuk uji aktivitas antimikroba
2. Mampu melakukan pengujian aktivitas antimikroba dengan metode Kirby-
Bauer
 3. Melatih keterampilan bekerja secara aseptik

1.3 Manfaat
1. Dapat menyediakan kultur cair bakteri untuk berbagai keperluan
2. Dapat melakukanpengujian aktivitas antimikrobadengan metode Kirby-
Bauer
3. Dapat mempelajari sifat-sifat mikroorganisme
II. TINJAUAN PUSTAKA
Antibakteri atau antimikroba adalah bahan yang dapat membunuh atau
menghambat aktivitas mikroorganisme dengan bermacam-macam cara. Senyawa
antimikroba terdiri atas beberapa kelompok berdasarkan mekanisme daya
kerjanya atau tujuan penggunaannya. Bahan antimikroba dapat secara fisik atau
kimia dan berdasarkan peruntukannya dapat berupa desinfektan, antiseptic,
sterilizer, sanitizer dan sebagainya.
Antibiotika pertama kali ditemukan oleh Alexander Fleming pada tahun
1929, yang secara kebetulan menemukan suatu zat antibakteri yang sangat efektif
yaitu penisilin. Penisilin ini pertama kali dipakai dalam ilmu kedokteran tahun
1939 oleh Chain dan Florey. antbiotik ialah suatu bahan kimia yang dikeluarkan
oleh jasadrenik/hasil sintetis semi-sintetis yang mempunyai struktur yang sama
dan zat ini dapatmerintangi/memusnahkan jasad renik lainnya.
Antibiotik yang efektif bagi banyak spesies bakteri, baik kokus, basil maupun
spiril,dikatakan mempunyai spektrum luas. Sebaliknya, suatu antibotik yang
hanya efektif untuk spesies tertentu, disebut antibiotik yang spektrumnya sempit.
Penisilin hanya efektif untuk memberantas terutama jenis kokus, oleh karena itu
penisilin dikatakan mempunyai spektrum yang sempit. Tetrasiclin efektif bagi
kokus, basil dan jenis spiril tertentu. Oleh karena itutetrasiclin dikatakan
mempunyai spektrum luas.
Metode difusi merupakan salah satu metode yang sering digunakan untuk
menguji aktivitas antimikroba, metode difusi dapat dilakukan 3 cara yaitu metode
silinder, lubang dan cakram kertas. Metode silinder yaitu meletakkan beberapa
silinder yang terbuat dari gelas atau besi tahan karat di atas media agar yang telah
diinokulasi dengan bakteri. Tiap silinder ditempatkan sedemikian rupa hingga
berdiri di atas media agar, diisi dengan larutan yang akan diuji dan diinkubasi.
Setelah diinkubasi, pertumbuhan bakteri diamati untuk melihat ada tidaknya
daerah hambatan di sekeliling silinder.
Sensitifitas menyatakan bahwa uji sentifitas bakteri merupakan suatu metode
untuk menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri dan untuk
mengetahui senyawa murni yang memiliki aktivitas antibakteri. Metode Uji
sensitivitas bakteri adalah metode cara bagaimana mengetahui dan mendapatkan
produk alam yang berpotensi sebagai bahan anti bakteri serta mempunyai
kemampuan untuk menghambat pertumbuhan atau mematikan bakteri pada
konsentrasi yang rendah. uji sentivitas bakteri merupakan suatu metode untuk
menentukan tingkat kerentanan bakteri terhadap zat antibakteri dan untuk
mengetahui senyawa murni yang memiliki aktivitas antibakteri.
Seorang ilmuan dari perancis menyatakan bahwa metode difusi agar dari
prosedur Kirby-Bauer, sering digunakan untuk mengetahui sensitivitas bakteri.
Prinsip dari metode ini adalah penghambatan terhadap pertumbuhan
mikroorganisme, yaitu zona hambatan akan terlihat sebagai daerah jernih di
sekitar cakram kertas yang mengandung zat antibakteri. Diameter zona hambatan
pertumbuhan bakteri menunjukkan sensitivitas bakteri terhadap zat antibakteri.
Selanjutnya dikatakan bahwa semakin lebar diameter zona hambatan yang
terbentuk bakteri tersebut semakin sensitive.
Pada umumnya metode yang dipergunakan dalam uji sensitivitas bakteri
adalah metode Difusi Agar yaitu dengan cara mengamati daya hambat
pertumbuhan mikroorganisme oleh ekstrak yang diketahui dari daerah di sekitar
kertas cakram (paper disk) yang tidak ditumbuhi oleh mikroorganisme. Zona
hambatan pertumbuhan inilah yang menunjukkan sensitivitas bakteri terhadap
bahan anti bakteri.
Tujuan dari proses uji sensisitivitas ini adalah untuk mengetahui obat-obat
yang paling cocok (paling poten) untuk kuman penyebab penyakit terutama pada
kasus-kasus penyakit yang kronis dan untuk mengetahui adanya resistensi
terhadap berbagai macam antibiotik. Penyebab kuman resisten terhadap antibiotik
yakni memang kuman tersebut resisten terhadap antibiotik yang diberikan, akibat
pemberian dosis dibawah dosis pengobatan dan akibat penghentian obat sebelum
kuman tersebut betul-betul terbunuh oleh antibiotik.
Antibiotik adalah zat-zat kimia yang dihasilkan oleh fungi dan bakteri yang
memiliki khasiat mematikan atau menghambat pertumbuhan kuman-kuman
sedangkan toksisitasnya bagi manusia relatif kecil. Para peneliti diseluruh dunia
memperoleh banyak zat lain dengan khasiat antibiotik namun berhubung dengan
adanya sifat toksis bagi manusia, hanya sebagian kecil saja yang dapat digunakan
sebagai obat diantaranya adalah streptomycin vial injeksi, Tetrasiklin kapsul,
Kanamicin kapsul, Erytromicin kapsul, Colistin tablet, Cefadroxil tablet dan
Rifampisin kapsul.
Kegiatan antibiotika untuk pertama kalinya ditemukan oleh sarjana Inggris dr.
Alexander Flemming pada tahun 1928 (penisilin). Penemuan ini baru
dikembangkan dan dipergunakan dalam terapi di tahun 1941 oleh dr.Florey
(Oxford) yang kemudian banyak zat lain dengan khasiat antibiotik diisolir oleh
penyelidik-penyelidik di seluruh dunia, akan tetapi berhubung dengan sifat
toksisnya hanya beberapa saja yang dapat digunakan sebagai obat.
Antibiotik digunakan untuk membasmi mikroba penyebab terjadinya infeksi.
Gejala infeksi terjadi akibat gangguan langsung oleh mikroba dan berbagai zat
toksik yang dihasilkan mikroba. Pada dasarnya suatu infeksi dapat ditangani oleh
sistem pertahanan tubuh, namun adakalanya sistem ini perlu ditunjang oleh
penggunaan antibiotik. Antibiotik yang digunakan untuk membasni mikroba
penyebab infeksi pada manusia, harus memiliki sifat toksisitas selektif. Artinya
antibiotik harus bersifat toksik untuk mikroba, tetapi relatif tidak toksik untuk
hospes. Toksisitas selektif tergantung kepada struktur yang dimiliki sel bakteri
dan manusia misalnya dinding sel bakteri yang tidak dimiliki oleh sel manusia,
sehingga antibiotik dengan mekanisme kegiatan pada dinding sel bakteri
mempunyai toksisitas selektif relatif tinggi.
Sensitivitas bakteri terhadap antibiotik tergantung kapada kemampuan
antibiotik tersebut untuk menembus dinding sel bakteri. Antibiotik lebih banyak
yang efektif bekerja terhadap bakteri Gram positif karena permeabilitas dinding
selnya lebih tinggi dibandingkan bakteri Gram negatif. Jadi spektrum akansempit
apabila mampu menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif.
Zona Hambat merupakan tempat dimana bakteri terhamabat pertumbuhannya
akibat antibakteri atau antimikroba. Zona hambat adalah daerah untuk
menghambat pertumbuhan mikroorrganisme pada media agar oleh antibiotik.
Contohnya: tetracycline, erytromycin, dan streptomycin. Tetracycline merupakan
antibiotik yang memiliki spektrum yang luas sehingga dapat menghambat
pertumbuhan bakteri secara luas.
III. METODE KERJA
3.1 Alat dan Fungsinya
No Alat Fungsi
1. Autoklaf Alat sterilisasi
2. Cawan petri(petridish) Wadah menumbuhkan biakan
3. Tabung reaksi Tempat medium PDA
4. Kasa dan Kapas Menutup tabung reaksi
5. Aluminium foil Menutup wadah tempat medium
6. Kaca arloji Wadah untuk menimbang bahan
7. Corong Menyaring
8. Jarum ose Mengambil dan memindahkan biakan
9. Erlenmeyer Wadah media
10. Spatula Menghomogenkan larutan
11. Magnetik barr Menghomogenkan larutan
12. Lampu spritus Membakar jarum ose
13. Inkubator Menginkubasi biakan
14. Tabung Eppendoft Tempat larutan
15. Spektrofotomer Untuk mengukur nilai absorban
16. Hot plate Pemanas
3.2 Bahan dan Kegunaannya
No Bahan Fungsi
1. Ekstrak daging Sumber protein
2. Akuadest Pelarut
3. Stock gliserol E. Coli Bakteri yang digunakan
4. Stock gliserol S. Aureus Bakteri yang digunakan
5. Tepung Tapioka Pemadat dan nutrien
6. Bakteri dan jamur Mikroba yang akan dibiakkan
7. Aquades Pelarut
8. Agar Pemadat dan nutrien
9. Pepton Sumber nitrogen
3.3 Skema Kerja
IV. PENGAMATAN DAN HASIL
4.1 Hasil dan Pengamatan
 Bakteri S. Aureus
Sampel PengamatanZonaInhibisi
24 Jam 48 Jam 72 Jam
Kontrol 4B O,9 cm O,9 cm 1 cm
Kontrol1B O,9 cm O,9 cm 1 cm
KontrolNegatif 1,1 cm 1,2 cm 1,2 cm

 BakteriE. Coli
Sampel PengamatanZonaInhibisi
24 Jam 48 Jam 72 Jam
Kontrol 4B 0,9 cm 1,2 cm 1,2cm
Kontrol 1B 1 cm 1cm 1,1cm
KontrolNegatif 1 cm 1cm 1,2 cm
V. DISKUSI
Padapraktikum kali ini dengan judul uji aktivitas antimikroba dengan metode
kirby-bauer (zona inhibisi). Diman tujuan dari praktikum kali ini yaitu mampu
membuat kultur cair bakteri untuk uji aktivitas antimikroba, mampu melakukan
pengujian aktivitas antimikroba dengan metode Kirby-Bauer serta melatih
keterampilan bekerja secara aseptic.
Dalam hal ini, menggunakan ekstrak daging sebagai sumber protein. Dimana
ekstrak daging yang digunakan dihaluskan terlebih dahulu sebelum dipanaskan.
Tujuan dihaluskan sebelum dipanaskan yaitu untuk memperluas permukaan
sehingga mempercepat proses terjadinya interaksi antara air dengan ekstrak
daging. Dari ekstrak daging yang digunakan, diperlukan yaitu kaldunya yang kaya
akan protein.
Pembuatan kultur cair bakteri dilakukan didalam tabung reaksi secara aseptik.
Dengan demikian akan meminimalisir terjadinya kontaminasi. Bakteri yang
digunakan yaitu E. coli dan S. aureus dari stok gliserol. Pertumbuhan bakteri
diamati dengan menggunakan standard McFarland 0,5. Sehingga didapatkan
kekeruhan dari bakteri yang dibuat akan sama dengan standard McFarland 0,5.
Media yang digunakan dalam praktikum kali ini yaitu media Mueller-Hinton
agar. Dimana pada media Mueller-Hinton agar, menggunakan agar sebagai
pemadat, dan bahan bahan lain seperti kaldu ektrakmdaging sebagai sumber
protein, pepton sebagai sumber nitrogen dan tepung tapioca. Pengerjaan
pembuatan media Mueller-Hinton agar dilakukan secara aseptik. Ini ditandai
dilakukan sterilisasi terhadap medium kaca yang digunakan dengan melakukan
autoclave. Prinsip dari autoclave itu sendiri yaitu hampir sama dengan
pengukusan atau penguapan media yang digunakan dengan air mendidih. Namun,
suhu yang digunakan lebih tinggi dibanding dengan pengukusan.
Setelah dilakukan autoclave, didapatkan media yang dibuat didalam tabung
reaksi akan berwarna bening dan telah agak keras. Ini dipengaruhi oleh komposisi
agar, sehingga jika komposisi agar banyak, maka akan memudahkan untuk
mengeras. Sehingga untuk melelehkannya lagi perlu dipanaskan.
Dari hasilpengamatan, dapatdilihatjugapada medium cair,
dimanasebelumpenambahanbakteriberwarnabeningsedangkansetelahpenambahan
bakteri
berubahmenjadiagakkeruh.Kekeruhaninimembuktikanadanyapertumbuhanbakteri
E.colipada
medium.Jadizonabeningditentukanuntukmengetahuiterhambatnyapertumbuhanmi
kroorganismedimanasemakinbesardiameter
zonabeningmakapertumbuhanmikroorganisme yang
terhambatsemakinbanyakjuga.
Disini untuk melihat perbedaan dilakukan dengan variasiwaktu inkubasi,
dimanauntuk bakteri S. Aureus didapatkan diameter zonabening pada waktu 24
dan 48 jam adalah0,9 cm untuk Kontrol 4B dan 1B sedangkan untuk 72 jam
didapat yaitu 1 cm. Untuk kontrol negatif, dengan waktu 24 jam didapat
diameternya yaitu 1,1 cm dan 1,2 cm untuk waktu 48 dan 72 jam.
Untuk bakteri E coli didapatkan diameter zonabening pada waktu 24 dan 48
jam adalah1 cm untuk Kontrol 1B dan negatifsedangkan untuk 72 jam didapat
yaitu 1,1 dan 1,2 cm. Untuk kontrol 4B, dengan waktu 24 jam didapat
diameternya yaitu 0,9 cm dan 1,2 cm untuk waktu 48 dan 72 jam.
Dari hasil data tersebut, dapat teramati bahwa dengansemakin lama waktu
inkubasi maka diameter zonabeningakansemakinbesar.
VI. KESIMPULAN DAN SARAN
6.1 Kesimpulan
Dari praktikum yang telah dilakukan, dapat diambil kesimpulan yaitu :
1. Metode yang digunakan dalam uji antimikroba yaitu metode Kirby-Bauer
2. Media yang digunakan dibuat dengan metode media Mueller-Hinton agar
dimana menggunakan agar sebagai pemadat, dan bahan bahan lain seperti
kaldu ektrakmdaging sebagai sumber protein, pepton sebagai sumber
nitrogen dan tepung tapioca.
3. Bakteri yang digunakan yaitu E. coli dan S. aureus dari stok gliserol. Dan
pertumbuhan bakteri diamati dengan menggunakan standard McFarland
0,5.
4. Diameter zona bening untuk bakteri S. Aureus pada waktu 24 dan 48 jam
adalah 0,9 cm untuk Kontrol 4B dan 1B sedangkan untuk 72 jam yaitu 1
cm. Untuk kontrol negatif, dengan waktu 24 jam diameternya yaitu 1,1 cm
dan 1,2 cm untuk waktu 48 dan 72 jam.
5. Diameter zona bening E coli pada waktu 24 dan 48 jam adalah 1 cm untuk
Kontrol 1B dan negatif sedangkan untuk 72 jam yaitu 1,1 dan 1,2 cm.
Untuk kontrol 4B, dengan waktu 24 jam diameternya yaitu 0,9 cm dan 1,2
cm untuk waktu 48 dan 72 jam.
6. Dengan semakin lama waktu inkubasi maka diameter zona bening akan
semakin besar.

6.2 Saran
Dari praktikum yang telah dilakukan, disarankan untuk kedepan yaitu :
1. Bekerjalahsecarasterildanaseptik.
2. Telitidalammemvariasikanwaktu.
3. Fokusdankonsentrasidalambekerja.
 DAFTAR PUSTAKA
Djide, M.N, 2003. Mikrobiologi Farmasi.Jurusan Farmasi Unhas: Makassar.

Dwidjoseputro, D.1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta.

Gaman, P. M dan Sherrington, K. B. 1992. Ilmu Pangan : Pengantar Ilmu

Pangan, Nutrisi, dan Mikrobiologi, Edisi Kedua. Yogyakarta: UGM – Press.

Ganiswarna, S.G, 1995. Farmakologi dan Terapi Edisi 4. Bagian Farmakologi.

Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia: Jakarta.

Jawetz, G., Melnick, J. L., dan Adelberg, E. A. 1991. Mikrobiologi untuk Profesi
Kesehatan. Jakarta: EGC.

Pelczar, Michael J, 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. UI-Press: Jakarta.

Sumadio, H., dan Harahap, 1994. Biokimia dan Farmakologi Antibiotika. USU
Press: Medan.
Lampiran 1. Tugas Praktikum
1. Tujuan Praktikum Objek 2
 Mampu membuat kultur cair bakteri untuk uji aktivitas antimikroba
 Mampu melakukan pengujian aktivitas antimikroba dengan metode Kirby-
Bauer
 Melatih keterampilan bekerja secara aseptic

2. Nutien untuk pertumbuhan Mikroorganisme

Sumber sumber nutrien untuk pertumbuhan mikroorganisme yaitu : karbon,
nitrogen, hidrogen, oksigen, sulfur, fosfor, zat besi dan sejumlah kecil logam
lainnya.

3. Klasifikasi Mikroorganisme
Berikut ini klasifikasi mikroorganismeSpesies, genus, famili, ordo, kelas, filum
atau devisi dan dunia.

4. Perbedaan bakteri gram + dan gram –

Perbedaan Bakteri gram + Bakteri gram -

Lebih tebal (20-

Dinding sel 80nm)1-4 % Lebih tipis11-22 %

Bulat, ova, batang

lurus atau melingkar
seperti tanda koma,
heliks atau filament,
Bulat, batang atau beberapa mempunyai
Bentuk sel filamen selubung atau kapsul

Pembelahan biner,
kadang-kadang
Reproduksi Pembelahan biner pertunasan

Metabolisme Kemoorganoheterotrof Fototrof,

 kemolitoautotrof, atau
kemoorganoheterotrof

Kebutuhan nutrient Kompleks Relatif sederhana

Ketahanan terhadap
perlakuan fisik Lebih tahan Kurang tahan

5. Kemampuan antimikroba suatu zat

Kemampuan antimikroba yaitu dapat menghambat pertumbuhan bakteri
disebut bakteriostatik dan yang dapat membunuh bakteri disebut bakterisida,
atau dengan kata lain disebut juga antiboitika yaitu bahan-bahan yang
bersumber hayati yang pada kadar rendah sudah menghambat pertumbuhan
mikroorganisme hidup

6. Metoda metoda untuk uji antimikroba

Metoda untuk uji antimikroba antara lain metode dilusi, metode turbidimetri
dan metode difusi

7. Alur kerja objek 2

Pada praktikum objek 2, berikut ini alur kerjanya :
- Pembuatan estrak daging
- Pembuatan kultur cair nakteri untuk uji antimikroba
- Pembuatan media Mueller hinton agar
- Teknik pemindahan mikroorganisme secara aseptic dengan metode
spreading (untuk pengujian senyawa antimikroba dengan metoda zona
inhibisi)

8. Perkiraan hasil yang akan diperoleh

Data yang diperoleh dari hasil praktikum berupa diameter dari zona bening
yang terbentuk.

Lampiran 2. Foto Praktikum

 Gambar 1. Media Mueller hinton
agarsebelum dilakukan sterilisasi dengan autoclave

Gambar 2. Pengujian antimikroba terhadap media Mueller hinton agar yang telah
disterilisasi dengan autoclave