PENGECATAN GRAM

Oleh: Shofyatul Yumna Triyana

Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di

laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi
mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap
pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal.
Pemeriksaan ini dapat dilakukan dengan cepat dan biaya murah serta, dalam kasus
tertentu, dapat membantu dokter untuk memulai terapi suatu penyakit tanpa menunggu
hasil kultur.
Metode pengecatan tersebut pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada
tahun 1884. Dengan metode pengecatan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi
dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri
terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi
dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada
mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp.

PERSIAPAN

Sebelum dilakukan pengecatan Gram, tentu harus disiapkan bahan (spesimen)

yang akan diperiksa. Bahan yang akan diperiksa, dapat berasal dari : 1) langsung dari
penderita dapat berupa sputum (dahak), pus (nanah), discharge telinga, discharge
hidung, urin dan cairan serebrospinal.
Spesimen yang akan dicat, sebelumnya dibuat sediaan atau preparat (smear)
terlebih dulu. Pengertian preparat adalah sampel spesimen yang diletakkan atau
dioleskan pada permukaan gelas obyek (object glass) atau slides, dengan atau tanpa
pewarnaan, yang selanjutnya dapat diamati di bawah mikroskop.

a. Pembuatan preparat

Alat dan bahan yang diperlukan adalah :

Alat :
 Ose atau kapas lidi steril
 Gelas obyek
 Lampu spiritus
Bahan :
 Bahan yang akan diperiksa.

Untuk bahan yang berbeda, memerlukan cara pembuatan preparat yang

berbeda pula. Berikut cara pembuatan preparat untuk berbagai sumber bahan.
a.1. Bahan langsung dari penderita
Bahan disentrifuge terlebih dulu, kemudian endapannya dibuat preparat. Bahan
yang berupa endapan (pellet) hasil sentrifuge tersebut diambil dengan ose steril atau
kapas lidi steril kemudian digoreskan pada gelas obyek setipis mungkin. Panaskan
gelas obyek di atas nyala api lampu spiritus sambil diayunkan secukupnya (jarak
preparat sampai nyala api kira-kira 20 cm), sampai preparat tersebut kering. Setelah
kering, teteskan formalin 1 % tunggu selama 5 menit dan keringkan sekali lagi. Setelah
betul-betul kering, preparat siap dicat.

a.2. Bahan dari biakan cair

 Ambil gelas obyek yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak dengan
memanaskan di atas nyala api spiritus. Ambil kuman dari biakan cair (yang sebelumnya
telah diaduk secara steril) dengan menggunakan ose steril, ratakan pada gelas obyek
sehingga membentuk diameter kira-kira 1-2 cm. Preparat yang sudah dibuat kemudian
dikeringkan dan ditetesi formalin dengan cara seperti pembuatan preparat langsung.

a.3. Bahan dari media pertumbuhan padat

Ambil gelas obyek yang bersih dan steril, bebaskan dari lemak dengan
memanaskan di atas nyala api spiritus. Teteskan satu ose kaldu atau NaCl pada gelas
obyek tersebut. Dengan ose steril, ambil satu koloni kuman dan ratakan pada gelas
obyek sehingga membentuk diameter 1 – 2 cm, campur dengan kaldu tadi sampai
homogen kemudian tipiskan. Selanjutnya dikerjakan sebagaimana membuat preparat
dengan bahan berasal dari penderita.

Prinsip yang selalu harus diingat dan dipatuhi adalah :

 Selalu mensterilkan ose, pada saat akan dipakai dan setelah dipakai.
 Letakkan ose pada tempatnya, jangan diletakkan di sembarang tempat (misal di
atas meja)
 Jangan memegang mata (ujung) ose dengan tangan.
 Usahakan tidak banyak bicara pada saat kerja.

b. Cat Gram
Cat Gram yang digunakan terdiri dari 4 macam, yaitu cat Gram A, B, C dan D.
Masing-masing mempunyai komposisi dan fungsi yang berbeda. Komposisi dan fungsi
masing-masing cat Gram, adalah sebagai berikut :
1. Cat Gram A
Cat ini terdiri atas :
Kristal violet : 2 gram
Etil alkohol 95 : 20 ml
Ammonium oksalat : 0,8 gram
Akuades : 80 ml
Cat Gram A berwarna ungu (karena mengandung kristal violet). Cat Gram A merupakan
cat primer yang akan memberi warna mikroorganisme target. Pada saat diberi cat ini,
semua mikroorganisme akan berwarna ungu sesuai warna cat Gram A.
2. Cat Gram B
Cat ini terdiri atas :
Yodium : 1 gram
Kalium Yodida : 2 gram
Akuades : 300 ml
Cat Gram B berwarna coklat. Cat Gram B merupakan cat Mordan, yaitu cat atau bahan
kimia yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap mikroorganisme target. Akibat
pemberian cat Gram B, maka pengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat).
3. Cat Gram C
Cat ini terdiri atas :
Aseton : 50 ml
Etil alkohol 95 % : 50 ml
Cat Gram C tidak berwarna. Cat ini berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya.
Akibat pemberian cat C akan terjadi 2 kemungkinan :
 Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu, karena tahan terhadap
alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteri tidak dilunturkan oleh alkohol. Bakteri
yang bersifat demikian disebut bakteri Gram positif.
  Bakteri akan tidak berwarna, karena tidak tahan terhadap alkohol. Ikatan antara
cat dengan bakteri dilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikian
dikelompokkan sebagai bakteri Gram negatif.
4. Cat Gram D
Cat Gram D terdiri atas :
Safranin : 0,25 gram
Etil alkohol 95 % : 10 ml
Akuades : 90 ml
Cat ini berwarna merah. Cat ini merupakan cat sekunder atau kontras. Cat ini berfungsi
untuk memberikan warna mikroorganisme non target. Cat sekunder mempunyai
spektrum warna yang berbeda dari cat primer. Akibat pemberian cat Gram D, akan
terjadi 2 kemungkinan :
 Bakteri Gram positif akan tetap berwarna ungu, karena telah jenuh mengikat cat
Gram A sehingga tidak mampu lagi mengikat cat Gram D.
 Bakteri Gram negatif akan berwarna merah, karena cat sebelumnya telah
dilunturkan oleh cat Gram C maka akan mampu mengikat cat Gram D.

Dasar teori cat Gram

Berdasarkan sifat terhadap cat Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi 2
yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif. Terdapat dua teori yang dapat menjelaskan
dasar perbedaan ini yaitu :
1. Teori Salton
Teori ini berdasarkan kadar lipid yang tinggi (20 %) di dalam dinding sel bakteri
Gram negatif. Zat lipid ini akan larut selama pencucian dengan alkohol. Pori-pori pada
dinding sel membesar, sehingga zat warna yang sudah diserap mudah dilepaskan dan
bakteri menjadi tidak berwarna.
Bakteri Gram positif mengalami denaturasi protein pada dinding selnya akibat
pencucian dengan alkohol. Protein menjadi keras dan beku, pori-pori mengecil
sehingga kompleks kristal yodium yang berwarna ungu dipertahankan dan bakteri akan
tetap berwarna ungu.
2. Teori permeabilitas dinding sel
Teori ini berdasarkan tebal tipisnya lapisan peptidoglikan dalam dinding sel.
Bakteri Gram positif mempunyai susunan dinding yang kompak dengan lapisan
peptidoglikan yang terdiri dari 30 lapisan. Permeabilitas dinding sel kurang, dan
kompleks kristal yodium tidak dapat keluar.
Bakteri Gram negatif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis, hanya 1 – 2
lapisan dan susunan dinding selnya tidak kompak. Permeabilitas dinding sel lebih besar
sehingga masih memungkinkan terlepasnya kompleks kristal yodium.

CARA PENGECATAN GRAM

Sebelum melakukan pengecatan Gram, siapkan alat dan bahan yang diperlukan.
Pastikan semua alat dan bahan yang diperlukan serta tempat untuk mencuci terletak di
tempat yang terjangkau. Jangan sampai terlalu jauh sehingga menyulitkan dan
memakan waktu.
Alat dan bahan yang diperlukan adalah :
Alat :
 Rak pengecatan
 Kran/sumber air yang mengalir
Bahan :
 Cat Gram A, B, C dan D
 Preparat yang telah siap untuk dicat
Skema cara pengecatan Gram :

Preparat yang telah siap dicat, digenangi

dengan cat Gram A selama 1 – 3 menit

Cat dibuang, lalu preparat dicuci

dengan air mengalir

Preparat digenangi cat Gram B

selama 0,5 – 1 menit

Cat dibuang, lalu preparat dicuci

dengan air mengalir

Preparat ditetesi dengan cat Gram C

sampai warna cat tepat dilunturkan.

Cat dibuang, lalu preparat dicuci

dengan air mengalir

Preparat digenangi dengan cat

Gram D selama 1 – 2 menit

Sisa cat dibuang lalu preparat

dikeringkan di udara

Preparat siap diamati

dibawah mikroskop

KELEBIHAN DAN KEKURANGAN PENGECATAN GRAM

Kelebihan :
1. Pengecatan Gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi
antibiotik, sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan tes
 kepekaan bakteri terhadap antibiotik). Hal ini karena bakteri Gram positif dan
negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika.
2. Kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat Gram mempunyai makna
diagnostik. Misalnya pada pemeriksaan Gram ditemukan Gram negatif diplococci
intraseluler dari spesimen pus (nana) uretral, maka memberikan presumptive
diagnosis untuk penyakit infeksi gonore.
Kekurangan :
Pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih
dari 104 per ml. Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya
cairan serebrospinal, memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk
mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. Pellet (endapan hasil sentrifuge)
kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis.

Pustaka acuan :

Nirwati, Hera, _______, Pembuatan Preparat dan Pengecatan dalam Petunjuk

Praktikum Mikrobiologi, Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran
Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
Strohl, William A, Rouse,H, Fisher, BD, 2001, Lippincott’s Illustrated Reviews:
Microbiology, Lippincott William & Wilkins, USA