IDENTIFIKASI KANDUNGAN ASAM AMINO PADA SAMPEL DENGAN

MENGGUNAKAN TEKNIK KROMATOGRAFI KERTAS

Ni Nyoman Trisna Yanti

Program Studi Analis Kimia, Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Pendidikan Ganesha

E-mail : trisnayanti243@gmail.com

ABSTRAK

Praktikum identifikasi kandungan asam amino pada sampel dengan

menggunakan teknik kromatografi kertas dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui
perbandingan koefisien distribusi (Rf) dari berbagai asam amino terutama alanin,
glisin, leusin, dan triptofan serta menentukan kandungan asam amino pada sampel
melalui kromatografi kertas dengan teknik ascending. Metode yang digunakan adalah
metode kualitatif dengan prinsip kerja kromatografi kertas. Hasil percobaan
menunjukkan harga Rf dengan eluen n-butanol, aquadest dan asam asetat glasial
adalah sebagai berikut; Rf sampel alanin 0.43, Rf sampel glisin 0.33, Rf sampel
leusin 0.91 dan Rf sampel triptofan 0.80. Untuk harga Rf dengan eluen fenol dan
aquadest adalah sebagai berikut; Rf sampel alanin 0.93, Rf sampel glisin 0.90, Rf
sampel leusin 0.94 dan Rf sampel triptofan 0.66.
Kata kunci : asam amino, eluen, kromatografi kertas, Rf
ABSTRACT
Practicum identification of amino acid content in the sample using paper
chromatography techniques was carried out in order to determine the ratio of the
distribution coefficient (Rf) of various amino acids, especially alanine, glycine,
leucine, and tryptophan and determine the amino acid content in the sample via
paper chromatography with ascending techniques. The method used is a qualitative
method with the working principle of paper chromatography. The results showed that
the Rf price with n-butanol, aquadest and glacial acetic acid eluents were as follows:
the alanine sample Rf was 0.43, glycine sample Rf was 0.33, 0.91 leucine Rf sample
and 0.80 tryptophan sample. The price of Rf with phenol and aquadest eluent was as
follows: the Rf of the alanine sample was 0.93, the Rf of the glycine sample was 0.90,
the Rf of the leucine sample was 0.94, and the Rf of the tryptophan sample was 0.66.

Keywords: amino acids, eluents, paper chromatography, Rf

I. PENDAHULUAN
Asam amino adalah senyawa
yang mempunyai rumus umum
+
H3NCH – (R) COO-, bersifat ion dan
hidrofil. Asam-asam amino saling
berbeda gugus R-nya. Ada sekitar 20
macam asam amino penting yang
merupakan pembentuk protein dan
disebut asam amino hidrolisat, seperti
Alanin (Ala), Arginin (Arg), Sistein
(Sis), Glutamin (Gln), Asam glutamat
(Glu), Glisin (Gly), Histidin (His),
Isoleusin (Leu), Lisin (Lys), Metionin
(Met), Fenilalanin (Phe), Prolin (Pro),
Serin (Ser), Treonin (Thr), Triptofan
(Trp) Tirosin (Tyr), dan Valin (Val).
Cara analisis asam amino yang masih
lazim digunakan sampai saat ini adalah
kromatografi dengan berbagai macam
teknik seperti kromatografi kertas,
lapis tipis, dan kolom.
Kromatografi adalah salah satu
metode pemisahan kimia yang
didasarkan pada adanya perbedaan
partisi zat pada fase diam (stationary
phase) dan fase gerak (mobile phase).
Fase gerak membawa zat terlarut
lainnya yang terelusi lebih awal atau
lebih akhir. Fase diam dapat bertindak
sebagai penyerap, seperti alumina dan
silika gel atau dapat bertindak
melarutkan zat terlarut sehingga terjadi
partisi antara fase diam dan fase gerak.
Dalam proses ini suatu lapisan cairan
pada penyangga yang inert berfungsi
sebagai fase diam.
Dalam kromatografi selalu
terdapat salah satu kecenderungan
sebagai berikut; (a) kecenderungan
molekul-molekul komponen untuk
melarut dalam cairan; (b)
kecenderungan molekul-molekul
komponen untuk melekat pada
permukaan padatan halus; (c)
kecenderungan molekul-molekul
komponen untuk bereaksi secara kimia
(penukar ion); (d) kecenderungan
molekul-molekul terelusi pada pori-
pori fasa diam. Pemisahan terjadi
berdasarkan perbedaan migrasi zat-zat
yang menyusun suatu sampel. Hasil
pemisahan dapat digunakan untuk
keperluan identifikasi untuk analisis
kualitatif, penetapan kadar untuk
analisis kuantitatif, pemurnian suatu
senyawa (Soebagio, dkk, dalam
Tika,2010).
Kromatografi kertas
dapat digunakan untuk
mengidentifikasi asam amino yang
terdapat dalam suatu sampel. Hal ini
pertama kali dilakukan oleh seorang
kimiawan Inggris Richard Laurence
Millington Synge (1914-1994).
Senyawa kompleks yang tersusun atas
asam amino dapat disederhanakan
dengan menggunakan metode
kromatografi kertas. Saat campuran
asam amino menaiki lembaran kertas
secara vertical karena ada fenomena
kapiler, partisi asam amino antara fasa
mobil dan fase diam (air) yang
teradsorbsi pada seulosa berlangsung
berulang-ulang. Ketika pelarut
mencapai ujung atas kertas proses
dihentikan. Setiap asam amino
bergerak dari titik awal sepanjang
jarak tertentu. Dari nilai Rf, masing-
masing asam amino dapat
diidentifikasi.
Setiap komponen memiliki
harga Rf tertentu. Besaran Rf
merupakan derajat retensi suatu
komponen dalam fasa diam. Karena
itu, Rf juga disebut dengan faktor
retensi. Harga Rf dapat dihitung
dengan jarak yang ditempuh oleh
komponen dibagi dengan jarak tempuh
eluen (Tika,2010).
jarak yang ditempuh komponen dari garis dasar
Rf
Jarak yang ditempuh eluen dari garis dasar
II. METODE
Metode yang digunakan adalah
dengan melakukan percobaan
kualitatif di laboratorium. Percobaan
identifikasi kandungan asam amino
pada sampel dengan menggunakan
teknik kromatografi kertas ini
dilakukan di Laboratorium Analis
Kimia Program Studi Analis Kimia,
Universitas Pendidikan Ganesha
Singaraja pada tanggal 21 September
2018.
Alat
Alat-alat yang digunakan
dalam praktikum ini adalah pipa
kapiler (4 buah), ruang kromatografi (1
buah), gelas kimia 250 mL (1 buah),
gelas kimia 100 mL (1 buah), batang
pengaduk (2 buah), spatula (1 buah),
penggaris (1 buah), gunting (1 buah),
pinset (1 buah), pensil (1 buah), pipet
tetes (2 buah), alat pengering (1 buah),
money detector (1 buah), corong pisah
250 mL (1 buah) dan statif dan klem (1
buah).
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan
dalam praktikum ini adalah kertas
kromatografi, larutan n-butanol (100
mL), asam asetat glacial (24 mL),
larutan sampel alanin, glisin, leusin,
triptofan (masing-masing 2 mL),
larutan Ninhidrin, aquadest (200 mL),
dan fenol 2,5 % (20 mL).
Prosedur kerja
a. Pembuatan Larutan Eluen
Campuran n-Butanol
Sebanyak 100 mL larutan n-
butanol ditambahkan 100 mL aquadest
dan 24 mL asam asetat glacial. Ketiga
larutan tersebut ditempatkan ke dalam
corong pisah dan dikocok. Kedua
lapisan yang terbentuk kemudian
dipisahkan.
b. Penyiapan Kertas Kromatografi
Kertas kromatografi disiapkan
dengan ukuran yang disesuaikan
dengan wadah kromatografi. Pada
bagian dari tepi bawah kertas ditandai
sekitar 1,5 cm dengan menggunakan
pensil.
c. Proses Kromatografi dengan
Menggunakan Eluen Fenol
Kertas kromatografi dengan
ukuran 8,5 x 10 cm ditotolkan dengan
larutan sampel yaitu larutan alanin,
glisin, leusin, triptofan dengan
menggunakan pipet kapiler. Jarak
totolan antara satu dengan yang lain
adalah 1,5 cm. Perlu diperhatikan tiap
tetesan harus dikeringkan terlebih
dahulu dengan diangin-anginkan
sebelum tetesan berikutnya ditotolkan.
Besar noda hendaknya jangan melebihi
0,4 cm. Kertas dijaga bersih dan
sedapatnya tidak tersentuh jari.
Selanjutnya, kertas digantungkan
dalam ruang kromatografi yang sudah
berisi eluen (fenol: aquadest) yang
sudah dijenuhkan selama beberapa jam
agar elusi dapat berjalan. Setelah
larutan elusi berjalan kurang lebih 10
cm dari batas sampel, elusi dihentikan
dan kertas kromatografi dikeluarkan
dari ruang kromatografi. Kemudian
batas larutan ditandai dengan pensil
dan kertas kromatografi dikeringkan
menggunakan alat pengering. Setelah
itu, kertas yang telah dikeringkan
disemprot dengan larutan ninhidrin
yang selanjutnya dikeringkan kembali
dengan alat pengering. Kemudian
dilihat noda-noda yang terbentuk
menggunakan alat money detector dan
diukur jarak eluen dengan jarak warna
yang dibentuk. Sehingga diperoleh
nilai Rf.
d. Proses Kromatografi dengan
Menggunakan Eluen Campuran n-
Butanol, Aquadest dan Asam Asetat
Glasial
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil pengamatan
 Eluen ( Fenol 20 mL : Aquadest 8 mL)
Jarak tempuh ( cm)
No Sampel
Eluen
Kertas kromatografi disiapkan
dengan ukuran 8,5 x 10 cm dan
ditandai dengan pensil 1,5 cm dari tepi
bawah. Kemudian dengan pipa kapiler
ditotolkan larutan sampel (larutan
alanin, glisin, leusin, triptofan) dengan
jarak 1,5 cm. larutan ujung terletak 2
cm dari pinggir kertas. Setiap totolan
sampel satu dengan yang lain
diberikan jarak yang cukup.
Sedangkan besar noda tidak melebihi
diameter 0,4 cm. Kemudian kertas
bersih dan sedapat mungkin jangan
disentuh oleh jari, maka digunakan
pinset. Setelah ruang kromatografi
telah jenuh oleh uap eluen maka kertas
tersebut digantungkan dalam ruang
kromatografi dan dicelupkan tepi
bawah kertas kromatografi dalam
eluen. Elusi sampel kira-kira eluen
menempuh jarak 10 cm. setelah itu
elusi dihentikan dan ditandai jarak
noda yang terbentuk setelah elusi oleh
eluen dengan pensil. Kertas
kromatografi selanjutnya dikeringkan
menggunakan alat penggaris. Lalu
kertas disemprotkan dengan larurtan
ninhidrin dan dikeringkan kembali
menggunakan alat pengering selama 5
menit. Noda-noda asam amino akan
terlihat. Selanjutnya dapat dihitung
harga Rf nya.
Nilai Rf Warna noda
Noda
 1 Larutan Triptofan 8,3 5,5 0,66 Violet
2 Larutan Leusin 8,3 7,8 0,94 Violet
3 Larutan Alanin 8,3 7,7 0,93 Violet
4 Larutan Glisin 8,3 7,5 0,90 Violet

 Eluen (100 mL n-butanol : 100 mL aquadest : 24 mL asam asetat glasial)

Jarak tempuh ( cm)
No Sampel Nilai Rf Warna noda
Eluen Noda
1 Larutan Triptofan 8,5 6,8 0,80 Violet
2 Larutan Leusin 8,5 7,7 0,91 Violet
3 Larutan Alanin 8,5 3,7 0,43 Violet
4 Larutan Glisin 8,5 2,8 0,33 Violet

Pembahasan asam asetat glacial dan air bersifat

Percobaan identifikasi
kandungan asam amino pada sampel
dengan menggunakan teknik
kromatografi kertas ini menggunakan
dua jenis eluen. Eluen pertama yaitu
campuran n-butanol, aquadest dan
asam asetat glasial, sedangkan eluen
kedua yaitu campuran fenol dan
aquadest.
Kertas kromatografi disiapkan
dua buah sesuai dengan prosedur kerja.
Kertas pertama ditotolkan larutan
sampel (larutan alanin, glisin, leusin
dan triptofan). Jarak antara sampel
kurang lebih 1,5 cm yang bertujuan
agar sampel yang ada tidak saling
tercampur pada saat proses
kromatografi dilakukan.
Eluen pertama terdiri dari fenol
dan aquadest. Fenol bersifat non polar
dan aquadest bersifat polar. Sedangkan
eluen kedua terdiri atas n-butanol,
aquadest dan asam asetat glasial.
Ketika larutan dicampurkan terbentuk
dua lapisan. Hal ini terjadi karena n-
butanol bersifat non polar sedangkan
polar sehingga asam asetat dan air
akan saling bercampur.
Eluen dimasukkan ke dalam
ruang kromatografi yang sebelumnya
sudah dijenuhkan. Penjenuhan ini
dilakukan untuk mempercepat proses
elusi oleh eluen. Kemudian kedua
kertas kromatografi yang telah berisi
sampel juga dimasukkan ke dalam
ruang kromatografi. Mekanisme yang
terjadi yaitu komponen polar dari
eluen yaitu air akan teradsorpsi pada
kertas tersusun atas selulosa. Molekul-
molekul air yang bersifat polar akan
terdistribusi pada permukaan kertas
sebagai fase diam. Pada saat fase diam
(polar) ini dilewati oleh eluen yang
bersifat nonpolar (n-butanol dan
fenol), akan terjadi pemisahan sampel
yang disebabkan oleh perbedaan
distribusi asam amino yang menyusun
campuran asam amino dalam fase
gerak dan air (fase diam).
Pada saat percobaan, kertas
kromatografi tidak boleh disentuh
dengan tangan karena tangan manusia
menghasilkan zat organik. Salah
satunya adalah asam amino yang dapat
mengganggu dalam pengamatan
perhitungan Rf. Elusi dihentikan
ketika eluen telah menempuh jarak
kurang lebih 10 cm dari tempat sampel
ditotolkan. Kemudian kertas diambil
dari ruang kromatografi. Jarak yang
ditempuh oleh sampel dapat dilihat
pada gambar 1. Pada percobaan
identifikasi kandungan asam amino
pada sampel dengan menggunakan
teknik kromatografi ini menggunakan
metode ascending. Kromatografi
ascending merupakan kromatografi
kertas dimana arah fase geraknya
menarik, dengan memanfaatkan gaya
kapiler.

(a) (b)
Gambar 1. (a) kromatogram dengan campuran eluen fenol dan aquadest yang
disemprotkan ninhidrin, (b) kromatogram dengan campuran eluen n-butanol dan
aquadest dan asam asetat glasial disemprotkan ninhidrin

Asam amino merupakan zat tidak membuktikan bahwa asam amino

berwarna, sehingga untuk mengetahui
letak noda diperlukan pereaksi lokasi
yaitu larutan ninhidrin. Kromatogram
yang masih basah dikeringkan dengan
hot air gun. Hal ini dilakukan agar
ninhidrin yang akan disemprotkan
dapat bereaksi dengan asam amino.
Setelah kromatogram kering, larutan
ninhidrin disemprotkan ke
kromatogram dan dikeringkan lagi.
Hasilnya adalah terbentuk warna violet
pada kromatogram yang menunjukkan
jarak tempuh sampel. Hal ini
bereaksi dengan ninhidrin membentuk
aldehida dengan satu atom C lebih
rendah dan melepaskan molekul NH3
dan CO2. Ninhidrin yang telah
bereaksi akan membentuk hidrindantin
yang hasil positifnya ditandai dengan
terbentuknya kompleks berwarna
violet yang disebabkan oleh molekul
ninhidrin dan hidrindantin yang
bereaksi dengan NH3 setelah asam
amino dioksidasi. Reaksi yang terjadi
antara asam amino dengan ninhidrin
dapat dilihat pada gambar 2.
Gambar 2. Reaksi pembentukan kompleks berwarna violet antara ninhidrin dan asam amino
Dari hasil percobaan kromatografi
ini diketahui jarak tempuh masing-masing
eluen. Jarak yang ditempuh eluen
campuran n-butanol, aquadest dan asam
asetat glasial pada sampel adalah 8,5 cm.
Sedangkan jarak yang ditempuh oleh
eluen campuran fenol dan aquadest adalah
8,3 cm. Nilai Rf masing-masing sampel
untuk eluen campuran n-butanol, aquadest
dan asam asetat glasial yaitu larutan alanin
(0,43), glisin (0,33), leusin (0,91) dan
triptofan (0,80). Sedangkan nilai Rf
masing-masing sampel dari eluen
campuran fenol dan aquadest yaitu larutan
alanin (0,93), glisin (0,90), leusin (0,94),
dan triptofan (0,66). Perbedaan nilai Rf ini
dipengaruhi oleh jarak tempuh sampel
yang berbeda-beda. Perbedaan jarak
tempuh ini dipengaruhi oleh perbedaan
pelarut dan kelarutan dari masing-masing
komponen warna penyusunnya.
Komponen yang lebih mudah larut
(teradsorpsi) akan lebih cepat bergerak
naik kea rah atas kertas saring. Sedangkan
untuk komponen yang kurang larut dalam
fase gerak akan bergerak lambat dan akan
tertinggal. Secara literatur, nilai Rf standar
yang dimiliki alanin yaitu 0.38, glisin
yaitu 0.26, leusin yaitu 0.66 dan triptofan
yaitu 0.68. hal ini berbeda dengan nilai Rf
yang diperoleh pada saat percobaan. Hal
ini disebabkan oleh beberapa faktor yaitu
komposisi eluen yang digunakan,
perbedaan ukuran kertas kromatografi,
dan keterkaitan analit dengan eluen
sehingga hal ini yang membedakan nilai
Rf standar dengan nilai Rf yang diperoleh
dalam percobaan.
IV. KESIMPULAN
Dari hasil percobaan dan
pembahasan yang telah dilakukan
dapat disimpulkan bahwa nilai Rf yang
dihasilkan dari masing-masing sampel
asam amino dengan eluen campuran n-
butanol, aquadest dan asam asetat glasia
yaitu larutan alanin (0,43), glisin (0,33),
leusin (0,91) dan triptofan (0,80) l.
Sedangkan nilai Rf dari masing-masing
asam amino dengan eluen campuran fenol
dan aquadest yaitu larutan alanin (0,93),
glisin (0,90), leusin (0,94), dan triptofan
(0,66).
V. UCAPAN TERIMA KASIH
 Ucapan terima kasih penulis
sampaikan kepada Dr. I Nyoman Tika,
M.Si., sebagai dosen pengampu mata
kuliah praktikum biokimia, I Made
Wirahadi Kusuma, S.Pd selaku asisten
dosen dan Ni Putu Lilik Pratami, S.Si
selaku laboran di Prodi Analis Kimia
atas masukan dan sarannya selama
praktikum sehingga dapat berjalan
dengan lancar.

VI. DAFTAR PUSTAKA

Fessenden & Fessenden. 2010.
Fundamentals of Organik
Chemistry alih bahasa
Dra.Sukmariah Maun, dkk.
Jakarta : Binarupa Aksara
Publisher
Tika , I Nyoman. 2010. Penuntun
praktikum Biokimia.
Singaraja : Universitas
Pendidikan Ganesha
Yazid, Estien. 2005. Kimia Fisik untuk
Paramedis. ANDI :
Yogyakarta.