Dna Rekombinan

I .
N
...., R
__,, c
BIOTEKNOLOGI KESEHATAN
024463
© Kanisius 2008
PENERBIT KANISIUS (Anggota IKAPI)

JI. Cempaka 9, Deresan, Yogyakarta 55281
Kotak Pos 1125/Yk- Yogyakarta 55011
Telepon(0274)588783,565996,Fax(0274)563349
Website www .kanisiusmedia.com
E-mail : office@kanisiusmedia.com
Cetakan ke- 5 4 3 2 1
Tahun 12 11 10 09 08
ISBN 978-979-21-1722-6
Hak cipta dilindungi undang-undang

Dilarang memperbanyak karya tulis ini dalam bentuk dan
dengan cara apa pun, termasuk fotokopi, tanpa izin tertulis
dari Penerbit.
Dicetak oleh Percetakan Kanisius Yogyakarta
Bahan dengan hak cipta

DAFTARISI
PRAKATA 5
DAFIARISI 7
1. PERKEMBANGAN BIOTEKNOLOGI
KESEHATAN 21
DASAR BIOTEKNOLOGI MOLEKULAR 21
PERKEMBANGAN B!OTEKNOLOGI KESEHATAN ,. .,........ 22
ANALISIS PRODUK BIOFARMASETIK 31
Cemaran Protein 31
Endotoksin dan Pirogen 37
Cemaran DNA 39
PERHATIAN BIOTEKNOLOGI 40
2. IEKNOLOGI DNA REKOMBINAN ·43

PENDAHULUAN 43
RESTRIKSI ENOONUKLEASE 45
LtGASI 51
Li ase DNA 52
PLASMID 55
TRANSFORMASI DAN 5ELEKSI 62
PLASMID LAIN 65
PuSTAKA DNA 70
Penapisan Klon 73

KLONING GENA EUI<ARIOT ·-·········· 76

BAKrE.RIOFAGA DAN KosMID 80
Vektor Lambda 85
Kosm.id -............................................................................... 86
3. TEKNIK BIOLOGI MOLEKULAR 91

PENDAHULUAN 91
PREPARASJ DNA 91
ELEKTROFORESIS 94
Gel Agarosa 94
Gel Poliakrilam.id 99
Gel Poliakrilamid-SDS (SDS-PAGE) 101
Isoelectric Focusing 104
Dua Dimensi . 105
H IBR I DISASI ASAM NUKLEAT . 107
Strategi Hibridisasi . 108
Pe lacak . 110
Hibridisasi dengan Radioaktif . 111
Hibridisasi Non-radioaktif . 114
Molecular Beacons . 116
HrnRIDISASI ANTI BODI . 117
S1KUENSING DNA . 120
Dideoksinukleotida . 121
Cetakan (Template) . 124
Polimerase DNA . 124
d.NTP Berlabel . 125
Analog d.NTP . 126
. s1. p K eIJ.a
P rm . 126
Primer Jal an . 129
Sikuensing Otomatik 131

8
DAFTAR Isr _
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 131

Primer Oligonukleotida 133
Bufer 134
Polimerase Taq 135
Sikuen Target 135
Proses Amplifikasi 135
RT-PCR 142
Nested PCR 143
RT-Q-PCR (Real-Time-Quantitative PCR) 143
MUTASI TERARAH 144
Mutasi Terarah-oligonukleotida dengan M13 145
Mutasi Terarah-oligonukleotida-PCR 146
4. SINTESIS BIOLOGI 151

SECARA
PENDAHULUAN 151
VrrAMIN C .. 151
AsAM AM1No 155
_AaN"fIBIOTI1< ,,,.,,,,000,o••••••·••••••••••••••••••••••••••••••••••o,.,,,,.,,,,,.,,.,,.,,.,,,,,,..,,,,ooooo •• ,,,,,.,,,,.,,,,,.,.,,,,oHo"ooO,
164
Kloning dengan Cara Komplementasi 165
Kloning dengan Cara Lain 166
Sintesis Antibiotik 168
Perbaikan Produksi Antibiotik 171
Turunan Sefalosporin 172
PROTEIN FARMASETU< ··········-··············-······················- 179
Insulin
············································· 181
Kloning dan Rekayasa Interferon 187
PRODUI<Sf ANTIBODI ····································································································· 191
EKSPRESI GENA TERKLON PADA £.COLi 196
9
Bahan dengan hak ctpta
5. DIAGNOSIS MOLEKULAR 199

PENDAHULUAN ···················································································································199
DIAGNOSIS SECARA lMONOLOGI 200
Deteksi HIV 201
SISTEM DlAGNOSIS DNA 203
Deteksi dengan Pelacak DNA 204
Deteksi dengan PCR 205
DIAGNOSIS MOLEKULER PENYAKlT GENETll< 210
Sickle-cell Anemia . . . .. 210
Ovalositosis 218
Thalassemia 219
SmIK JARJ DNA 224
Teknik Dasar Sidik Jari DNA 227
Penggunaan Sidik Jari DNA 228
Identifikasi Hubungan Kekeluargaan 229
Penggunaan Sidik Jari pada Forensik 230
Sidik J ari DNA dengan PCR 234
6. TERAPI GENA 237

PENDAHULUAN 237
T1:RAP1 GENA Ex Vrvo - IN Vrvo 239
Terapi Gena Ex Vivo 239
Terapi Gena In Vivo 242
.
PENYAKJT TARGET UNTUK TERA Pl GENA 242
Kelainan Keturunan 242
Kanker 245
METODE TRANSFER GENA ····················································································· 249
Transfer Gena Non-virus 249
Penggunaan Transfer Gena Non-virus 252
Transfer Gena dengan Vektor Virus 255
Vektor Retrovirus 255
10
DAFTAR Is1 _
ASAM NUKLEAT SEBAGAI AGEN TERAPETU< 262

Produksi RNA Antisense In Vivo 263
Oligonukleotida Antisense -.............................................. 265
Asam Nukleat _..... _...... 270
Riboz.im ,.......................................................................................................... 270
Pembetulan Oligonukleotida
pada Kelainan Genetik .. ·-·... . 272
MASALAH ETU< 275
DAFTAR PUSTAKA 277
11
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Prosedur kloning....................................................................... 44

Gambar 2. Pemotongan DNA oleh EcoRI............................... 46
Gambar 3. Pemotongan DNA oleh Hindlll
menghasilkan ujung tumpul.................................. 48
Gambar 4. Peta restriksi suatu fragmen DNA................ 50
Gambar5. Penempelan bagian yang komplemen
setelah pemotongan dengan BamHI........... 53
Gambar 6. Proses Ligasi: A Fragmen DNA
berujung kohesif pemotongan
BamHI berkomplementasi,
antara G dan C kemudian disambung
dengan ikatan fosfodiester. B. Fragmen
dengan ujung papak juga dapat
disambung (Proses ligasi)........................................... 54
Gambar 7. Peta restriksi pBR 322....................................................... 59
Gambar 8. Struktur replikon pMBl atau ColEl ........... 60
Gambar9. Kloning fragmen DNA dalam plasmid. 61
Gambar 10. Inakti. vasi. peny1..
s1pan......................................................... 63
Gambar 11. Penapisan untuk sisipan dengan

inaktivasi gena resisten terhadap
antiibi10 tik ............................................................................................... 64
13
Gambar 12. Peta restriksi pUC18/19....... 66

Gambar 13. Kloning dengan vektor pUC. 68
Gambar 14. Jenis replikon pSClOl......... . 69
Gambar 15. Strategi kloning gena trpA dengan
penapisan secara komplementasi...................
74
Gambar 16. Sintesis untai pertama dari cDNA
dengan menggunakan primer oligo(dT)
dan transkriptase balik. 78
Gambar 17. Sintesis cDNA untai ganda dengan
metode selfpriming 79
Gambar 18. Jalur lisis lisogen pada bakteriofaga. 81
Gambar 19. Sistem kloning bakteriofaga 11.. 84
Gambar 20. Kloning dengan kosmid c2RB yang
mempunyai dua cos.............................................................. 59
Gambar 21. Alat elektroforesis gel agarosa. 95
Gambar 22. Hubungan laju migrasi dan ukuran
DNA - -·····-·······-····..····�··-····-······--·· 98
Gambar 23. Pembentukan gel poliakrilamid. 101
Gambar 24. Alat elektroforesis gel poliakrilamid......... 102
Gambar 25. Elektroforesis gel poliakrilamid-SDS....... 103
Gambar 26. Pri107nsip pemisahan isoeleciric
focusing.......................................................................................................
105
Gambar 27. Elektroforesis gel dua dimensi. 106
Gambar 28. Skema teknik hibridisasi dot untuk
koloni dengan pelacak radioaktif.................... 112
Gambar 29. Deteksi kemiluminesen dari DNA
target................................................................................................... ..... 115
Gambar 30. Prinsip ELISA tak langsung.................................... 119
Gambar 31. A Struktur nukleotida trifosfat. ....-.................... 121
Gambar 32. Sintesis DNA normal......................................................... 122
14
DAFTAR GAMBAR -------
Garn.bar 33. Sintesis DNA terhenti....................................................... 123

Gambar .34. Perpanjangan primer pada sintesis
DNA................................................................................................................. 127
Gambar 35. Simulasi autoradiograf gel
sikuensing DNA........................................................................ 128
Gambar 36. Sikuensing DNA dengan metode
primer j alan....................................................................................... 130
Gambar 37. Hasil sekuensing otomatik........................................ 132
Gambar 38, Hubungan suhu dan waktu dengan
sistern terprogram. 137
Gambar .32, Siklus pertama PCR. 138
Garn.bar AO. Siklus kedua PCR.................................................................... 139
Gambar il Siklus ketiga PCR. 140
Gambar .42 Siklus ketiga puluh....................................................... 141
Gambar il Mutagenesi terarah-oligonukletida............. 147
Gambar .44:. Mutasi terarah dengan PCR.................................... 148
Gambar .45. Sintesis Vitamin C. 152
Gambar A6. Produksi 2-keto-L-gulonat secara 155
biologi. 153
Gambar AZ. Sintesis L-asam amino (A) dan
D-asam amino (B). 160
Garn.bar .48. Plasmid rekombinan yang digunakan
untuk produksi asam amino................................... 161
Gambar 49. Pengaruh waktu pada pembentukan
asam amino. 164
Gambar .50. Alur biosintesis untuk penisilin dan
sefalosporin dalam P.chrysogenaum.............. 167
Gambar 51. Rekayasa genetik alur biosintesis untuk
sintesis 7-ACA dari sefalosporin C. 174
15
•
•
•
•
Garnbar 82. Model hipotetik transfer gena dengan
bantuan Iiposom-kation. 252
Gambar 83. Diagram skematik CFRT.............................................. 254
Gambar 84. Skema bentuk provirus dari
retrovirus dengan komponen untuk
replikasi................................................................................................... 257
Gambar 85. Siklus hidup retrovirus. .. 258
Gambar 86. Kerja sistem pembungkus........................................ 260
Gambar 87. Penghambatan translasi suatu rnRNA
spesifik oleh oligonukleotida
anti.sense................................................................................................... 266
Gambar 88. Modifik.asi oligonukleotida
anti.sense................................................................................................... 269
Gambar 89. Ribozi.m memotong mRNA..................................... 273
Gambar 90. Pembetulan situs pengenaalan
pemotongan pada splicing
olinukleotida
dengan antisense.................................................... 274
18

•
•
•
•
•
•
8IOTEKNOLOGI KESEHATAN
misalnya, mengekspresikan suatu protein manusia pada

tanaman atau pada binatang dan disekresikan bersama air
susu binatang itu.
Bioteknologi molekular merupakan disiplin ilmu yang
tidak dapat berdiri sendiri, tetapi merupakan bidang antar•
disiplin ilmu. Beberapa ilmu yang sangat dekat di antaranya
adalah Biologi Sel, Biokimia, Genetik, Mikrobiologi, dan
Biologi Molekular. Tanpa mengurangi arti ilmu yang lain,
pe11ggunaan biologi molekular dan rekayasa genetik dalam
suatu ilmu merupakan tanda bahwa disiplin ini dibahas
dalam aras molekular. Kerja sama yai1g baik antara masing•
masing disiplin tersebut akan membuahkan produk dengan
nilai jual tinggi dalam bidang obat, vaksin, alat diagnostik,
pertanian, dan hewan piaraan.
PERKEMBANGAN BJOTEKNOLOGI KESEHATAN
Bioteknologi kesehatan merupakan bidang yang

menonjol perkembangannya karena mempunyai nilai
komersial tinggi. Sebagai contoh, asetosal, berat molekul
180, dibuat dengan sintesis, dosis satu hari 3 g, bernilai 1
sen dolar. Sedangkan leukine, protein berukuran 17 kDa,
yang dibuat dengan teknologi DNA rekornbinan dan
diekspresikan dalam Escherichia coli, dosis pemakaian 250
µg berharga 1.000 dolar. Lingkup bioteknologi kesehatan
meliputi penggunaan sel hidup, yakni mikroorganisme,
kultur jaringan, atau enzim untuk menghasilkan suatu
obat, pengobatan, atau alat diagnostik.
Bioteknologi telah ada beberapa ribu tahun sebelum
Maseh.i, ketika orang membuat minuman beralkohol
dengan cara fermentasi. Kemudian pembuatan makanan,
22
•
•
•
•
•
•
BIOTEKNOLOGl KESEHATAN
dapat memperrnudah semua produksi protein dalam

jumlah besar dengan biaya rendah. Keuntungan lainnya
adalah produknya bebas dari organisme penginfeksi
seperti hepatitis B dan HIV, yang mungkin terjadi pada
pengobatan penderita hemofilia dengan transfusi.
Tabel 1. Beberapa obat yatig diperolek dari ekstraksi

langsung
Senyawa Sumber
Insulin Pankreas sapi/babi
Hormon pertwnbuhan Otaksapi
Faktor koagulasi Daral1 manusia
Anti Tetanus Serum Serumkuda
Papain Oaunpapaya
Urokinase Urine
Pankreatin Pankreas babi
Fibrinolisin Palsma sapi
Rekayasa genetik dan teknologihibridorna dapatmeng•

hasilkan protein untuk pengobatan dalam jumlah besar.
Senyawa obat yang dibuat melalui rekayasa genetik dan
teknologi hibridoma dinamakan obat produk bioteknologi
atau senyawa biofarmasetik. Usaha pertama difokuskan
pada protein yang mempunyai nilai tinggi yang banyak
digunakan pada pengobatan. Produk pertama yang beredar
di pasar adalah insulin manusia rekombinan pada tahun
1982 yang diproduksi di dalarn sel E.coli dan dinamakan
Humulin.
26
•
•
ini akan berpengaruh pada pengobatan kelainan genetik

yang disebabkan oleh adanya mutasi pada gena tertentu.
Hal ini juga digunakan untuk melawan kanker dan infeksi
virus seperti AIDS. Beberapa uji klinik sedang dilakukan
sehingga dapat diharapkan akan segara beredar untuk
umum. Pada saat sedang dikembangkan human artificial
chromosome sebagai pembawa gena terapi, maka pada terapi
gena tidak terjadi integrasi gena tetapi pada kromosom.
Teknologi antisen dengan menggunakan sekuen oli•
gonukleotida sintetik merupakan komplemen dengan
mRNA tertentu. Hibrid mRNA:antisens menghalangi
proses translasi sehingga terjadi penghambatan selektif
dari ekspresi suatu gena. Walaupun teknologi antisens ini
masih banyak hambatan, tetapi aplikasi teknologi mulai
dilakukan.
Selain protein dan asarn nukleat, senyawa karbohidrat
mungkin akan ikut berperan pada pengobatan masa men•
datang.Padasaati.Iu,beberapakarbohidratdigunakan untuk
pengobatan. Sebagai contoh adalah glikosaminoglikan,
heparin yang digunakan sebagai antikoagulan. Setelah
diketahui lebih mendalam struktur molekulnya, beberapa
karbohidrat dapat dipandang sebagai molekul yang kaya
informasi. Karbohidrat permukaan sel memegang peran
utama dalam pengenalan dan gerakan sel, dan hal ini dapat
digunakan pada pengobatan dengan memperkuat proses
itu. Obat dengan karbohidrat mungkin dapat digunakan
mengatur kekebalan dan inflamasi.
28
PERKEMBANGAN BlOTEKNOLOGI KESEHATAN _
Tabel 2. Beberapa protein manusia yang telah disintesis

dari gena yang diklon pada bakteri, sel eukariot,
dan dengan pharming
•
Biofarmasetik Indikasi Tah� Dikenalkari
Honnon
· Insulin Diabetes melitus 1982
· Follitropin
· '· alfadan beta Kegagalan ovulasi 1999
• Chcl_Fiogonado
·•. tropln alfa- Fertilitas 2000
· _ !eriparatida Osteoporosis 2002 '
Enzim . ,
• . Alteplase Inirak miokardinal •,
•
,. akut 1987
•
•
Ebtifibatid Sindrom koroner akut 1998
• ' ..
Rasburiease Hlperurikemia 2002
La:l'onidase Mukopolisakharoi
dasis I 2003
Fa�tor- Pertumbuhan
Epo�tin alfa Anemia karena ginjal 19.89 I
;· Filgrastin Neurotropenia 19 91 •
•
Darbepoetinj alfa Kanker 2002
A
a n i-bodi, . • •
Mirt'O\llonab-CD3 Penolakan trans· ..

plantasi ginjal '1986
-�
Trastuzumad kanker payu�ara ' 1998
••
> Bevadzumab Kanker rektal ' 2004
.
·�-
•
�·
. � .,,., ,.
• • • 'J.' . '
•
• I'
� # • ... "'.:
lnterferon'alfa ·
••. '�
•
"' . �.i ,• .,
.....
•
:• 2a "d an·2b Leuk:emia 1986
.�
1 IB-2".' . Carcinoma renal '
'
j ,•
. '
� metastase
'
•
1992
.IL�ll , •, Trobesitopenia • , 19,97
PEG-Interferon 2b Hepatitis C 2001
29
Jika berhasil, pengernbangan obat peniru dengan

massa rnolekul rendah mungkin akan menggantikan
sejumlah makromolekul yang saat ini digunakan sebagai
obat. Dari semua yang telah dibicarakan ini dapat dilihat
bahwa rentang dan aplikasi produk biofarmasetik akan
berubah dalarn waktu yang lama.
Tekanan utama akan terdapat pada desain peniru:
obat dengan massa molekul rendah dapat mempunyai efek
seperti pada protein besar (misalnya molekul kecil dapat
berikatan dengan reseptor hormon, sehingga meniru kerja
hormon). Pengembangan peniruan seperti ini diperlukan
karena beberapa alasan. Senyawa seperti itu dapat dibuat
dengan sintesis kimia langsung dengan harga lebih
rendah daripada biofarrnasetik. Biasanya, senyawa kecil
lebih tahan panas sehingga dapat disterilkan dengan cara
panas bertekanan, a tau mungkin dapat diserap dari sistem
pencernakan, sehingga dapat diberikan peroral.
Adanya sejumlah produk bioteknologi yang saat ini
dalam uji klinik dapat diharapkan dalam beberapa tahun
mendatai1gprodukbiofarmasetikituakai1beredardipasaran
secepatnya,diantaraprodttkituadalahantibodimo.noklonal
untuk terapi. Beberapa produk seperti interferon yang telah
•
beredar akan mendapatkan persetuj uan untuk penggunaan
yang lain. Hal ini berarti akan terjadi penggunaan lebih
besar kombinasi biofarmasetik rekombinan untuk terapi
penyakit tertentu. Sejumlah vaksin rekombinan akan
muncul, dengan perhatian spesifik pada pengembangan
vaksin AIDS.
Beberapa ilmu seperti kristalografi sinar-X, NMR,
MALDI spektrornetri masa dan model komputer meng•
hantarkan analisis struktur tiga dimensi berbagai protein.
30
•
•
•
•
•
•
protein, dapat mudah dipisahkan dengan penukar ion atau

interaksi hidrofobik.
Berbagai teknik kromatografi berkembanng dengan
kemampuan pemisahan yang lebih tinggi sehingga dapat
menghasilkan protein biofarmasetik dengan kemurnian
97°/o - 99°/o. Berbagai teknik yang dapat digunakan untuk
karakterisasi protein farmasetik dan pencemarannya dapat
dilihat pada Tabel 4.
Tabel 4. Metode yang digunakan untuk karakterisasi
biofarmasetik
Elektroforesis gel poliakrilamid-SDS

(terdenaturasi) Elektroforesis gel poliakrilamid
non-terdenaturasi Elektroforesis 2-dimensi
Elektroforesis
kapiler Pemetaan
peptida HPLC
Isoelectric focusing
Spektrometri massa
Analisis asam amino
Sekuensing ujung N
Studi dikroisme
sirkuler
Uji imunologi dan uji hayati
Semua biofarmasetik harus disertai spesifikasi potensi.

Spesifikasi itu biasanya dinyatakan dalam satuan aktivitas
per vial, per dosis terapi, atau per miligram. Sejumlah
pendekatan yang berlainan dapat dilakukan untuk me•
netapkan potensi suatu obat. Setiap pendekatan tertentu
menunjukkan kelebihan dan kelemahan.
34
•
•
•
•
•
•
BIOTEKNOLOGI l<ESEHATAN
efek klinis meliputi Escherichia coli, Haemopilus infiuenzae,

Salmonella enterica, Klabsiella pneumoniae, Bordetella periusis,
Pseudomonas aeruginosa, Chlamedia psittaci, dan Legionella
pneumophila.
Pada umumnya, pengaruh pirogen pada suhu tubuh
secara tidak langsung. Contoh, endotoksin masuk ke
dalam aliran darah akan memacu makrofag memproduksi
i$rleukin-1 (IL-1). Senyawa ini langsung menginisiasi
respon demam. Walaupun masuknya senyawa pirogenik
ke dalam aliran darah dapat menimbulkan pengaruh serius,
tetapi endotoksin biasanya mendapatkan perhatian lebih
daripada yang lain. Kontaminasi endotoksin pada produk
akhir sulit dikendalikan karena:
• Banyak biofarmasetik rekombinan dibuat dengan
sistem bakteri Gram-negatif yang merupakan sum•
ber endotoksin;
• Walaupun telah melakukan GMP, kebanyakan
sediaan biofarmasetik akan tercemari pada aras
rendah oleh bakteri Gram-negatif pada saat proses
pembuatannya. Bakteri ini akan mengeluarkan endo•
toksin pada larutan, yang tidak akan hilang pada
tahapan penyaringan
• Endotoksin bersifat tahan panas. Hal ini berarti
pada proses sterilisasi dengan autokJaf tidak meng•
hilangkan endotoksin.
• Reaksi yang merugikan pada manusia oleh endo•
toksin terlihat pada dosis 0,5 ng/kg berat badan.
38
PERKEMBANGAN BIOTEKNOLOGI KESEHATAN _
CemaranDNA
Pengaruh cemaran DNA pada sediaan biofarmasetik
sampai saat ini belum jelas. Banyak sediaan, seperti vaksin
yang dibuat dalam sistem biakan sel, selalu mengandung
DNA dari sel inang. Sampai saat ini belum diketahui
adanya efek klinis yang muncul akibat cemaran DNA itu.
Perhatian utama adanya cemaran DNA pada biofarmasetik
modern pada onkogen aktif pada beberapa jenis sel inang,
misalnya pada produksi antibodi monoklonal dengan sel
hibridoma. Sediaan parenteral yang terkontaminasi DNA
onkogen aktif harus dihindarkan. Ekspresi DNA itu pada
sel manusia diduga dapat mengubah sel terinfeksi menjadi
kanker. Walapun sampai saat ini bukti tentang hal itu
masih lemah, tetapi badan yang bertanggung jawab telah
mengambil tindakan pencegahan. Beberapa penelitian me•
nyampaikan bahwa DNA dapat berintegrasi pada genom
pada kondisi tertentu.
Adanya cemaran DNA dapat dideteksi dengan hi•
bridisasi DNA (dot blot) dengan menggunakan pelacak
DNA yang membawa label. Metode ini dapat mendeteksi
pada rentang nanogram. Metode lain yang banyak dipakai
adalah Polymerase Chain Reaction (PCR) dan elektroforesis
kapiler. PCR akan mengamplifikasi fragmen DNA tertentu
dan menghasilkan fragmen DNA dengan ukuran tertentu.
Metode PCR banyak disukai karena cepat dan tidak
menggunakan senyawa radioaktif. Perkembangan terbaru
pada PCR adalah Real-time PCR, yang menghasilkan
senyawa berfluoresensi sehingga sangat peka. Selain itu,
amplifikasi dapat dimonitor in situ. Walaupun demikian,
metode ini memerlukan jenis primer tertentu untuk
suatu kontaminan. Sedangkan penggunaan elektroforesis
39
kapiler sangat mempermudah deteksi adanya kontaminan.

Jika muncul puncak selain puncak utama berarti ada
kontaminan. Metode seperti ini akan dibicarakan pada bab
Teknik Biologi Molekuler.
PERHATLAN BIOTEKNOLOGI
Bioteknologi molekuler harus memberikan berbagai

keuntungan terhadap manusia. Oleh karena itu, bidang ini
harus:
1. Memberikan kemungkinan untuk diagnosis yang
lebih tepat dan mencegah, atau mengobati berbagai
penyakit infeksi dan penyakit genetik.
2. Mengembangkan mikroorganisme dan jamur yang
menghasilkan antibiotik, enzim, asam amino, polimer,
dan bahan kimia.
3. Menaikkan hasil pertanian dengan membuat tanaman
tahan terhadap infeksi virus dan jamur, kondisi
kekeringan dan juga menaikan produk metabolit
sekunder yang berguna sebagai obat.
4. Mempermudah pengolahan polutan dan bahan buangan.
Walaupun bidang bioteknologi molekular merniliki

banyak hal yang menarik dan sangat penting, tetapi juga
banyak hal perlu diperhatikan berkaitan dengan perhati•
an dan akibat sosialnya. Sebab, bioteknologi molekular
mempunyai cakupan yang sangat luas dan mempunyai
pengaruh kuat pada masyarakat. Misalnya,
1. Apakah organisme hasil rekayasa genetik berpengaruh
buruk terhadap organisme lain dan lingkungan
sehingga mengganggu keaneragaman hayati alam.
40
PERKEMBANGA BIOTEKNOLOGI KESEHATAN _
2. Apakah prosedur diagnosis melanggar kebebasan

pribadi dan sebaliknya keberatan pasien akan meng•
hambat pertukaran pendapat antar-peneliti.
3. Apakah pengobatan dengan metode molekular hanya
untuk orang kaya karena ongkosnya mahal.
4. Apakah organisme hasil rekayasa genetik dengan
membawa gena asing menjadi milik pribadi.
Para pemerhati lingkungan khawatir dampak buruk

bioteknologi, organisme superior hasil rekayasa akan
menekan organisme alami sejenis, yang pada suatu saat
mungkin akan punah. Hukum alam adalah siapa yang
kuat sebagai pemenang. Pada kenyataan saat ini sangat
sulit mencari ikan lele alami, yang ada ikan lele dumbo.
Demi.kian juga sulit mencari buah salak yang masam
dan sepet, yang ada buah salak manis. Perubahan seperti
itu bersifat alami dan relatif pelan sehingga masyarakat
menerima sebagai perubahan yang alami. Bioteknologi
modern melakukan percepatan perubahan itu sehingga ada
sebagian masyarakat yang belum dapat menerimanya.
Hal yang paling ditakuti dari perkembangan bio•
teknologi adalah kloning manusia. Sejak manusia dapat
menghasilkan tanaman utuh pada media dari eksplan atau
sel tanaman, maka manusia dimungkinkan dapat membuat
hewan dari bagian hewan itu. .Kloning domba Dolly yang
lahir pada tahun 1996 sangat menarik perhatian telah
menjawab tantangan itu. Kloning Dolly ini tidak semuanya
dilakukan in vitro karena pada tahapan akhir masih
menggunakan indu� semang domba sebagai pembawa dan
pengembang sel telur yang telah diganti intinya.
Teknologi transfer inti ini merupakan hasil penelitian
yang dipimpin
41
oleh K. Cambel dari Roslin Institute, Edinburg, Scotland.

Teknologi ini dan binatang yang dihasilkan dipatenkan oleh
perusahaan Geron Bio-med sebagai pemegang hak selama
17 tahun. Kemuclian, muncul kekhawatiran penggw1aan
teknik serupa untuk membuatmanusia yangsama. Para ahli
rnendesak bahwa teknologi transfer inti hanya digunakan
pengembangan pengobatan sel. Pada masa yang akan
datang mungkin manusia dapat membuat hewan in vitro
dari sel a tau jaringan hewan, seperti halnya pada tanaman.
Bagaimana kalau pendekatan seperti itu cliterapkan pada
manusia. Semoga hal itu tidak pernah terjadi. Walaupun
saat ini ada usaha rnernbuat organ dari jaringan.
Perkembangan lain dalam bioteknologi yang meng•
gembirakan adalah terapi sel induk. Metode ini dilaporkan
dapat mengobati lebih dari 72 penyakit, seperti penyakit
sklerosis kompleks, leukemia, dan kanker payudara. Pada
saat ini yang rnasih rnenjalani uji klinis, antara lain terapi
pada diabetes tipe 1, lupus, dan parkinson.
42
Teknologi DNA
Rekombinan
PEDAHULUAN
ada tahun 1971 - 1973, penelitian genetika kembali

bergairah dengan dikernbangkannya metodologi
baru oleh Herbert Boyer dan Stanly Cohen, suatu
revolusi dalam percobaan biologi. Metode ini dinamakan
Teknologi DNA Rekombinan dengan pokok proses adalah
kloning gena. Boyer dan Cohen berhasil mengekspresikan
gena dari suatu bakteri dalam Escherichia coli. Fragmen
DNA disisipkan pada vektor, ditransformasikan ke dalam
sel dan dilakukan penapisan terhadap koloni bakteri
yang tumbuh. Teknologi DNA rekombinan atau rekayasa
genetik, yang juga dinamakan kloning gena atau kloning
molekular merupakan istilah yang meliputi sejumlah
cara kerja yang mengarah kepada pemindahan informasi
genetik (DNA) dari satu organisme ke organisme lainnya.
Tujuan mempelajari Teknologi DNA Rekombinan supaya
dapat memahami metode isolasi DNA, ekspresi gena
rekombinan pada sel prokariot dan eukariot, hibridisasi,
sekuensing, amplifikasi fragmen DNA (PCR), dan mutasi
terarah.
Dalam hal ini tidak ada satu rangkaian metode tertentu
yang dapat digunakan untuk mencapai tujuan ini. Akan
43

8JOTEKNOLOGI KESEHATAN
tetapi DNA rekombinan biasanya meliputi beberapa cara

di bawah ini (Gambar 1):
DNA Veklor
Kromosorn Kloning
Pemotongan
dengan Pemolongan
enzlm dengan
enzim
• ----• DNA veklor tinier
Penyambungan DNA
target dan vektor kloning
DNA rekombinan
! Masuk ke dalam set inang

lsolasl sel dengan gen
terklon
r
0 I
'
•
.
Sel lnang
menghasill<an protein
dari gen terklon
Protein yang -�it=:----....

dihasilkan ..
Ga111bar 1. Prosedur kloning. DNA kromosom bakteri dipotong dengan enzim restriksi
endonuklease dan disisipkan pada plasmid. Ke11111dia11 plasmid rekornbinan
dimasukkan dalam set inang dan set yang me111bmva plasmid reko111bi11an
diidentifiknsi dan ditumbuhkan (diadaptasi dari Glick and Pasternak, 1998).
44
----- TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN -----
• DNA dari organisms donor diekstraksi, dipotong

dengan enzim restriksi endonuklease, disambung
(ligasi) dengan DNA vektor sehingga membentuk
molekul DNA rekombinan (DNA donor tersisipkan
pada DNA vektor).
• DNA rekombinan ini dimasukkan ke dalam sel inang.
Pemasukkan DNA ke dalam sel bakteri (Eschericia
coli) dinamakan transformasi.
• Se! bakteri yang membawa DNA rekombinan (trans•
forman) dipisahkan (diseleksi) dari sel yang tidak
membawa vektor. Kemudian sel-sel ini diidentifikasi
dan dikarakterisasi terhadap sel transforman yang
membawa DNA yang diinginkan.
• Jika diperlukan, DNA rekombinan dapat dimanipu•
lasi sehingga gena yang dibawa itu dapat terekspresi
rnenghasilkan protein dalam jurnlah banyak.
Walaupun teknologi DNA rekombinan berkembang

dari penemuan pada biologi molekular virus, bakteri, dan
plasmid, dasar pengetahuan yang membuat teknologi
DNA rekornbinan berkembang dari pemahaman struktur
dan fungsi DNA.
RESTRIKSI ENDONUKLEASE
Untuk kloning, DNA donor (kromosom) yang me-

•
ngandung fragmen target dan vektor kloning dipotong
dan menghasilkan fragmen dengan ukuran tertentu
dan reprodusibel. Jika DNA kromosom disonikasi akan
menghasilkan fragmen dengan ukuran antara 0,3 sampai
5 kilobasa (kb). Sayangnya, prosedur ini menghasilkan
45
pemotongan yang acak. Setiap DNA sampel yang disonikasi

akan menghasilkan fragmen yang berbeda dari waktu ke
waktu. Setelah ditemukan enzim restriksi endonuklease
dari bakteri yang dapat memotong DNA pada urutan basa
yang spesifik, maka kloning dapat menjadi kenyataan.
Salah satu enzim endonuklease yang pertama kali
ditemukan, diisolasi dari Eschericia coli RY13 dan dinamakan
EcoRI. Enzim ini mengenal bagian DNA yang mempunyai
urutan spesifik yang palindromik yang terdiri atas enam
pasang basa dan memotong antara guanin dan adenin
pada setiap untai DNA (Gambar 2). Pemotongan yang
simetri oleh EcoRI ini menghasilkan dua untai tunggal yang
' EcoRI
p p p p p p p p OH
's" 's.,. 's.,.. 's,. 's" 's,.,. 's., 's.. .
I .. � .••• 1 •.•. J ••.••1 ••... 1- •••• 1 •. I
T : G A A -T T C: T
1;1 I I I I 1;1
A · C T T A A G • A
I :.l····t····.t·····l·····t····I··· I
s s s s s s s s
HO"' 'P"' 'P"' 'P' 'p"' 'P' 'p'tp"' 'P
Pemotongan
kohesif
Gugus 3'-hidroksi Gugus 5'-Iostat

.• :'
P P P P P P OH
's,... 's" 's" 's., 's.,. . 's.,
I I I I I I
A A T T C T
I I
G A
I I
s s
HO/ 'P., 'P
Gambar 2. Pemotongan DNA o/eh EcoRI. A11ak pann/1 tebal menunjukkan. lokus
pemotongan. Si11gkatn11: S = gula: P = g11gus Josfat; A = adenin; C = siiosin;
G = g11n11i11; dan T = timin (diadaptasi dart Glick and Pasternak, 1998).
46
•
•
•
•
•
•
basa dari lokus EcoRI. BamHI memotong fragmen EcoRI

850 pasang basa menjadi 250 dan 600 pasang basa. Ini
berarti fragmen 600 pasang basa pasti merupakan salah
satu ujung fragmen asli. Dengan menggunakan penalaran
yang serupa bahwa BamHI memotong fragmen EcoRI
500 pasang basa me.njadi 100 dan 400 pasang basa, maka
A
EcoRI BamHI EcoRI + Bamttl
950
850
600 600
500
400
300 300
250
100 100
B
EcoRI EcoRI
5-- -300 -
100 400 300 i 250 600

!
9-- ! --
100
BamHI Bamttl
Gambar 4. Peta restriksi suntujragmen DNA. A. Frogmen hasil pemisahan elektroforesis.

DNA dipotong dengan EcoRJ dan Bamrll dan ke11111dia11 Bam.Hl-EcoRI
Garis data, ga111baran pita DNA seielah pemisahan dengan elektroforesis
dan penampakan dengan etidium bromid. B. Pita restriksi yang dipero/eh
dnri pemoiongan da11 pemisahan e/ektroforesis yang ditunjukkan pada A
(diadaptasi dari Glick and Pasternak, 1998).
50
•
•
•
•
•
•
A B
Noktah Noktah
HO P HO P
\/
-ATGTI03GATCCTIGAG- -TGTACGTi lrAGATIA•
·TACAACCCA/\CTG ·ACATGCA7 \CTAAT-
p OH p OH
Noktah Noktah
�ase
lkatan lkatan
O:P-O· roslodlester O=P-0- roslodlester
I\ 0
I\0
-ATGTT\kATCCTTGAC· -TGTACGT;JrAGATTA·
-TACAACCCAT03AACTG- -ACATGAATo::ATCTAAT·
/ \ lkatan
0 0 .
\ / fosfod,ester
t\
\/ lkalan
O=P·O
O=P-0- foslodiesler
Gambar 6. Mekanisme kerja ligas11 DNA. A. Fraginen DNA berr1j11ng kohesifpen1oto11gan

Bamh! berkomplementasi, antara G dan C kemudian disambung dengan
ikatan fosfodiester. B. fr11g111e11 dengan 11j1111g papak j11ga dapai diS11111b1111g
(diadaptasi dari Glick and Pasternak, 1998).
Kemampuan menyambung dua molekul DNA

yang berbeda belum berarti, kecuali kombinasi DNA (re•
kombinan DNA) dapat dimasukkan ke dalam sel inang.
Selanjutnya, salah satu fragmen DNA harus memberi signal
biologis untuk replikasi dalam sel inang. Masalah ini dapat
diatasi dengan menggunakan vektor kloning. Sedangkan
bagian lain harus mengandung gena yang diinginkan.
Penggabungan vektor dan fragmen DNA kromosom terjadi
secara acak sehingga diperoleh berbagai macam kombinasi.
Dalam hal ini, harus ada suatu cara untuk identifikasi
rekombinan DNA dalam sel inang yang membawa DNA
54
•
•
•
•
•
•
Replikasi plasmid dilakukan oleh sejumlah enzim yang

digunakan untuk replikasi kromosom. Akan tetapi, plasmid
jenis lain menggunakan sejumlah enzim yang berbeda.
Plasmid pBR322 merupakan plasmid dengan jenis replikon
pMBl atau ColEl. Pada kondisi pertumbuhan normal,
replikon ini mengendalikan jumlah duplikat plasmid
sekitar 15 - 20 per sel. Replikon pMBl hanya menggunakan
enzim yang waktu hidupnya panjang yang terdapat dalam
sel inang (polimerase I dan II, polimerase RNA, DnaB,
DnaC, DnaD dan DnaZ). Penambahan kloramfenikol, suatu
antibiotik penghambat sintesis protein, pada biakan sel itu
dan diinkubasikan selama 12 jam. Pada keadaan ini tidak
terjadi sintesis protein sehingga kromosom bakteri tidak
dapat melakukan replikasi. Dalam hal ini plasmid ini tetap
melakukan replikasi karena mRNA rop tidak ditranslasi
menjadi protein Rop. Protein lain seperti polimerase DNA
walaupun tidak dibuat baru tetap aktif dalam keadaan
itu. Sebagai akibatnya jumlah plasmid menjadi beberatus
tanpa terjadi replikasi kromosom maupun pembelahan sel.
Plasmid dengan replikon lain tidak dapat diamplifikasi
dengan cara ini.
Replikasi hanya terjadi satu arah dan dimulai dari
bagian tertentu dengan menggunakan primer RNA yang
disandi oleh gena RNA II dengan promoter yang terletak
sekitar 550 basa dari replikon (Gambar 8). Hibrid yang
benar antara RNA II dan DNA merupakan substrat Rnase
H yang memotong RNA II sehingga dapat digunakan
sebagai primer untuk sintesis DNA. Hibrid RNA II dan
DNA diatur oleh RNA I yang ditranskripsi berlawanan
arah dari bagian yang sama dengan RNA II. Jika RNA I
menempel pada RNA II akan mencegah pembentukan
58
•
•
•
•
•
•
8JOTEKNOLOGI KESEHATAN
resirkuler ini, plasmid linier terlebih dulu diinkubasi

dengan fosfatase (Calf Intestinal Phosphatase, CIP) untuk
mengubah ujung S'-fosfat menjadi S'-hidroksi. Sifat ligase
T4 tidak dapat menyambung ujung-unjung DNA yang
tidak mempunyai ujung fosfat (Gambar 9). Akan tetapi,
dua ikatan fosfodiester akan terbentuk oleh ligase yang
cukup kuat menyambung dua molekul, di samping masih
ada dua noktah (Gambar 9). Setelah transformasi kedua
celah ini akan disambung oleh sistem ligase sel inang. Di
samping itu ada kemungkinan bahwa fragmen dari DNA
kromosom akan saling bersambungan karena kerja ligase.
TRANSFORMASI DAN SELEKSI
Langkah berikutnya dinamakan transformasi yaitu

proses masukknya DNA asing ke dalam sel. Untuk E.coli,
salah satu metode transformasi dengan perlakuan kalsium
klorida. Tetapi transformasi merupakan proses yang tidak
efisien. Biasanya dari seribu sel tidak lebih dari satu sel
yang tertransformasi. Ini berarti lebih banyak sel yang tidak
kemasukkan plasmid. Beberapa transforman membawa
plasmid utuh. Sedangkan lainnya merupakan transforman
yang membawa plasmid rekombinan, atau merupakan
sel yang kemasukkan DNA non-plasmid. Fragmen DNA
kromosom tidak mempunyai replikon sehingga tidak
dapat melakukan replikasi di dalam sel. Pemasukkan DNA
non-plasmid tidak membawa dampak yang nyata kecuali
menurunkan efisiensi transformasi. Supaya DNA yang
masuk ke dalam E.coli tidak mengalami perubahan susunan,
sel inang E.coli yang digunakan dipilih tidak membawa
endonuklease dan tidak tetjadi rekombinasi antara molekul
62
•
•
•
•
•
•
810TEKNOLOGI KESEHATAN
-1. Hg/Ell 185

Hot12:J1
Eco01ot 2674
I //�::,259
�Pwl280
---PW11309
2299 Xmnl
21tl0 Seal
Pwil 1131
2070 Pvul.... •mp' pUC18 I pUC19
2060 A¥all'
2000
(2.69 kb)
1922 M!II A/1111 806
--•
�--·--�� N--��·��--��
pUCtl
•
Hg/Ell 1387
==uo==-===. o••=, ��·=�•===�---=ITT-==

2 3 t S 6 t 2 ) 5 I 1 I t 10 11 12 13 1' 11 ,. 17 1f 1 I
EooAt J(onl Sm.I Samtil XMI Sj,/11

Xmol
pUCtt
2 3 • 1 3 ,s11r1 10 11 12 13 1• IS 11 17 11 5 • 7 •
1
fl'w MM .. n,,, Pro Ser UY HI§ A&I; Cys Arg s.. l1't UU Oh.I AN1 Pro Ar9 V# Pl\'I -Ser S., Ser U\I AM
AM
ATO ACC ATC ATT AC0 CCA AOC TTO CAT OCC fQC MlG TCG TCA CTG 0CC
ACT CTA GAO OAT CCC 000 OTA CCG AOC TCG M-Y
-
SMI
H,ncll
Gambar 12. Peta restriksi pUC18/19. Plasmid ini berukuran 2,69 kb dan 111e111bawa gena
resistensi terhadap ampisilin dengan arah transkripsi ditunjukkan oleh anak
panah. Pl.ac adalah promoter lac dengah tmnskripsi seperti ditunjukkan oleh
anak panah. Pada pUC18, EcoRI terletak dekllt promoter lac. Sedangkan pada
pUC19, Hindlll terletak dekat promoter lac (diadaptasi dari Sambrook et al.,
1989).
66
•
•
•
•
•
•
Struktur replikon pSClOl dari pLG332 seperti pada

Gambar 14A, frekuensi inisiasi replikasi tergantung jumlah
RepA dalam sel. Apabila jumlah protein RepA sudah
sudah tercapai rnaka protein RepA akan menempel pada
lokus 4,
5, dan 6, yang mengakibatkan transkripsi RepA terhenti.
Apabila jumlah protein RepA rendah akan menempel pada
lokus l, 2, dan 3, dan kemudian diikuti dengan penempelan
IHF, DnaA serta kompleks DnaB-DnaC maka pada daerah
itu terjadi pembengkokan dan ter�entuk untai tunggal
(Gambar 148). Pembukaan ini terjadi karena daerah itu
kaya akan AT dan terjadilah inisiasi replikasi.
pOU71. Plasmid ini mernbawa promoter 11.pR
dan gena cl857 yang merupakan represor lamda, yang
terletak di sebelah gena yang mengendalikan replikasi
plasmid Rl. Pada suhu di bawah 30°C plasmid ini
terdapat hanya satu duplikat per sel. Sedangkan pada
suhu 42°C terjadi replikasi terus rnenerus, karena represor
cl857 tidak dapat menempel pada operator 11.pR. Sel yang
rnembawa plasmid ini akan berhenti turnbuh setelah
diinkubasi selama 1 - 2 jam pada
42°C. Pada saat itu SOo/o DNA total merupakan plasmid, atau
lebih 1000 plasmid per sel. Selama masa kecepatan replikasi
naik terjadi amplifikasi yang besar dalam jumlah plasmid
dan protein yang dibawa oleh plasmid, sebelurn sel itu
kemudian mati Plasmid jenis ini dinarnakan runaway vector.
PUSTAKA DNA
Isolasi gena yang menyandi suatu protein biasanya

merupakan salah satu tujuan dalam biologi molekular.
Pada organisme prokariot, gena struktural terdapat dalam
satu rentang dengan ukuran sekitar 1,5 kb. Pada eukariot,
70
•
•
•
•
•
•
BIOTEKNOLOGI KESEHAT AN
(A) Pembuatan rekombinan pBR322 TrpA
,,,.,,
EcoRI EcoRI
J+ "It. Ligate
(B) Transform Ecoli TrpA.
T A
TrpA·
0 Non rekombinan
t
- ..
0
rekombinan TrpA"
(C) Gena terekspresl

\
Protein TrpA
0
(0) Dltumbuhkan
pada
I
medium saderhana
Gambar 15. Strategi kloning ge11a trpA dengan pe11apisa.11 secara komplententasi. A.
Strategi pustaka DNA. 8. Transformasi ke set inang E.coli trpA negatif. C.
Plasmid mengekprsikan protein TrpA. D. Koloni yang 111e111bawa trpA hidup
pada media tanpa triptofan (diadaptasi dari Braum, 2001).
Pada cara komplementasi, sel inang terlebih dahulu

dibuat mutasi pada gena yang ingin diklon. Sebagi contoh,
mengklon gena trpA E.coli. Gena trpA ini merupakan salah
satu gena yang terlibat dalam biosintesis triptofan. Mutasi
74
•
•
•
•
•
•
51 untuk memotong struktur jepit rambut dan mendegradasi

DNA untai tunggal. Sampel ini mengandung campuran
cDNA dengan panjang sempuma dan yang lebih pendek.
Populasi cDNA ini dapat diklon dengan ligasi ujung
tumpul pada vektor dan menghasilkan pustaka
cDNA. Pustaka ini dapat ditapis dengan hibridisasi DNA
atau uji imunologik untuk mengidentifikasi klon yang
membawa cDNA target. Pada penapisan imunologik,
cDNA harus diklon pada lokus yang letaknya di
bawah kendali promoter bakteri supaya terjadi
transkripsi dan translasi.
5'
AAA(A)
+ dNTP
primer poli dT
5' ! transkriptase balik
s·
3·
\ /VVVV\ illc1i 3•
5'
3'
TTTT s·
\ AAA(A) , 3
5'
!
\ TT TT s·
AAA(A) 3·
Gambar 16. Sintesis untai pertama dari cDNA dengan menggunaknn primer oligo(dT)
dan transkriptase balik. (diadapiasi dari Sa111brook et al, 1989).
'
78
•
•
•
•
•
•
• Masuk dalam siklus lisogenik, genom bakteriofaga

11, dalam sel berintegrasi dalam DNA kromosom
bakteri inang dengan cara rekombinasi pada lokus
spesifik. DNA bakteriofaga ).. ini akan diturunkan
kapada bakteri anakan seperti halnya bagian
kromosom bakteri. Selama lisogenai ini hanya satu
gena bakteriofaga yang terekspresi yaitu gena cl
penyandi represor. Cekaman nutrisi atau lingkungan
dapat melepaskan DNA virus dan masuk dalam
siklus lisis.
Bakteriofaga 1 dengan ukuran sekitar 50 kb ini

mempunya 20 kb bagian integrasi dan eksisi (1/E) yang
dapat diganti dengan 20 kb DNA yang diklon. Molekul
ini dinamakan bakteriofaga rekombinan yang tidak dapat
masuk dalam siklus lisogeni tetapi pasti masuk dalam
siklus lisis.
Untuk mengetahui bagaimana fungsi sistem kloning
bakteriofaga ).. diperlukan pengetahuan aspek molekuler
siklus lisis. Bakteriofaga ).. terdiri atas protein ekor dan
protein kepala yang membungkus 50 kb DNA genom.
Pembuatan dan penggabungan kepala dan ekor, dan
pembungkusan DNA merupakan peristiwa berurutan
yang teratur. DNA dalam kepala partikel lambda berupa
molekul linier dengan ukuran sekitar 50 kb, dengan 12 basa
untai tunggal pada kedua ujung 5'. Bagian ini dinamakan
ujung kohesif (cos), karena keduanya mengandung sekuan
yang komplemen satu dengan lainnya. Setelah menginjeksi
DNA lambda melalui ekomya ke dalam E.coli, kedua
ujung cos berpasangan membentuk molekul DNA sirkuler.
Selama tahap awal dari siklus lisis, replikasi DNA terjadi
82 •

•
•
•
•
•
•
hingga menginaktivasi gena lacZ' pada vektor.

Rekombinan menghasilkan plaque jernih, vektor
utuh menghasilkan warna biru.
Vektor substitusi mempunya dua situs pengenalan

endonuklease yang digunakan untuk kloning. Bagian antara
kedua situs itu diganti dengan DNA yang diklon. Vektor
-jenis ini biasanya digunakan untuk membawa fragmen

ukuran besar. Seleksi rekombinasi biasanya berdasarkan
ukurannya. Dua vektor substitusi yang terkenal adalah:
• ,1.EMBL4, dapat membawa sampai 20 kb DNA baru
yang disisipkan pada EcoRI, BamHI dan Sall. Seleksi
rekombinan . :lEMBL4 dapat bedasarkan ukurannya.
• ..:lGEMll dan ,lGEM12, dapat membawa sampai 23
kb DNA sisipan pada polilinker yang mengandung
tujuh pengenalan restriksi. Kedua vektor itu berbeda
polilinkernya tetapi keduanya diapit pengenalan
Sfi1, yang mengenal GGCCNNNNGGCC. Urutan ini
sangat jarang terdapat sehingga dapat diharapkan
juga tidak terdapat pada fragmen yang diklon. Jika
lambda rekombinan dipotong dengan S.fil, fragmen
DNA sisipan akan didapatkan utuh. Rekombinan
diseleksi berdasarkan ukurannya.
Kosmid
Kosmid adalah plasmid yang telah direkayasa yang
membawa sikuen cos yang diperlukan untuk memasukkan
DNA ke dalam partikel bakteriofaga l. Kosmid membawa
replikonseperti ColEl dangena resistensi terhadap antibiotik.
Kosmid dapat dimasukkan ke dalam E.coli dengan cara
transformasi dan diperlakukan seperti plasmid.
86
•
•
•
•
•
•
·'

•
•
•
KonsentrasiDNAdapatdiukurdenganspektrofotometri
UV. A260nm = 1 yang berarti setara dengan 50 µm/ml DNA
.
untai ganda. Kemurnian larutan DNA dapat dilihat
bahwa larutan DNA murni mempunyai rasio A260/A280
adalah 1,8. Jika rasio kurang dari 1,8 menunjukkan adanya •
pengotor protein atau fenol. Sedangkan jika rasio lebih dari

1,8 menunjukkan adanya RNA.
ELEKTROFORESIS
Elektroforesis merupakan teknik pemisahan suatu

molekul dalam suatu carnpuran di bawah pengaruh medan
listrik. Molekul terlarut dalam medan listrik bergerak atau
migrasi dengan kecepatan yang ditentukan oleh rasio
muatan dan massa. Sebagai contoh, jika dua molekul
mempunyai rnasa dan bentuk yang sama, molekul dengan
rnuatan lebih besar akan bergerak lebih cepat ke elektrode.
Elektroforesis melalui gel agarosa atau poliakrilamid
merupakan metode standar untuk pemisahan, identifikasi,
dan pemurnian fragmen DNA. Selain itu elektroforesis gel
poliakrilamid dapat juga digunakan untuk pemisahan,
identifikasi, dan pemurnian protein. Teknik ini rnerupakan
teknik sederhana, cepat dan dapat memisahkan molekul
yang diinginkandarimatriksnya yang tidakdapat
dilakukan oleh prosedur lainnya, seperti sentrifugasi
gradien.
Elektroforesis Gel Agarosa

Agarosa, yang disari dari ganggang laut, merupakan
polimer dengan dasar struktur D-galaktosa dan 3,6-anhidro
L-galaktosa. Gel agarosa mempunyai daya pemisahan lebih
rendah jika dibandingkan dengan gel poliakrilamid, tetapi
94
•
•
•
•
•
•
•
(a) Pemlklran dengan mata (kasar) Hlndlll Sampel
23130bp•••• .. . . .. . ==="-
9416 ••••
6557- • • •
-·-·--
· · ·=
4361 •••• . .... _..,._,,., -&.11-�N • • • • • • • • • c.SOOObp
- ----
hi T Wf · • • .. - - · - .. '°.3200bp
- . .. - --.. . .�=-·
2322- •••
....
2027 • • ••
_.,."',__,_ • - • • • • • - • • c.2000bp
•
(b) Esllmasl dengan grafik (telill)
10
7,5
...
%
O 5 .
e
.l�
l: , .
:,
2,
0 1 2 3 4 5
Gambar 22. Hubungan laj11 migrasi dan 11k11ra11 DNA. Elektrcforesis dapat menetapkan
11k11ra11 DNA. Mobilitas DNA berbmzding ierbalik dengan ukurannya
(diadapiasi dari Broum, 2001).
98
•
•
•
•
TEKNIK 810Loc1 MoKULER _
dalam 500 pasang basa. (2) Sistem ini dapat menampung

jumlah sampel lebih besar daripada agarosa. (3) DNA yang
diperoleh kembali dari gel poliakrilamid sangat murni
sehingga dapat digunakan untuk keperluan percobaan
mikroinjeksi embrio tikus.
Tabel 8. Rentang pemisahan DNA dalam gel poliakrilamid
Akrilamid Rentang pemisahan Sinol silen Biru

(o/ob/v) (Pasang basa) bromfenol
3,5 1000-2000 460 100

5,0 80-500 260 I 65
8,0 60-400 160 45
12,0 40-200 70 20
O•
• :.
•
15,0 25-150 '
60 15
20,0 6-100 45 12
Bis-akrilamid diberikan dalam konsentrasi 1/30 konsentrasi akriiamid.

Angka yang tertera merupakan ukuran pasnng basa darifrogmen DNA untai ganda yang
migrasi bersama pewarna.
Elektroforesis Gel Poliakrilamid-SDS (SDS-PAGE)

Protein dapat dipisahkan berdasarkan ukuran massa•
nya dengan elektroforesis gel poliakrilamid . dengan
sistem tegak (Gambar 24). Sebelumnya, campuran protein
dipanasi dengan natrium dedosil suldat (SDS), suatu
detergen anionik untuk menyelubungi molekul protein.
Penyelubungan ini menyebabkan interaksi non-kovalen
terganggu sehingga molekul protein dalam struktur
primer. Anion SOS berikatan dengan rantai utama dengan
rasio satu molekul SOS untuk dua residu asam amino.
101
�
��:;:�::::::� !'.:=======-:� \.../
,.-.,.
Gambar 24. Alnt elektrofaresis gel
poliakrilamid. Beberapa
sampel dapai dimas11kka11
dalam gel poliakrilamid.
Pipet mikroliter digu11n•
kan untuk 111e11111s11kka11
lnr11t1111 ke dn/11111 s1111111r•
at1. Sampd yang ber1111ta11
negatif akan bergerak ke
anodn, pada bagian boumh
gel (diadaptasi dari Berg
et al, 2002).
Merkaptoetanol atau ditiotreitol juga ditamb�an untuk

mereduksi ikatan disulfida. Kompleks SOS dengan protein
terdenaturasi mempunyai jumlah muatan negatif yang
sebanding dengan ukuran protein. Muatan negafif yang
terdapat pada ikatan SOS ini jauh lebih basar daripada
mutan pada protein asli. Kompleks protein-SOS kemudian
dielektroforesis, sehingga semua molekul protein bergerak
menuju kutub positif. Ketika elektroforesis selesai, protein
dalam gel · dapat ditampakkan oleh pewamaan dengan
perak atau zat wama seperti Coomassie biru, yang akan·
menampakkan beberapa pita (Gambar 25). Coomasive biru
berikatan dengan protein berdasarkan interaksi ionik antara
gugus sulfit pada Coomasive biru dengan asam amino basa,
dan interaksi hidrofobik cincin Coomasibe biru. Pewarna
mampu menghasilkan pita pada jumlah protein 10 - 100 11g.
102
TEKNIK BIOLOGI MOKULER _
Panaskan dengan
SOS
dan
merkaptoelanol
�v---_-}--
c
..
B
Gambar 25. Elektrojoresis gel polinkriln111id-SDS.S11bunit A dan B terikat dengan ikatan

dis11Jfida yang direduksi menjadi SH sehingga menjadi dua polipepiida.
Protein terselubungi SOS menjadi bcr1111111/a11 negatif. Mobilitas protein dalam
gel poliakrilamid-SDS berbanding terbalik dengan log 11k11ran molekulnua.
Protein kecil akan bergerak cepat melewati gel,

sedangkan protein besar bergerak lebih lambat. Mobilitas
kebanyakkan polipeptida di bawah kondisi seperti ini
berbanding lurus terhadap log ukurannya. Beberapa pro•
tein yang banyak mengandung karbohidrok dan protein
103
membran ticlak mengikuti aturan ini. Akan tetapi metode

SOS-PAGE (elektroforesis gel poliakrilamicl-SDS) ini sangat
cepat, peka clan dapat menghasil pemisahan yang baik.
Sebanyak sekitar 0,1 mg (2 pmol) protein menghasilkan pita
yang jelas clengan pewarna Coomassie biru. Pada jumlah
yang kecil (0,02 mg) dapat dideteksi dengan pewarna perak.
Protein clengan perbeclaan ukuran sekitar 2°/o (misalnya
40 dan 41 kD, yang berbeda 10 residu) biasanya dapat
clitunjukkan.
Isoelectric Focusing
Protein dapat juga dipisahkan secara elektroforesis
berdasarkan residu penyusunnya, asam clan basa. Titik
isoelektrik, pl, suatu protein adalah pH dimana muatan
molekul protein itu nol. Pada pH ini, protein itu ticlak
bergerak. Sebagai contoh, sitokrom c, protein sangat
basa, mempunyai pl 10,6, sedangkan albumin serum,
protein bersifat asam, dengan pl 4,8. Misalnya, kedua
protein tersebut dilektroforesis pada gradien pH pada gel
tanpa SDS. Masing-masing protein akan bergerak sampai
mencapai ternpat pada gel itu dimana pH sama dengan pl
protein itu (Gambar 26). Metocle yang memisahkan protein
berdasarkan titik isoelektriknya dinamakan isolectric
focusing. Gradien pH pada gel terbentuk oleh campuran
poliamfolit (polimer kecil clengan berbagai muatan) yang
mempunya berbagai harga pl. Isolectric focusing dapat
memisahkan protein yang berbecla harga pl nya 0,01, yang
berarti protein itu berbecla satu muatannya.
104
+.--� +--- ±
(A) ------ + PH rendah
±
PH tlnggl
+- ± +----+
+-- (-)
(•)
±
4-----
(8)
PH Unggl PH rendah
(•) H
Gambar 26. Prinsip pemisahan isoelectric focusing. Gradien pH ierbentuk sebe/11111

pemberian sampel. (A) Setelah pe1nberia11 sampel dan diberi perbedaa11 vo/tase,
protein akan migrasi pada pH isoelektrik11ya, tempai dimana protein i/11 tidak
bermuatan. (8) Protein membentuk pita yang dapat dipotong dan digunakan
1111tuk percobaan lebih lanju! (diadnptnsi dnri Berg et al, 2002).
Elektroforesis Dua Dimensi

Isoelectric focusing dapat digabungkan dengan SDS•
PAGE untuk mendapatkan resolusi pemisahan tinggi.
Tahap pertama, sampel dilakukan isoeleciric focusing,
untuk memisahkan protein berdasarkan muatannya. Gel
ini kernudian diletakkan horisontal pada bagian atas SDS•
pAGE. Protein yang tersebar bagian atas gel poliakrilamid
sesuai dengan seberapa jauh protein itu bermigrasi selama
isoelectric focusing. Protein itu dielektroforesis dengan
arah tegak lurus (vertikal) untuk rnenghasilkan pola dua
dirnensi. Pada gel pertama, protein dipisahkan dengan
arah horisontal berdasarkan titik isolektriknya dan pada
arah vertikal berdasarkan ukuran protein (Gambar 27).
Protein yang diisolasi dari sel pada kondisi fisiologi
berbeda dapat dilakukan elektroforesis dua dirnensi, dan
dilihat intensitas pitanya. Dengan cara ini, protein tertentu
105
dapat dilihat apakan gena itu terekspresi lebih tinggi akibat

perubahan fisiologi itu. Dengan metode SOS-PAGE atau
isolectric focusing saja, pita yang muncul mungkin masih
merupakan campuran beberapa protein.
PH Tinogl
t•>
I
0
<I)
Gambar 27. £/eklroforesis gel dua dimensi. (A) Pada 11wal11ya sampel protein dipisahkan
berdosarkan. pl nya. Gel ilu ke11111dia11 diiempelkan pada gel poliakrilamid•
SDS, dan elektroforesis dilakuknn tegnk /11n1s terhadap gel pertamn. Protein
dengan pl satna sekrang dipisahkan berdasarkan 11k11r111111ya (diadaptnsi dari
Berg et al, 2002).
106
TEKNIK BIOLOGI MOKULER ------
HIBRIDISASI ASAM NUKLEAT
Hibridisasi asam nukleat merupakan salah satu

metode yang sekarang digunakan secara luas dalam
biologi molekular. Metode ini merupakan metode yang
sangat peka untuk menganalisis maupun menentukan
karakter suatu fragmen DNA. Metode hibridisasi ini dapat
diterapkan pada beberapa keperluan, mulai dari mencari
informasi letak suatu fragmen DNA dalam genom, analisis
transkripsi dan regulasinya, deteksi penyakit genetik dan
sidik jari DNA.
Proses hibridisasi ini berdasarkan pada pembentukan
dupleks antara dua untai asam nukleat yang komplemen.
Ada beberapa macam hibridisasi:
a. Hibridisasi Southern, lokalisasi sekuen tertentu
dalam DNA genom biasanya dilakukan dengan
tehnik yang ditemukan oleh Southern (1975). Dalam
hal ini DNA genom dipotong dengan enzirn restriksi
endonuklease, dan fragmen yang dihasilkan
dipisahkan berdasarkan ukurannya dengan
elektroforesis gel agarosa. DNA kemudian
didenaturasi in situ dan dipindahkan dari gel ke
membran nilon atau membran nitroseluJosa. Posisi
DNA dalam gel sarna dengan posisinya pada
membran. DNA yang menempel pada filter
dihibridisasi dengan pelacak DNA berlabel radioaktif,
dan autoradiografi digunakan untuk menentukan
letak pita yang komplemen dengan pelacak. Saat ini
telah berkembang penggunaan pelacak DNA berlabel
non-radioaktif,
b. Hibridisasi Nothem, rnerupakan modifikasi dari
metode Southern dengan target RNA yang telah
107
BIOTEKNOLOCI KESEHATAN
dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa dengan

menggunakan pelacak DNA berlabel.
c. Hibridisasi dot, target asam nukleat (DNA atau RNA)
ditotolkan pada membran dan keberadaan target
dilacak dengan pelacak DNA atau RNA berlabel.
d. Hibridisasi in situ, rnerupakan hibridisasi antara pelacak
DNA atau RNA dengan target DNA atau RNA pada
preparat sitologis.
Strategi Hibridisasi
Prinsip kerja sistern ini adalah terjadinya pasangan
secara tepat antara dua untai DNA yang komplemen. Cara
hibridisasi asam nukleat secara garis besar dapat dilakukan
sebagai berikut:
1. Pengikatan DNA untai tunggal (target) pada rnernbran.
2. Penambahan DNA pelacak untai tunggal yang telah
berlabel pada kondisi tertentu (suhu dan konsentrasi
ion) supaya terjadi pasangan antara DNA target dan
pelacak.
3. Pencucian untuk menghilangkan kelebihan pelacak
yang tidak menempel pada DNA target yang spesifik.
4. Deteksi adanya hibrid antara DNA target dan pelacak.
Hibridisasi asarn nukleat ini mempunyai tiga unsur

yang harus rnendapat perhatian: DNA pelacak, DNA
target dan deteksi signal. Secara umum langkah pertama
yang diperlukan dalarn proses hibridisasi DNA adalah
denaturasi fragmen DNA sehingga DNA berubah menjadi
untai tunggal. DNA itu kemudian dipindahkan pada
mernbran nitroselulosa atau nilon dan dipanasi pada
suhu 80° C atau disinari dengan ultraviolet sehingga
108
TEKNIK BIOLOGI MOKULER ------
DNA mengadakan ikatan dengan rnembran. Selanjutnya

pelacak yang berupa DNA untai tunggaJ dengan urutan
basa spesifik dan berlabel diberi kesernpatan untuk men•
cari pasangannya dengan rnembentuk dupleks dengan
target yang komplemen. Deteksi terjadinya dupleks ini
dilakukan dengan rnernaparkan pada film x-ray untuk
pelacak berlabel radioaktif atau dengan reaksi warna untuk
pelacak non-radioaktif. Proses pernbetukan dupleks antara
target dan pelacak ditentukan oleh dua hal utarna. Pertama,
dua fragrnen yang rnernbentuk dupleks harus mempunyai
tingkat komplementasi yang tinggi. Artinya, untuk fragrnen
dengan susunan basa -AACGITA- hanya akan berpasangan
dengan fragmen dengan susunan -TGCAAT-. Kedua,
dupleks yang terbentuk harus stabil. Pada umumnya, tingkat
kornplementasi dari dua sekuen tersebut dapat ditentukan
secara rnudah dengan rnengukur stabilitas fragmen dupleks
pada suhu yang semakin tinggi. Stabilitas dupleks pada
dasarnya tergantung pada:
1. Jurnlah basa yang komplemen. Semakin panjang
jurnlah basa yang komplemen, maka dupleks yang
terbetuk semakin stabil.
2. Jenis basa yang komplernen. Jika yang komplernen
itu mengandung banyak pasangan G dan C akan
lebih stabil jika dibandingkan dengan yang banyak
mengandung A dan T. Hal ini disebabkan G dan C
membentuk tiga ikatan hidrogen sedangkan A dan T
hanya mernbentuk dua ikatan hidrogen.
3. Kadar gararn. Komplemen yang terbentuk pada larutan
kadar garam O,5 Mberarti lebih stabil jika dibandingkan
dengan komplemen yang yang pembentukannya
hanya dapat terjadi pada kadar 0,1 M
109
BIOTEKNOLOGl KESEHATAN
4. Suhu. Secara umum suhu optimum hibridisasi untuk

pelacak dengan panjang 200 nukleotida adalah 25° C di
bawah suhu leleh (Tm). Pelacak dengan ukuran lebih
pendek, harga Tm nya juga tendah, suhu hibridisasi
pada Tm - 25° C. Jika suhu dinaikkan maka hibrid
tersebut dapat lepas. Suhu leleh DNA dapat dihitung
berdasarkan persamaan Bolton dan McCarthy:
Tm = 81,5 -16,6(log[Na+]) + 0,4l(o/oG+C) - (600N)

N = panjang oligonukleotida.
Pelacak
Supaya efektif, pelacak yang digunakan harus sangat
spesifik urutan basanya. Dengan kata lain, pelacak harus
hanya hibridisasi pada urutan asam nukleat target yang
komplemen. Positif palsu (misalnya, ada respon pada
hal sekuen target tidak ada) dan negatif palsu sangat
mengganggu dalam mengambil kesimpulan. Pelacak
spesifik dapat untuk membedakan organisme yang ada,
membedakan spesies, menetapkan galur tertentu dalam
suatu spesies, atau rnengidentifikasi perbedaan antara gena.
Pelacak ini dapat berupa suatu DNA atau RNA dengan
panjang kurang dari 50 nukleotida (pendek) atau lebih
dari 100 nukleotida (panjang). Pelacak dapat berasal dari
sintesis kimiawi berdasarkan urutan yang telah diketahui,
gena yai1g diklon atau sebagian dari gena yang diisolasi.
Sekuen yang efektif untuk pelacak dapat diperoleh
dengan beberapa cara. Misalnya, DNA dari organisme
patogen dapat dipotong dengan enzin endonuklease clan
diklon pada suatu plasmid. Plasmid rekornbinan ditapis
dengan DNA genom baik dari galur patogen dan non-
110
------ TEKNIK BIOLOCI MOKULER _
patogen. Plasmid yang membawa DNA yang spesifik

hanya hibridisasi dengan DNA patogen saja. Uji hibridisasi
tambahan dengan DNA pelacak diuji dengan berbagai
organisme untuk melihat apakah terjadi hibridisasi silang
antara calon pelacak itu dengan DNA bukan target. Setiap
calon pelacak harus diuji pada kondisi sampel, termasuk
biakan yang tercampur, dan penetapan batas kepekaan.
Sebenarnya pada awal percobaan, sikuen pelacak perlu
dibandingkan dengan database urutan nukleotida untuk
mengetahui spesifitasnya.
Kemampuan pelacak untuk hibrisisasi dengan DNA
target tanpa pembiakan tambahan atau prosedur ekstraksi
merupakan uji diagnosis yang diperlukan, terutama untuk
sampel klinik. Jika sampel terdapat dalam jurnlah sedikit dan
sulit diperoleh dapat diamplifikasi dengan metode PCR.
Hibridisasi dengan Radioaktif

Pada awalnya, hibridisasi asam nukleat dilakukan
dengan menggunakan pelacak berlabel radioaktif 32P.
Aktivitas yang sangat spesifik menghasilkan signal yang
sangat bagus. Pada sistem deteksi yang baku, peJacak
berlabel radioaktif dicampur dengan DNA target yang
menempel pada membran. Setelah pencucian, tidak ada
pelacak tersisa kecuali yang berikatan dengan DNA
target. Adanya pelacak yang menempel pada DNA target
ditunjukkan dengan film sinar X (autoradiografi), seperti
ditunjukkan pada Gambar 28.
Penggunaan nitroselulosa sebagai fasa pendukung
hibribidisasi bukan pilihan yang ideal. Pertama, asam
nukleat menempel secara hidrofobik bukan ikatan kovalen
sehingga dapat lepas secara pelan-pelan dari matriksnya
111
(A) Plndahkankoloni pada nitroselulose atau nllon

Membran niloni
Bakterl menempel
nltoselulose
membran
I - -, I
(B) Sel pecan, DNA lepas
'
Bakterla
Alkali +
\ Protease
80 C atau radiasi
Unlal
2 jam Sina.r UV
•••
tunggal
�
DNA berkaltan
peda begian
\
DNA berkaltan
gula-phosphate dengan membran
Flim X-ray
(C) Pelacak ONA benanda
\
Cuci
�> Jl.on9<J'
Tempelkan film x-ray
(0) Hasil autoradiograf
••
•• •
..
•• •
••
•
•
•
Positive
Gambar 28. Skema teknik hibridisasi dot untuk koloni dengan pelacak radioaktif(diadaptasi
dari Brown, 2001)
112
------ TEKNIK BIOLOGI MOKULER -----
-
selama hibridisasi dan pencucian pada suhu tinggi. Kedua,

membran nitroselulose mudah patah jika kering. Untuk
mengatasi masalah ini telah dikembangkan beberapa jenis
membran nilon yang dapat berikatan dengan asam nukleat
secara ireversibel dan lebih tahan daripada membran
nitroselulose.
Ada dua jenis membran nilon yang dapat dibeli: nilon
non-modifikasi dan nilon dengan modi.fikasi muatan.
Walaupun pada kedua jenis membran nilon itu DNA
dapat berikatan, tetapi membran nilon dengan modi.fikasi
muatan lebih disenangi untuk transfer dan hibridisasi,
karena permukaannya yang bermuatan positif mempunyai
kapasitas lebih besar untuk mengikat asam nukleat yang
bermuatan negatif. Membran nilon harus diperlakukan
untuk irnobilisasi DNA setelah DNA ditransfer. DNA akan
berikan kuat dengan membran nilon setelah kering atau jika
disinari dengan sinar ultraviolet (254 nm) beberapa detik.
Ada beberapa metode untuk hibridisasi pelacak
radioaktif pada asam nukleat yang terikat pada membran,
Berbagai metode ini berbeda dalam beberapa hal:
• Pelarut dan suhu yang digunakan (misalnya, suhu
68° C dalarn pelarut air atau 42° C dalam form.amid
SOo/o). ·
• Volume pelarut dan lama hibridisasi (volume yang
besar dengan waktu hibridisasi 3 hari atau volume
kecil dengan waktu 4 jam).
• Derajad dan rnetode penggoyangan.
• Penggunaan pereaksi Denhardt untuk menghalangi
penempelan tidak spesifik pelacak pada pemukaan
membran.
• Konsentrasi pelacak dan aktivitas spesifiknya.
113
Penggunaan senyawa seperti dekstran sulfat atau

polietilen glikol, untuk manaikan kecepatan reasosiasi
asam nukleat
Hibridisasi Non-radioaktif
Seperti diketahui bahwa 32P mempunyai waktu
paro pendek, berbahaya karena radiasi dan memerlukan
peralatan khusus untuk menggunakan dan membuangnya.
Oleh karena itu sistem nonradioaktif dikembangkan
untuk untuk menggantikan sistem radioaktif. Sistem
deteksi nonradioaktif menghasilkan signal dengan
mengubah senyawa tak berwarna menjadi berwarna
atau berfluorosensi. Signal ini dideteksi dengan cara
menggabungkan nukleotida berlabel biotin dalam sintesis
pelacak. Prosedur pokok hibridisasi nonradioaktif dapat
dijelaskan sebagai berikut:
1. Hibridisasi pelacak berlabel biotin pada DNA target
(Gambar 29a).
2. Tambahkan avidin atau streptavidin (Gambar 29b).
3. Tambahkan enzim berlabel biotin, misalnya fosfatase
alkali (Gambar 29c).
4. Tergantung pada enzim yang digunakan, tambahkan
substrat kromogenik atau kemiluminesen maka akan
terjadi perubahan warna atau pancaran sinar sebagai
akibat dari perubahan substrat menjadi produk yang
dapat diukur (Gambar 29d). Apabila digunakan
fosfatase alkali dapat digunakan substrat BCIP
(S-bromo-4-kloro-3-indolilfosfat) dan NBT (nitrobleu
tetrazolium) akan menghasilkan warna biru.
114
•
TEKNIK BIOLOGI MOKULER
(A)
NA large!
(B)
(C)
FQll.fatase aDl.alln
/bertabel blofik
B
Gambar 29. Deteksi kemilumlnesen dari DNA target. 8, biotin; AP,Josfatase alkali.
A. Pelacak berlabel biotin berikatan dengan DNA target.
8. Streptauidin berikata11 dengan molekul biotin.
C. Fosfatase berlabel biotin berikaian dengan streptaoidin.
D. Fosfntase alkali mengubah substrat menjadi senyawa yang memancarkan
sinar (diadaptasi dari Glick and Pasternak, 1998)
115

Cara lain, setelah hibridisasi dengan pelacak berlabel

biotin, tambahkan langsung kompleks streptavidin-enzim
berlabel biotin. Selain streptavidin dapat juga digunakan
avidin yang berikatan kuat dengan biotin. Protein ini
mempunyai empat lokus pengenalan sehingga satu molekul
avidin atau streptavidin dapat mengikat enzim berlabel
biotin dan pelacak ber]abel biotin. Pada sistem deteksi
kromogenik, enzim mengubah substrat dan menghasilkan
senyawa berwarna yan.g tidak larut dan tetap pada tempat
hibrid DNA. Pada sitem kernilurninesen, enzim mengubah
sustrat menjadi senyawa yang memancarkan sinar.
Sistem non radioaktif menunjukkan beberapa
kelebihan daripada sistem radioaktif: DNA berlabel biotin
dapat stabil selama satu tahun pada suhu kamar; alat yang
dipergunakan untuk rnendeteksi kernilurninesen sangat
peka. Deteksi sinar yang dipancarkan dengan film sinar
X atau lurninometer, atau menghitung perubahan warna
yang dapat diselesaikan dalam beberapa jam. Penggunaan
kernilurninesen, yang lebih peka daripada kromogenik,
diduga akan menjadi sistem pilihan untuk deteksi signal.
Molecular Beacons
Molecular beacons adalah pelacak DNA jenis baru yang
dikembangkan sejak 1996. Pelacak jenis ini merupakan
oligonukleotida untai tunggal yang mempunyai bentuk
cepit rarnbut (tangkai dan lengkun.g). Bagianlengkungpelacak
ini mempunyai urutan spesifik yang komplemen dengan
urutan DNA target. Sedangkan bagian tangkai mempunyai
lima sampai tujuh basa yang saling komplemen dengan
masing-masing ujung membawa senyawa fluorofor dan
pemadam, contoh: 5'-tetrametilrodamin (TMR)-CCTAGC
116
TCTAAATCGCTATGGTCGGCTAGG-dabsil3'. Pada ke•

adaan pelacak ini berbentuk cepit rambut, molekul TMS
dan dabsil letaknya berdekatan sehingga tidak terjadi
fluoresensi karena terjadi pemindahan energi. Jika pelacak
ini menempel pada DNA target, maka letak TMS betjauhan
dengan dabsil sehingga terjadi fluoresensi. Metode ini
dikembangkan lebihlanjutdengan menambahkan penerima
energi dari sinar diletakkan dekat fluorofor sehingga tetjadi
perpindahan energi. Sistem pelacak seperti ini kemudian
digunakan pada real-time PCR.
HmRIDISASI
ANTIBODI
Antibodi akan mengikat antigen pada lokus yang

sangat spesifik. Ada beberapa cara untuk menetapkan
apakah antibodi telah berikatan dengan antigen target.
ELISA (Enzime-Linked lmmunosorbeni Assay) merupakan
salah satu metode itu yang sering digunakan untuk deteksi
diagnosis. Prinsip ketja ELISA tak langsung meliputi
langkah-langkah ini.
1. Tempelkan sampel yang diuji yang diduga mengan
dung molekul target atau organisme target pada suatu
tempat, misalnya lempeng mikrotiter plastik (Gambar
30.a).
2. Tambahkan antibodi primer yang dapat mengenali
molekul target dalam sampel dan kemudian dicuci
untuk menghilangkan · antibodi primer yang tidak
berikatan dengan molekul target (Gambar 30 b).
3. Tambahkan antibodi sekunder yang hanya menempel
pada antibodi primer dan tidak menempel pada
molekul target (Gambar 30 c). Pada antibodi sekunder
117
ini terkonjugasi suatu enzim, seperti fosfatase alkali,

peroksidase atau urease.
4. Tambahkan substrat tak berwarna (Gambar 30.d).
Enzim pada antibodi sekunder tersebut mengkatalisis
suatu reaksi yang mengubah suatu substrat yang tidak
berwarna menjadi senyawa berwarna. Cuci campuran
itu untuk menghilangkan antibodi sekunder-konjugat
enzim yang tidak menempel pada antibodi primer.
Jika antibodi primer tidak menempel pada molekul

target dalam sampel, maka pada tahap pencucian pertama
antibodi itu telah tidak ada. Akibatnya, antibodi sekunder•
konjugat enzim tidak dapat menempel dan akan hilang
pada pencucian kedua. Akhirnya, campuran itu tetap
tidak berwama. Sebaliknya, jika ada molekul target dalam
sampel, maka antibodi primer menempel pada molekul
target itu. Selanjutnya antibodi sekunder menempel pada
antibodi primer dan enzim yang terikat pada antibodi
sekunder mengkatalisis suatu reaksi yang membentuk
senyawa berwarna.
Gambaran pokok sistem ELISA adalah penempelan
antibodi primer pada bagian tertentu dari molekul target.
Jika ada molekul target, misalnya suatu protein, maka
protein itu diisolasi sehingga murni. Kemudian protein
itu digunakan untuk menghasilkan antibodi yang akan
digunakan untuk mendeteksi target itu. Campuran berbagai
antibodi yang dihasilkan yang terdapat pada serum
(antiserum) dari hewan yang diinokulasi (kelinci) membuat
sejurnlah antib,odi yang berbeda-beda yang masing•
masing menempel pada bagian tertentu dari melekul
target (epitop). Campuran antibodi ini dinamakan sediaan
118
------ TEKNIK BIOLOGI MOKULER
A Penempelan sampel pada membran

Situs
/Membran
B Tambahkan antibodl primer: cuci
Antibodl
primer
� berkailan
•••••••••••••
C Tambahkan antibodi sekunder-konjugat enzym; cuci
Antibodi Enzim terikal

sekunder / antibodl sekunder
D Tambahkan subtrat
Gambar 30. Prinsip ELISA tak: langsung (diadaptasi dari Glick and Pasternak, 1998).
119
poliklonal. Untuk uji diagnosis tertentu, penggunaan

antibodi poliklonal menunjukkan kelemahan: jumlah
masing-masing antibodi dalam sediaan poliklonal dapat
berbeda; dan antibodi poliklonal tidak dapat membedakan
antara dua target yang serupa. Misalnya jika perbedaan
antara bentuk patogen (target) dan nonpatogen (nontarget)
mempunyai determinan yang sama. Akan tetapi masalah
ini dapat diatasi sebab saat ini dapat dihasilkan sediaan
antibodi yang hanya mengenal determinan tunggal,
yang dinamakan antibodi monoklonal. Suatu antibodi
monoklonal menempel pada suatu bagian tertentu dari
molekul target, maka protokol ELISA dapat dinaikkan
selektifitasnya dengan menggunakan antibodi monoklonal.
Banyak antibodi monoklonal telah dikembangkan untuk
penggunaan berbagai diagnosis berbagai senyawa atau
organisrne patogen.
SIKUENSING DNA
Dalam aras molekular, pengertian tertentu dari
suatu molekul DNA diperoleh dari penetapan urutan
nukleotida (sikuensing). Fungsi suatu gena biasanya dapat
dideduksi dari urutan nukleotidanya, misalnya dengan
membandingkan urutannya urutan nukleotida suatu
gena yang telah diketahui fungsinya. Informasi urutan
nukleotida merupakan hal yang penting dalam biologi
molekular. Urutan nukleotida suatu fragmen DNA dapat
ditetapkan dengan prosedur kimia yang ditemukan oleh
A.Maxam dan Yif. Gilbert atau prosedur enzimatik yang
dikembangkan oleh F. Sanger. Metode enzimatik biasa
dikenal sebagai metode dideoksinukleotida yang saat ini
merupakan metode yang paling banyak dipakai.
120
Dideoksinukleotida
MolekuJ dideoksinukleotida merupakan molekuJ
buatan yang tidak mempunyai gugus hidroksil pada karbon
2' dan 3' pada gula ribosa (Garnbar 31.A). Sedangkan,
deoksinukleotida alami mempunyai gugus 3'-hidroksi pada
guJanya (Gambar 31.B). Pada replikasi DNA, nukleotida
trifosfat berikutnya yang bergabung ditetapkan oleh
kecocokan basa pasangan pada untai cetakan, dihubungkan
oleh gugus S'-fosfat kepada 3'-hidroksil nukleotida
terakhir dari untai yang sedang tumbuh (Gambar 32).
Akan tetapi jika dideoksinukleotida yang bergabung pada
ujung untai yang sedang tumbuh, sintesis DNA berhenti
karena ikatan fosfodiester tidak dapat terbentuk dengan
nukleotida berikutnya (Gambar 33). Terminasi sintesis
A
0 0 0
II II II
o--p-o-P-O-P-O-CH2 Basa
I I I 0
o o o
H
2' H
H
B
0 0 0
II 11 II
o·-p-o-P-O-P-0-C� Basa
I I I
o· o· o· 0
H H
H
OH 3' 2' H H
Garnbar 31. Struktur nukleotida trifosfat

A. Deoksinukleotida, tidak mempunqai g11gus hidroksil pada C2' dan 3'.
B. Deoksinukleotida (diadaptasi dari Glick and Pasternak, 1998).
121
Bahan°dengan hak cipta
You have either reached a page that is unavailable for viewing or reached your viewing Ii mit for
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
this book.
ISBN 978-979-21-1722-6
117226

Dna Rekombinan

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Dna Rekombinan

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

I .

PENERBIT KANISIUS (Anggota IKAPI)

Hak cipta dilindungi undang-undang

Dicetak oleh Percetakan Kanisius Yogyakarta

Bahan dengan hak cipta

2. IEKNOLOGI DNA REKOMBINAN ·43

Bahan dengan hak cipta

KLONING GENA EUI<ARIOT ·-·········· 76

3. TEKNIK BIOLOGI MOLEKULAR 91

Primer Jal an . 129

Sikuensing Otomatik 131

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) 131

4. SINTESIS BIOLOGI 151

5. DIAGNOSIS MOLEKULAR 199

6. TERAPI GENA 237

ASAM NUKLEAT SEBAGAI AGEN TERAPETU< 262

DAFTAR PUSTAKA 277

Gambar 1. Prosedur kloning....................................................................... 44

Gambar 11. Penapisan untuk sisipan dengan

Gambar 12. Peta restriksi pUC18/19....... 66

Garn.bar 33. Sintesis DNA terhenti....................................................... 123

Bahan dengan hak ctpta

misalnya, mengekspresikan suatu protein manusia pada

PERKEMBANGAN BJOTEKNOLOGI KESEHATAN

Bioteknologi kesehatan merupakan bidang yang

dapat memperrnudah semua produksi protein dalam

Tabel 1. Beberapa obat yatig diperolek dari ekstraksi

Rekayasa genetik dan teknologihibridorna dapatmeng•

ini akan berpengaruh pada pengobatan kelainan genetik

Tabel 2. Beberapa protein manusia yang telah disintesis

Mirt'O\llonab-CD3 Penolakan trans· ..

Jika berhasil, pengernbangan obat peniru dengan

protein, dapat mudah dipisahkan dengan penukar ion atau

Elektroforesis gel poliakrilamid-SDS

Semua biofarmasetik harus disertai spesifikasi potensi.

efek klinis meliputi Escherichia coli, Haemopilus infiuenzae,

kapiler sangat mempermudah deteksi adanya kontaminan.

Bioteknologi molekuler harus memberikan berbagai

Walaupun bidang bioteknologi molekular merniliki

2. Apakah prosedur diagnosis melanggar kebebasan

Para pemerhati lingkungan khawatir dampak buruk

oleh K. Cambel dari Roslin Institute, Edinburg, Scotland.

ada tahun 1971 - 1973, penelitian genetika kembali

Bahan dengan hak cipta

tetapi DNA rekombinan biasanya meliputi beberapa cara

• ----• DNA veklor tinier

! Masuk ke dalam set inang

Protein yang -�it=:----....

• DNA dari organisms donor diekstraksi, dipotong

Walaupun teknologi DNA rekombinan berkembang

Untuk kloning, DNA donor (kromosom) yang me-

pemotongan yang acak. Setiap DNA sampel yang disonikasi

Gugus 3'-hidroksi Gugus 5'-Iostat

basa dari lokus EcoRI. BamHI memotong fragmen EcoRI

100 400 300 i 250 600

Gambar 4. Peta restriksi suntujragmen DNA. A. Frogmen hasil pemisahan elektroforesis.

Gambar 6. Mekanisme kerja ligas11 DNA. A. Fraginen DNA berr1j11ng kohesifpen1oto11gan

Kemampuan menyambung dua molekul DNA

Replikasi plasmid dilakukan oleh sejumlah enzim yang

resirkuler ini, plasmid linier terlebih dulu diinkubasi

TRANSFORMASI DAN SELEKSI

Langkah berikutnya dinamakan transformasi yaitu

-1. Hg/Ell 185