3.

4 Prosedur Kerja Sterilisasi

1. Sterilisasi Alat
 Sterilisasi panas kering
Metoda ini diterapkan terhadap peralatan yang terbuat dari gelas, logam ataupun
bahan-bahan lain yang tidak gosong pada suhu tinggi. Bahan-bahan yang mengandung
kapas, kertas ataupun plastik tidak dapat disterilkan dengan metoda sterilisasi panas
kering. Pisau dan skalpel hendaknya tidak disterilkan dengan cara ini karena suhu yang
tinggi dapat mengakibatkan tumpulnya mata pisau. Oven yang terdapat pada kompor
listrik ataupun kompor gas rumah tangga dapat digunakan untuk sterilisasi panas kering
seperti halnya oven pengering yang banyak dimiliki oleh laboratorium.
Ada tiga periode waktu yang perlu diperhatikan dalam menentukan lamanya
sterilisasi panas kering ini. Biasanya dibutuhkan waktu lebih-kurang 1 jam (periode
pemanasan) agar seluruh isi oven mencapai suhu sterilisasi. Lamanya waktu yang
dibutuhkan untuk berbagai suhu sterilisasi adalah 45 menit pada suhu 160℃, 18 menit
pada suhu 170℃, 7,5 menit pada suhu 180℃ dan 1,5 menit pada suhu 190℃. Untuk
suhu sterilisasi 160℃ (320℉) memerlukan total waktu sterilisasi selama lebih-kurang
2 jam. Dianjurkan untuk membiarkan oven dingin dengan sendirinya guna
menghindarkan pecahnya peralatan yang disterilkan akibat penurunan suhu yang
mendadak. Benda-benda yang akan disterilkan dibungkus dengan rapi di dalam
aluminium foil sebelum dimasukkan ke dalam oven. Di Amerika Serikat terdapat tiga
kelas aluminium foil yang beredar di pasaran, di mana kelas heavy-duty adalah yang
paling sering digunakan di dalam pekerjaan kultur jaringan. Pada aluminium foil dari
kelas yang lebih rendah seringkali terdapat lobang-lobang halus, sedangkan aluminium
foil kelas extra heavy-duty terlalu tebal bila digunakan sebagai pembungkus. Setelah
sterilisasi, benda-benda yang berada di dalam bungkusan diletakkan di dalam kotak
pindah. Sterilisasi uap kering memiliki 2 metode yaitu :
a. Menggunakan oven udara-panas
Metode ini sebaiknya hanya digunakan untuk peralatan gelas atau logam (spuit
dan bevel yang dapat dipakai ulang, pipet, dll.) ketika tidak tersedia autoklaf.
Metode ini tidak boleh dipakai untuk media kultur yang digunakan dalam
mikrobiologi. Media kultur tersebut seharusnya di-autoklaf
1) Siapkan objek yang akan disterilkan dengan cara yang sama seperti pada
autoklaf. Sumbat kapas tidak perlu terlalu tebal. Kalau tidak, udara panas tidak
dapat menembusnya. Angkat sedikit penutup wadah-logam dan atur
sedemikian rupa sehingga wadah tersebut menghadap bagian belakang oven.
2) Atur termostat pada suhu 175°C dan hidupkan oven. Bila oven dilengkapi
dengan kipas, periksa apakah kipas tersebut berfungsi atau tidak.
3) Perhatikan termometer. Ketika suhu mencapai 175°C, lanjutkan pemanasan
pada suhu tersebut selama 60 menit. Bila objek yang disterilkan berat atau
cukup besar atau mengandung serbuk, minyak, atau jelly petroleum, panaskan
pada suhu 175°C selama 2 jam.
4) Matikan pemanas. Tunggu sampai suhu turun menjadi 40°C. Buka oven.
Tutup wadah logam. Angkat objek yang telah disterilkan.
b. Dengan pembakaran
Metode ini sebaiknya hanya digunakan untuk peralatan logam seperti pinset dan
skalpel. Metode ini tidak sesllai untuk penggunaan umum.
 1) Taruh peralatan dalam wadah logam.
2) Tambahkan kira-kira 10 tetes etanol, lalu bakar.
3) Selama pembakaran, miringkan posisi wadah pada tiap sisinya secara
bergantian (Gbr. 3.69). Untuk mensterilkan sengkelit (untuk pemeriksaan
bakteriologis), panaskan sengkelit di atas pemanas gas atau lampu spiritus
sampai merah-membara.

 Sterilisasi Panas Basah

Prosedur sterilisasi ini menggunakan Autoklaf yang dioperasikan dengan uap
bertekanan. Apabila tidak ada Autoklaf, maka dapat digunakan penanak bertekanan
yang umum digunakan di dalam rumah tangga. Untuk sterilisasi bahan-bahan yang
terbuat dari kertas, peralatan gelas, alat-alat tanam dan benda-benda cair yang
volumenya tidak melebih 50 mL per wadah, digunakan uap bertekanan 15 psi (103,4
kPa) pada suhu 121℃ (250℉) selama 15 menit. Waktu minimum untuk sterilisasi
ditingkatkan sesuai dengan bertambahnya volume benda-benda cair yang disterilkan.
Sebagai contoh, untuk volume 75 mL per wadah dibutuhkan waktu sterilisasi 20 menit,
volume 250 - 500 mL per wadah memerlukan waktu sterilisasi 25 menit, sedangkan
volume 1.000 mL per wadah menghendaki waktu sterilisasi selama 30 menit (Biondi
dan Thorpe, 1981).

Gambar Autoklaf listrik portabel yang digunakan pada sterilisasi media dan peralatan dengan
metode panas basah.

Jangan memulai penghitungan waktu sterilisasi sampai Autoklaf atau penanak

bertekanan mencapai suhu yang dikehendaki dan semua sisa udara di dalamnya
digantikan oleh uap panas. Jika menggunakan penanak bertekanan, jangan menutup
klep pelepasan sampai terlihat semburan uap yang ke luar. Pada akhir periode
sterilisasi, tekanan di dalam autoklaf ataupun penanak bertekanan dikembalikan ke
kondisi tekanan atmosfer secara perlahan-lahan, karena penurunan tekanan yang
mendadak (dekompresi) dapat menyebabkan cairan di dalam wadah menyemprot dan
tumpah. Sterilisasi autoklaf yang terlalu lama hendaknya dihindari., karena dapat
menyebabkan terjadinya dekomposisi pada bahan-bahan kimia yang terdapat di dalam
medium. Prosedur sterilisasi :
1) Isi bagian dasar autoklaf dengan air (sebatas penyangga keranjang). Pastikan
bahwa air tidak menyentuh keranjang. Bila perlu,.salirkan kelebihan air dengan
membuka keran penyalir.
 2) Letakkan keranjang berisi peralatan yang akan disterilkan dalam autoklaf bersama-
sama dengan kertas indikator sterilisasi. Kertas indikator berubah menjadi hitam
bila temperatur yang tepat sudah tercapai.
3) Tutup autoklaf, pastikan bahwa cincin karet sudah pada tempatnya. Putar sekrup-
pengunci ke bawah, rata dan kuat, tetapi jangan terlalu kencang.
4) Buka katup pengeluaran udara.
5) Mulai panaskan autoklaf.
6) Perhatikan katup pengeluaran udara sampai timbul kepulan uap. Tunggu 3 atau 4
menit sampai kepiIlan uap tersebut homogen dan kontinu. Hal ini menunjukkan
bahwa semua udara sudah keluar dari autoklaf.
7) Tutup katup pengeluaran udara. Kencangkan sekrup-pengunci dan panas dikurangi
sedikit.
8) Perhatikan pengukur suhu. Ketika suhu yang dikehendaki sudah tercapai (yi.,
120°C), panas harus diatur untuk mempertahankan suhu tersebut. Kurangi panas
sampai jarum penunjuk konstan pada suhu yang telah ditentukan. Kalau sudah,
mulai penghitungan waktu sterilisasi.
9) Matikan pemanas segera setelah waktu yang dibutuhkan selesai
10) Ketika suhu turun dibawah 100°C, buka katup pengeluaran udara untuk
menyeimbangkan tekanan di dalam dan di luar autoklaf.
11) Ketika bunyi desis (uap) berhenti, buka sekrup-pengunci dan penutup autokIaf.
Biarkan autoklaf sampal dingin, kemudian angkat keranjang tempat peralatan steril
dengan hati-hati.
12) Bila terdapat tetesan-tetesan air, keringkan peralatan steril tersebut dalam inkubator
pada suhu 37°C, bila memungkinkan.
Setelah sterilisasi autoklaf, benda-benda yang terbuat dari kertas dan benda-benda
lainnya segera dipindahkan ke oven pengering ( suhu kurang dari 60℃) untuk
menghilangkan uap air yang mengalami kondensasi. Uap panas di dalam autoklaf harus
meresap ke dalam bahan-bahan yang disterilkan; suhu 121℃ tidak dapat menjamin
sterilisasi yang sempurna apabila uap panas tidak meresap ke dalam benda-benda yang
disterilkan. Selain dari botol-botol ataupun wadah-wadah, peralatan dan bahan-bahan
lain harus dibungkus dalam kertas bebas lilin. Walaupun pemakaian aluminium sebagai
sebagai bahan pembungkus cukup luas, namun bahan ini tidak dianjurkan untuk
membungkus peralatan dan bahan-bahan pada sterilisasi autoklaf karena bahan ini tidak
permeabel terhadap uap air. Sebagai sumber uap air pada autoklaf ataupun penanak
bertekanan adalah air demineralisasi. Uap yang berasal dari pembangkit tenaga
eksternal seringkali terkontaminasi oleh berbagai senyawa yang mudah menguap yang
dapat diserap oleh benda-benda yang ada di dalam autoklaf. Prinsip kehati-hatian harus
diterapkan pada sterilisasi panas basah terhadap peralatan laboratorium yang terbuat
dari plastik.
 Sterilisasi dengan pendidihan
Cara ini merupakan pilihan terakhir ketika tidak ada eara lain yang dapat
dilakukan. Gunakan panei pendidih khusus atau kalau tidak ada, gunakan panei
bergagang (saucepan). Isi panci dengan air Oebih baik air demineralisasi) dan panaskan
di atas tungku. Peralatan gelas (spuit yang dapat dipakai ulang) harus dimasukkan ke
dalam panei sewaktu air masih dingin. Peralatan logam (bevel yang dapat dipakai
 ulang, pinset) harus dimasukkan sewaktu air mendidih. Rendam peralatan tersebut
selama 30 menit.

2. Sterilisasi Ruang Kultur

Area tempat bekerja biasanya disterilisasi permukaan baik menggunakan etanol
ataupun isopropanol (70% v/v). Walaupun alkohol masam (70%, pH 2,0) lebih efektif
sebagai disinfektan, namun jarang digunakan karena pengaruh korosif yang
ditimbulkannya pada peralatan yang terbuat dari logam. Etanol pada konsentrasi yang
agak tinggi (80% v/v), yang sifatnya mudah terbakar, digunakan untuk sterilisasi
peralatan secara periodik. Etanol untuk perendaman (80% v/v) dimasukkan ke dalam
tabung reaksi besar (diameter 25 mm x panjang 150 mm), lalu tabung reaksi tersebut
dimasukkan ke dalam suatu wadah kaleng yang terbuat dari logam. Setelah pencelupan
di dalam alkohol, peralatan selanjutnya dipanaskan dengan lampu metanol. Hindarkan
pemanasan peralatan yang terlalu lama setelah alkohol menguap. Apabila tidak
digunakan, tabung etanol hendaknya ditutup untuk menghindarkan terjadinya
evaporasi.

 Sterilisasi Laminar Air Flow

1) Semprot atau lap bagian dalam LAF dengan etil alkohol atau isopropil alkohol 70%
sebelum dihidupkan (sebaiknya gunakan alkohol 70%. Alkohol 95% atau alkohol
absolut dapat menambat bakteri atau spora jamur tanpa membunuhnya).
2) Hidupkan kabinet. Jika menggunakan lampu UV pastikan lampu ini dimatikan
sebelum bahan tanaman dimasukkan ke dalam kabinet.
3) Semprot semua wadah atau bahan-bahan dengan etanol 70% sebelum dimasukkan ke
dalam LAF
4) Cuci tangan dan lengan Anda dengan sabun dan air, lalu usap dengan etanol 70%
sebelum melakukan manipulasi terhadap tanaman. Penting untuk dicatat bahwa etanol
tidak memiliki efek residu; karenanya dianjurkan untuk menggunakan Hexifoam
sebagai gantinya.
5) Jika menggunakan nyala api, bekerjalah dengan ekstra hati-hati.
6) Atur bidang kerja Anda di dalam LAF sehingga lalu-lalang tangan yang berseliweran
dapat dihindari.
7) Bila menggunakan Bacti-Cinerator, panaskan selama 10 menit untuk mendapatkan
pijar api berwarna merah. Sterilkan peralatan sebagai berikut: skalpel kecil selama 6
detik, pinset kecil selama 8 detik, skalpel panjang selama 8 detik, dan pinset besar
selama 10 detik. Pastikan incinerator telah kembali berpijar merah sebelum
mensterilkan peralatan berikutnya. Jangan memanaskan peralatan terlalu berlebihan.
Lakukan sterilisasi sesering mungkin.
8) Biarkan peralatan mendingin pada rak-rak steril.
9) Jika bahan tanaman jatuh pada permukaan LAF, anggaplah telah terkontaminasi, dan
buanglah.
10) Setelah menyelesaikan pekerjaan transfer, matikan LAF, semprot atau lap dengan
etanol 70%, dan tutup pintu depannya.
  Sterilisasi Ruangan Kerja
1) Sterilisasi ruangan dilakukan dengan menyemprotkan alkohol 90%, dan
2) sterilisasi lantai dengan kain pel yang dibasahi dengan alkohol 90% atau dapat
dibersihkan juga dengan menggunakan desinfektan (karbol).

3. Sterilisasi Bahan
Sejumlah komponen penyusun media bersifat tidak stabil pada suhu tinggi dan
harus disterilkan dengan metoda ultrafiltrasi pada suhu kamar. Larutan yang akan
disterilisasi dilewatkan melalui filter dengan ukuran pori tidak lebih dari 0.45-0,22 𝜇m
di dalam kontainer steril. Bahan-bahan penyusun media yang disterilisasi dengan
ultrafiltrasi adalah bahan yang tidak tahan terhadap pemanasan (thermolabile) seperti
zat pengatur tumbuh asam amino, vitamin dan enzim.

4. Sterilisasi permukaan (Sterilisasi Eksplan)

Sterilisasi permukaan terhadap bahan tanaman dapat dilakukan menggunakan
larutan natrium hipoklorit (NaOCl) atau kalsium hipoklorit (Ca[OCl]2 ). Banyak
laboratorium yang memanfaatkan bahan peluntur yang biasa digunakan di dalam rumah
tangga, seperti Clorox. Bahan-bahan yang tersedia di pasaran ini biasanya mengandung
NaOCl 5,25% sebagai bahan aktif. Bila diencerkan dengan air (1 bagian peluntur : 9
bagian air), maka larutan sterilisasi mengandung tidak kurang dari 0,5% NaOCl.
Karena terjadi disosiasi yang menyeluruh, maka hipoklorit memiliki aktifitas yang
relatif rendah pada pH di atas 8,0, dan senyawa ini jauh akan lebih efektif apabila pH
larutan diturunkan hingga 6,0 (Behagel, 1971). Jaringan pembuluh pith atau pun umbi
yang baru dipotong apabila dicelupkan di dalam larutan hipoklorit, maka
permukaannya akan steril setelah lebih-kurang 10 menit. Setelah perlakuan hipoklorit,
bahan tanaman harus dibilas beberapa kali dengan air destilasi ganda steril guna
menghilangkan semua sisa-sisa disinfektan. Potongan jaringan umbi yang relatif besar
harus dibilas berturutturut di dalam gelas piala 600 mL, yang masing-masing berisi
lebih-kurang 200 mL air destilasi ganda steril. Oleh karena hipoklorit dapat
menyebabkan timbulnya korosi pada peralatan yang terbuat dari logam, maka larutan
hipoklorit berikut air bilasannya harus segera dibuang setelah dipakai.
Sejumlah bahan kimia untuk sterilisasi permukaan pada biji telah diuji oleh
Sweet dan Bolton (1979). Didapatkan hasil, bahwa salah satu bahan yang paling efektif
namun menimbulkan kerusakan paling sedikit pada jaringan adalah kalsium hipoklorit.
Ion-ion natrium (yakni yang berada di dalam natrium hipoklorit) dapat menginduksi
perkembangan bibit yang tidak normal. Sebagai tambahan terhadap Ca(OCl)2,
campuran yang digunakan oleh Sweet dan Bolton mengandung suatu senyawa
penyangga yang menghasilkan pH akhir 6,0, dan 1% (v/v) larutan Triton atau Tween-
80 sebagai bahan pembasah. Biji-biji direndam di dalam larutan disinfektan selama 10
menit, kemudian dibilas 3 kali dengan air steril.
Sejumlah peneliti lebih menyukai sterilisasi permukaan biji secara dua tahap,
walaupun keuntungan-keuntungan metoda ini belum terbukti secara ilmiah. Pertama-
tama biji direndam di dalam etanol (70% v/v) dan dikocok selama 2 menit, kemudian
secara aseptik dipindahkan ke wadah ke-dua yang berisi larutan hipoklorit selama lebih-
kurang 20 - 25 menit. Alkohol sendiri telah juga digunakan sebagai bahan sterilisasi
permukaan pada sejumlah penelitian terhadap tanaman berkayu (Bonga, 1982).
Seterilisasi permukaan terhadap bagian-bagian tanaman yang mengandung kutin,
suberin ataupun organ-organ epidermal membutuhkan tambahan sejumlah kecil
deterjen.
Prinsip dalam sterilisasi bahan tanam (eksplan) adalah jaringan tanaman
(eksplan) tetap terjaga hidup tetapi mematikan kontaminan (bakteri atau jamur).
prosedur kerja dalam sterilisasi eksplan adalah
1) Bahan tanam dari lapang dicuci di bawah air mengalir selama 30 menit – 2 jam.
2) Pencucian dan perendaman dalam air sabun juga diharapkan dapat mengurangi
jumlah pathogen yang ada di eksplan atau membuat pathogen lebih accesible
terhadap sterilan.
3) Perendaman dalam larutan fungisida atau bakterisida dapat dilakukan
4) Jenis sterilant yang sering digunakan dalam sterilisasi ekslan bermacam-macam :
sodium hipoklorit (1-10%), calcium hipoklorit (4-10%), hidrogen peroksida (10-
12.5%) dan lain-lain. Sterilant dapat digunakan secara tunggal maupun kombinasi.
5) Sebelum diletakan di medium pertumbuhan, ujung eksplan yang kontak dengan
sterilan dibuang.
Kontaminasi merupakan gangguan yang sering terjadi pada kultur jaringan,
yang dapat terdiri dari bakteri, jamur, atau virus. Untuk mencegah kontaminasi, dapat
dilakukan teknik sterilisasi yang tepat baik terhadap alat maupun bahan serta
lingkungan kerja. Kegiatan sterilisasi bertujuan untuk mengeliminasi patogen atau
cendawan yang mungkin terbawa saat pengambilan eksplan, yang dapat menimbulkan
kontaminasi sehingga menghambat pertumbuhan eksplan menjadi tanaman utuh,
bahan desinfektan yang dapat digunakan menjadi tanaman untuk sterilisasi media
dalam kultur jaringan, diantaranya yang umum dikenal adalah HgCl2 dan NaClO
(Gunawan, 1992; Sugiyama, 1999).
Penggunaan HgCL2 sebagai bahan sterilan dalam kultur jaringan sebenarnya
telah banyak dilaporkan. Pada Penelitian Sulistyo et al (2018), penggunaan bahan
pensteril raksa memang lebih efektif akan tetapi berbahaya terhadap lingkungan karena
sulit untuk diurai serta bersifat toksik, selain itu raksa berpengaruh terhadap kematian
sel tanaman/eksplan. Pada kultur Salacia chinensis, sterilisasi permukaan dengan 70%
etanol selama 1 menit dilanjutkan dengan 1% NaClO (dengan ditambahkan 2-3 tetes
Tween 20) selama 15 menit terbukti lebih efektif untuk eksplan daun yang mencapai
99%, sedangkan direndam dalam 70% etanol selama 2 menit, diikuti dengan 0,1%
merkuri klorida (HgCl2) selama 5 menit terbukti lebih efektif untuk eksplan nodal
(96%) (Majid et al., 2014). Penggunaan NaClO sebagai bahan sterilisasi permukaan
dari berbagai sumber eksplan tanaman telah banyak dilaporkan (Miche dan Balandreau,
2001; Vejsadova, 2006; Badoni dan Chauhan, 2010; Maina et al, 2010; Colgecen et al,
2011; Morla et al, 011), karena hanya berperan sebagai sebagai bahan sterilisasi
permukaan jaringan tanaman maka efektifitas NaClO dalam mengendalikan
kontaminasi pada eksplan juga tidak tinggi. Jika senyawa ini diberikan dalam
konsentrasi dan waktu pemaparan yang rendah juga tidak terlalu efektif dalam
mengendalikan kontaminasi pada eksplan (Farooq et al, 2002). Semakin sedikit
konsentrasi NaClO maka eksplan semakin rentan terhadap patogen, namun apabila
semakin tinggi konsentrasi NaClO maka perkembangan jaringan eksplan menjadi
terhambat (Rismayani dan Hamzah, 2010).