Halaman 1

Penerapan Caco-2 Cell Line dalam Studi Interaksi Ramuan-Obat:

Pendekatan dan Tantangan Saat Ini
C. Awortwe 1 , PS Fasinu 2 , dan B. Rosenkranz 1
1 Divisi Farmakologi Klinik, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Indonesia
Stellenbosch, Tygerberg, Cape Town, Afrika Selatan
2 Pusat Nasional untuk Penelitian Produk Alami, Sekolah Farmasi, Universitas Mississippi,
Oxford, AS
Abstrak
Model Caco-2 digunakan dalam investigasi pra-klinis untuk memprediksi kemungkinan gastrointestinal
permeabilitas obat karena mengekspresikan enzim sitokrom P450, transporter, mikrovili dan
enterosit dengan karakteristik identik dengan usus halus manusia. FDA merekomendasikan ini
model sebagai komponen integral dari Sistem Klasifikasi Biofarmasi (BCS). Paling
laboratorium khusus menggunakan garis sel Caco-2 untuk menyaring entitas kimia baru melalui prediksi
kelarutannya, ketersediaan hayati dan kemungkinan interaksi obat-obat atau ramuan obat di usus
lumen. Namun, tantangan dalam karakteristik yang melekat dari sel Caco-2 dan antar-laboratorium
variasi protokol telah menghasilkan data yang tidak dapat diproduksi kembali. Batasan ini mempengaruhi
ekstrapolasi data dari penelitian pra-klinis hingga studi klinis yang melibatkan obat-obat dan
interaksi obat. Ulasan ini membahas beberapa peringatan ini dan menyebutkan yang masuk akal
pendekatan saat ini dan masa depan untuk mengurangi anomali yang terkait dengan garis sel Caco-2
investigasi yang berfokus pada penerapannya dalam interaksi ramuan obat.
PENGANTAR
Pemberian obat dan xenobiotik oral adalah rute obat yang paling nyaman
administrasi (1,2). Penyerapan obat oral sangat kompleks; dicirikan oleh berbagai tantangan
termasuk karakteristik yang melekat dari formulasi, kondisi fisiologis dan
sifat fisikokimia obat (3). Selain itu, enterosit usus hadir
sistem pertahanan yang terstruktur dengan baik untuk memodulasi masuknya obat dan xenobiotik dari usus
lumen ke dalam sirkulasi sistemik. Metabolisme dan transportasi obat melintasi usus
membran karena itu multifaset dan proses dinamis yang melibatkan pasif dan aktif
mekanisme transportasi (Gambar 1). Karenanya, penyerapan transmembran umumnya diakui
sebagai kondisi dasar untuk memastikan ketersediaan obat sistemik yang efisien melalui gastro-intestinal
sistem.
Ilmuwan riset dan perusahaan farmasi menggunakan pengujian berbasis sel seperti Caco-2
sel dan ginjal kaninus Mardin-Darby (MDCK); termasuk sistem berbasis lipid buatan
Penulis yang Bersesuaian: Charles Awortwe; Divisi Farmakologi Klinis, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas
dari Stellenbosch, Tygerberg, Cape Town, Afrika Selatan; charzos@yahoo.com.

Akses Publik HHS

Naskah penulis
J Pharm Pharm Sci . Naskah penulis; tersedia di PMC 2015 11 Maret.
Diterbitkan dalam bentuk yang diedit akhir sebagai:
J Pharm Pharm Sci . 2014; 17 (1): 1–19.
Naskah Penulis
Naskah Penulis
Naskah Penulis
Naskah Penulis

Halaman 2
pengujian permeabilitas membran buatan paralel (PAMPA) sebagai throughput tinggi praklinis
model skrining untuk evaluasi permeabilitas usus obat dan suplemen herbal
(4,5,6,7). Garis sel Caco-2 yang berasal dari adenokarsinoma usus besar manusia dianggap sebagai
model in vitro paling umum digunakan untuk investigasi dan prediksi obat usus
penyerapan (8). Ini mengalami diferensiasi enterositik spontan dalam kultur yang sesuai
menjadi sel terpolarisasi mengekspresikan permukaan apikal dan basolateral dengan mapan ketat
persimpangan. Sel-sel terpolarisasi menggambarkan beberapa fungsi dari enterosit normal termasuk
ekspresi enzim border brush, beberapa isoenzim sitokrom (CYP) dan fase II
enzim (9). Model ini juga digunakan dalam identifikasi substrat dan / atau inhibitor
pengangkut narkoba (10). Garis sel Caco-2 digunakan untuk skrining obat konvensional dan baru
entitas kimia untuk interaksi obat-obat potensial. Namun, penerapannya di sebagian besar
laboratorium khusus dan lembaga penelitian untuk menyaring obat herbal untuk kemungkinan
interaksi ramuan obat semakin populer.
Dalam beberapa tahun terakhir, konsumsi obat herbal baik dalam kombinasi dengan konvensional
obat-obatan atau sendiri telah menjadi praktik umum pada pasien yang menderita penyakit kronis
seperti HIV / AIDS dan kanker (11,12). Sayangnya, sebagian besar dokter tidak menyadari hal ini
kebiasaan yang mungkin dapat menyebabkan kegagalan terapi dan / atau toksisitas karena kecenderungan tinggi
individu-individu tersebut mengalami interaksi obat-herbal (13).
Saat ini, penelitian tentang interaksi ramuan obat telah meningkat karena kesadaran akan obat tersebut
kemungkinan ancaman yang mungkin timbul pada pasien dan penyedia layanan kesehatan dalam upaya untuk
mencapai tujuan terapi yang optimal. Interaksi obat-obat farmakokinetik adalah
sebagian besar disebabkan oleh penghambatan atau induksi enzim metabolisme dan pengangkut atau
pembersihan obat ginjal. Penggunaan garis sel Caco-2 untuk menyaring obat herbal untuk kemungkinan herba
interaksi obat dapat mengurangi kemungkinan kegagalan terapeutik yang terkait, merugikan
efek, dan biaya perawatan dan penarikan produk herbal dari pasar.
Meskipun sebagian besar peneliti dan industri farmasi lebih suka Caco-2 sebagai model in vitro
untuk investigasi penyerapan obat usus, berbagai laporan telah dipublikasikan
korelasinya secara in vivo dengan manusia (14). Kekurangan terkait dengan garis sel Caco-2 sebagai
model praklinis untuk prediksi permeabilitas usus dapat menghasilkan hasil yang tidak akurat
investigasi interaksi ramuan obat. Ulasan ini bertujuan untuk menilai pemanfaatan Caco-2
garis sel dalam studi praklinis, mengatasi beberapa keterbatasan terkait dan yang muncul
pendekatan untuk menyelesaikan masalah ini. Pendekatan yang muncul dibahas dalam ulasan ini
mungkin bermanfaat untuk meminimalkan tantangan saat ini dan masa depan yang mungkin merusak
penerapan garis sel Caco-2 untuk studi interaksi ramuan-obat.
Strategi pencarian dan kriteria pemilihan
Tinjauan dilakukan secara sistematis dengan mencari basis data EBSCOHOST,
Pustaka MEDLINE, PUBMED, EMBASE, GOOGLE SCHOLAR, dan COCHRAINE untuk
penelitian asli yang mencakup istilah pencarian kombinasi berikut: "baris sel Caco-2",
“Permeabilitas dan / atau penyerapan obat”, “interaksi ramuan obat”, “perangkap dan arus
pendekatan ”. Pencarian literatur terbatas pada publikasi yang tersedia online di
Bahasa Inggris. Namun tidak ada batasan untuk tanggal publikasi dalam kasus
pengulangan hasil pencarian, yang terbaru lebih disukai.
Awortwe et al.
Halaman 2
J Pharm Pharm Sci . Naskah penulis; tersedia di PMC 2015 11 Maret.
Naskah Penulis
Naskah Penulis
Naskah Penulis
Naskah Penulis

Halaman 3
Mekanisme penyerapan obat usus
Penyerapan suplemen herbal dan obat-obatan terutama terjadi di duodenum dan jejunum
segmen usus kecil karena konsentrasi tinggi vili dan mikrovili yang menyediakan
area permukaan yang besar (15, 16, 17, 18). Sel-sel epitel di daerah ini heterogen
dengan enterosit bertanggung jawab untuk penyerapan sebagian besar agen farmakologis. Itu
enterosit dipolarisasi dengan membran apikal dan basolateral yang dipisahkan oleh kencang
persimpangan. Komposisi arsitektur dari enterosit yang terpolarisasi ini membatasi perjalanan dari
obat-obatan dan xenobiotik baik melalui difusi pasif atau proses yang dimediasi oleh pembawa (19).
Area permukaan yang besar berfungsi sebagai saluran untuk permeasi obat yang efisien melalui berbagai
mekanisme termasuk jalur pasif dan aktif. Difusi pasif meliputi dua
rute: jalur paraseluler yang memfasilitasi permeasi obat hidrofilik rendah
berat molekul dan peptida melalui aquaporin pada persimpangan ketat antara enterosit;
dan jalur transelular yang bertanggung jawab untuk pergerakan obat lipofilik melintasi sel lipid
membran enterosit. Kehadiran persimpangan ketat di ruang antar sel membatasi
aliran bebas senyawa yang melintasi epitel usus melalui proses paraseluler (20).
Proses transportasi yang dimediasi oleh carrier melibatkan mekanisme yang difasilitasi dan aktif
direkayasa dengan mengangkut protein yang bertanggung jawab untuk penyerapan atau penghabisan obat dalam
usus
ditunjukkan pada Gambar 1 (21,22, 23).
Penyerapan dan pengangkut efluks dilokalisasi di kedua sisi apikal dan basolateral
selaput enterosit usus. Pengangkut efluks umumnya dinyatakan dalam
membran usus termasuk P-glikoprotein (P-gp), protein resistensi multi-obat (MRP 1–
6), dan protein resistensi kanker payudara (BCRP). Ini adalah anggota yang mengikat ATP
kaset (ABC) mengangkut protein yang memanfaatkan ATP sebagai sumber energi untuk mengangkut substrat
terhadap gradien konsentrasi (24,25,26) dari sitoplasma sel usus kembali ke
lumen usus atau ke darah.
Transporter eflux aktif primer terutama P-gp, MRP2, dan BCRP diekspresikan dengan baik
selaput apikal batas sikat enterosit dan dilaporkan membentuk penghalang utama
penyerapan obat usus (27,28). (29,30).
Ini memiliki kecenderungan untuk mengurangi ketersediaan hayati oral dari obat-obatan tertentu dengan cara
dikeluarkan
enterosit menjadi lumen usus . P-gp adalah transporter eflux yang dikenal baik
mempengaruhi penyerapan dan ekskresi beberapa obat karena jangkauan substratnya yang lebih luas
spesifisitas (31). BCRP mampu mengekstrusi glukuronida dan konjugat sulfat yang terbentuk di
enterosit ke dalam lumen, meskipun fungsi utamanya berkaitan dengan ekskresi obat dan
xenobiotik ke dalam ASI dan peran defensif pada penghalang plasenta (32). Drama MRP2
peran penting dalam detoksifikasi obat dan xenobiotik yang telah mengalami fase II
metabolisme untuk memfasilitasi ekskresi (33,34). Tidak seperti transporter eflux, membran apikal
serapan transporter meningkatkan penyerapan obat-obatan dari lumen ke dalam enterosit (35,36).
Akhirnya, endositosis yang dimediasi reseptor juga dapat berperan dalam penyerapan obat.
Pengangkut serapan misalnya, pengangkut peptida (PEPT), pengangkut anion organik (OAT),
anion transporting polypeptide (OATP) organik, transporter kation organik (OCT) adalah
anggota superfamilies pembawa zat terlarut (SLC dan SLCO) dan berfungsi independen dari ATP
melainkan mengangkut obat sesuai dengan gradien konsentrasi mereka (Gambar 2).
Awortwe et al.
Halaman 3
J Pharm Pharm Sci . Naskah penulis; tersedia di PMC 2015 11 Maret.
Naskah Penulis
Naskah Penulis
Naskah Penulis
Naskah Penulis

Halaman 4
Dalam penilaian permeabilitas sel Caco-2 obat dan suplemen herbal, memadai
ekspresi protein transpor dapat digunakan untuk memprediksi tingkat kemungkinan
bioavailabilitas pada saat pemberian bersama (37). Sebagian besar pengangkut tersebut dapat
diekspresikan dalam sel Caco-2 di bawah media kultur yang sesuai. Tabel 1 di bawah ini menggambarkan
serapan dan pengangkut eflux yang mungkin diekspresikan dalam garis sel Caco-2. Meskipun
kemungkinan ekspresi sebagian besar transporter di sel Caco-2, beberapa transporter suka
hPEPT1 kurang berkembang kecuali dalam kondisi yang dimodifikasi seperti menggoda atau
manipulasi rekayasa molekuler. Beberapa batasan ini akan terjadi kemudian
dibahas secara rinci.
Garis sel Caco-2
Garis sel Caco-2 adalah model berbasis sel yang paling umum dan berkarakter luas untuk
penilaian penyerapan obat melalui enterosit membran usus (38, 39, 40).
Ini berasal dari sel-sel adenokarsinoma kolorektal epitel manusia heterogen yang dikembangkan
melalui penelitian oleh Jorgen Fogh (1975) di Sloan-Kettering Institute for Cancer Research
(41) Sel-sel Caco-2 memiliki kemampuan intrinsik untuk memulai diferensiasi spontan
mencapai pertemuan di hadapan kondisi budaya normal. Di pertemuan, ada
pengembangan progresif batas sikat. Permukaan ditempati oleh setiap sel secara bertahap
berkurang dari 5 hingga 20 hari setelah pertemuan dan persimpangan interseluler yang intim
dikembangkan. Selama periode yang sama, panjang dan kepadatan mikrovili meningkat. Itu
Sel-sel Caco-2 membentuk persimpangan ketat yang berkembang baik setelah 21 hari dikultur. Pada hari ke - 30
pasca konfluensi, permukaan sel mencapai minimum dengan enterosit khas
morfologi. Sebagian besar sel mengembangkan batas sikat lengkap dengan mikrovili tinggi dan teratur
ketika polarisasi struktural penuh dicapai setelah 30 hari (42). Lengkap terpolarisasi
Sel-sel Caco-2 menyerupai sel mukosa usus kecil manusia yang mengekspresikan batas sikat, kencang
persimpangan dan, pengangkut eflux dan pengambilan di kedua kompartemen apikal dan basolateral.
Garis sel Caco-2 cukup mewakili penghalang biokimia usus karena ekspresi
protein efflux membran (P-gp, MRP 1-3), isoenzim CYP450 dan konjugasi fase II
enzim seperti sulfotransferase, UDP-glucuronyltransferase, glutathione S-transferase
(43,44). Tabel 2 merangkum karakteristik garis sel Caco-2 orangtua. Permeabilitas
substrat melalui monolayer sel Caco-2 telah terbukti berkorelasi erat dengan oral
penyerapan pada manusia dibandingkan dengan model berbasis sel orangtua lainnya. Saat ini, Caco-2
lapisan tunggal diterapkan untuk menyaring efek potensial dari tumbuh-tumbuhan dan entitas kimia baru
(NCE) tentang penyerapan obat-obatan.
Perbandingan Caco-2 dengan model berbasis sel lainnya untuk permeabilitas usus
penelitian— Ginjal anjing Madin-Darby (MDCK) dianggap sebagai alternatif
Sel Caco2 untuk studi permeabilitas. Garis sel MDCK berasal dari anjing normal
ginjal. Ketika dikultur dalam media yang sesuai, MDCK berdiferensiasi menjadi kolom
sel epitel dengan persimpangan ketat jelas mirip dengan Caco-2 terbentuk di dalam a
membran semipermeabel. Sel MDCK yang dibedakan mempertahankan karakteristik
sel epitel ginjal seperti distribusi enzim asimetris dan transportasi vektorial
natrium dan air dari apikal ke membran basolateral (45). MDCK memiliki a
Awortwe et al.
Halaman 4
J Pharm Pharm Sci . Naskah penulis; tersedia di PMC 2015 11 Maret.
Naskah Penulis
Naskah Penulis
Naskah Penulis
Naskah Penulis

Halaman 5
periode budidaya yang lebih pendek (3 - 5 hari) dibandingkan dengan 21 hari garis sel Caco −2.
Lebih lanjut, resistansi listrik transepitelial (TEER) sel MDCK lebih rendah dan
lebih dekat dengan usus kecil dibandingkan dengan sel Caco-2. Ini sering menghasilkan yang lebih tinggi
koefisien permeabilitas senyawa hidrofilik dalam sel MDCK dibandingkan sel Caco-2. Itu
durasi kultur yang lebih pendek menguntungkan karena mengurangi biaya, waktu, dan meningkatkan tinggi
hasil. Garis sel MDCK tampaknya lebih kuat dan perlu kurang keras
jadwal nutrisi selama periode inkubasi singkat relatif terhadap sel Caco-2. Namun ini
sel berasal dari ginjal anjing dan oleh karena itu ada kecenderungan perbedaan yang tinggi dalam
tingkat ekspresi beberapa transporter dan aktivitas metabolisme dibandingkan dengan sel Caco-2
(46)
Sel LLC-PK1 yang berasal dari epitel ginjal babi juga telah digunakan sebagai alternatif
model untuk sel Caco-2 untuk menilai permeabilitas senyawa uji. Penelitian telah dilaporkan
penggunaan LLC-PK1 untuk karakterisasi penyerapan senyawa uji pasif (47,48,49).
Model adenokarsinoma manusia HT29-MTX digunakan untuk menyelidiki peran usus
lendir pada penyerapan obat melintasi penghalang usus. HT29-MTX dikondisikan untuk
memperoleh fitur morfologis dan musin memproduksi sel piala dengan membudidayakan orangtua
HT29 dalam media yang mengandung 10 −6 M metotreksat selama enam bulan (50,51). Tidak seperti Caco-2,
HT29-MTX mengembangkan mikrovili yang jarang pada sisi apikal dan mencapai pertemuan 3 hari
lebih lambat dari yang pertama. Namun, ekspresi sel piala di HT29-MTX meningkat
penyerapan senyawa lipofilik dibandingkan dengan Caco-2 monolayer.
TC-7, subclone sel Caco-2, juga digunakan untuk skrining permeabilitas tes
senyawa. Klon TC-7 menampilkan fitur morfologis membran brush-border,
microvilli dan persimpangan ketat mirip dengan Caco-2 monolayer (19). Ada korelasi yang baik
penyerapan transseluler pasif senyawa melalui TC7 dan sel Caco-2 orangtua
monolayer sebanding dengan tingkat permeabilitas pada manusia. Model TC-7 karenanya
menawarkan alternatif untuk Caco-2 untuk penilaian permeabilitas usus dari senyawa uji. Di
Selain itu, TC-7 memiliki keunggulan dibandingkan Caco-2 dengan mengekspresikan tingkat CYP3A4 yang
tinggi
Enzim terwakili dengan baik di usus. Namun, TC-7 tidak seperti sel Caco-2 tidak memiliki transportasi
protein dan karena itu penerapannya cenderung terhadap metabolisme penggunaan obat
CYP3A4.
2/4 / A1 berasal dari usus tikus janin dan dianggap meniru usus pasif
permeabilitas paracellular pada manusia lebih baik daripada Caco-2 monolayer (52,53). Ini
sel yang diabadikan dilaporkan untuk membedakan lapisan tunggal dengan persimpangan yang rapat, batas sikat
enzim membran dan protein transporter. Tidak seperti, Caco-2, persimpangan ketat dinyatakan dalam
2/4 / A1 longgar dan lebih baik untuk studi senyawa yang diserap di usus manusia melalui
rute paracellular. Model ini telah terbukti sangat baik untuk prediksi yang buruk
senyawa yang diserap seperti manitol dan kreatinin lebih baik daripada Caco-2 tetapi sebanding dengan
bahwa jejunum manusia (52,53). Tabel 3 merangkum perbandingan Caco-2 dengan lainnya
model berbasis sel untuk analisis permeabilitas usus.
Awortwe et al.
Halaman 5
J Pharm Pharm Sci . Naskah penulis; tersedia di PMC 2015 11 Maret.
Naskah Penulis
Naskah Penulis
Naskah Penulis
Naskah Penulis

Halaman 6
Protokol studi sel Caco-2 umum
Kultur Sel Caco-2— Sel-sel Caco-2 diunggulkan dalam media kultur sel standar (terdiri
media Dulbecco dimodifikasi Eagle dilengkapi dengan serum sapi janin,
asam amino yang tidak penting, penisilin, dan streptomisin) pada 24 sisipan membran transwell
pada konsentrasi sel tertentu di bawah suhu 37 ° C dalam atmosfer 5% CO 2
dan kelembaban relatif 90%. Lapisan sel sel digunakan untuk studi transportasi 15 - 21
hari setelah penyemaian di antara bagian-bagian yang berbeda (54).
Viabilitas sel— Sel-sel Caco-2 diunggulkan ke cawan Petri (area 9,2 cm 2 ) dengan kepadatan 2 ×
10 5 sel / cm 2 dan dikultur selama 24 jam. Senyawa yang diteliti atau media transportasi (kontrol) adalah
ditambahkan dan diinkubasi selama 2 jam. Sel-sel kemudian dilepaskan dari piring dan diinkubasi dengan
0,4% Trypan blue selama 5 menit dan dihitung di bawah mikroskop (55).
Penilaian integritas monolayer— Integritas monolayer sel Caco-2 dapat dilakukan
ditentukan dengan memonitor permeabilitas paracellular dari ion dan senyawa hidrofilik
menggunakan TransEpithelial Electrical Resistance (TEER) dan 14 C-mannitol masing-masing setelah
percobaan. Mannitol larut dalam air, membran sel kedap air dan non-ionisable kecil
molekul dengan berat molekul 182 g / mol dan jari-jari 4,1 nm. Permeabilitas rendah
mannitol (<0,5% per jam) digunakan sebagai kriteria untuk menentukan integritas Caco-2
satu warna. Sangat penting untuk menilai integritas monolayer dengan 14 C-mannitol setelahnya
percobaan permeabilitas aktual atau selama percobaan permeabilitas tanpa kehadiran dan
adanya senyawa uji dan kontrol. TEER memberikan alternatif yang lebih cepat dan andal
metode menilai intensitas monolayer sel Caco-2. TEER of monolayer diukur
posting menyeimbangkan monolayer dalam buffer transportasi dengan ERS Voltmeter. Integritas
monolayer dikonfirmasi dengan mengukur TEER setelah setiap percobaan permeabilitas
(56)
Uji transport dua arah— Sebelum semua percobaan, sisipan (gambar 3) adalah
dicuci dua kali dan diseimbangkan dengan media transportasi yang dipanaskan sebelumnya pada suhu 37 ° C
selama 30 menit. Itu
percobaan transportasi dimulai dengan penambahan substrat probe encer (kontrol positif) di
ada atau tidaknya substrat uji ke apikal (untuk apikal hingga basolateral)
mengangkut; AP - BL) atau basolateral (untuk sisi basolateral ke transportasi apikal; BL -AP) dari
satu warna. Lapisan warna kemudian ditempatkan dalam inkubator pada suhu 37 ° C. Sampelnya adalah
ditarik dari salah satu kompartemen pada interval waktu yang berbeda (mis. 30, 60, 90 dan 120 menit)
untuk analisis H PLC atau spektrometri kilau cair (58,59,60).
Analisis data transportasi— Koefisien permeabilitas yang nyata, Papp (cm / s) adalah
ditentukan sebagai:
Dimana
s tingkat permeabilitas, jumlah obat yang muncul dalam penerima sebagai a
fungsi waktu (nmol / s), C 0 adalah konsentrasi awal dalam ruang donor (nmol / ml),
dan A adalah luas permukaan monolayer (cm 2 ) seperti yang diterbitkan oleh Engdal dan Nilsen (37).
Awortwe et al.
Halaman 6
J Pharm Pharm Sci . Naskah penulis; tersedia di PMC 2015 11 Maret.
Naskah Penulis
Naskah Penulis
Naskah Penulis
Naskah Penulis

Halaman 7
Arah pengangkutan substrat probe dalam monolayer dapat ditentukan sebagai pasif atau
aktif menggunakan rasio penyerapan aplikasi P :
Fluks substrat bersih dapat dihitung sebagai perbedaan antara B – A dan A – B
fluks, J:
Di mana: J = P aplikasi * C o (nmol cm −2 h −1 )
Penghambatan persentase dihitung sesuai dengan:
Bukti interaksi ramuan obat dalam model sel Caco-2 pada tingkat transporter
Model sel Caco-2 mampu mengekspresikan eflux usus dan mengangkut transporter
yang mengatur permeasi obat-obatan, dan herbal dari lumen usus ke sirkulasi sistemik.
Obat herbal mengandung banyak senyawa phytochemical dengan kelompok fungsional
identik dengan yang ditemukan dalam obat konvensional. Ketersediaan senyawa dengan sejenis
kelompok fungsional baik dalam obat-obatan herbal maupun obat-obatan menyebabkan substrat tumpang tindih
pada reseptor
situs untuk menghasilkan interaksi ramuan obat ketika diberikan bersama (61,62). Studi klinis miliki
melaporkan dampak interaksi ramuan obat pada disposisi terapi pada pasien dan
individu yang sehat. Misalnya, obat herbal yang paling sering terlibat, St. John's
wort (SJW) dilaporkan mengurangi bioavailablity dari berbagai obat termasuk digoxin (63,
64,65), amitriptyline (66), kontrasepsi oral (etinil estradiol dan norethindrone) (67), atau
cyclosporine (68,69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76). Efek luas dari SJW pada obat untuk
pengelolaan kondisi patologis yang beragam telah dikaitkan dengan induksi P-gp
oleh senyawa bioaktif hiperforin, memodulasi pengusiran obat-obatan ini dari
enterosit ke dalam lumen usus. Garis sel Caco-2 digunakan sebagai model pra-klinis
memprediksi kemungkinan interaksi ramuan-obat ex vivo setelah uji klinis.
Prediksi interaksi obat-obat dan ramuan-obat yang melibatkan pengangkut obat adalah
disimpulkan dari bukti pra-klinis dari garis sel dan model hewan. Studi in vitro miliki
menunjukkan bahwa, ekstrak teh hijau, bawang putih dan milk thistle menghambat aktivitas Pgp (77,78,79)
sementara genisten, senyawa bioaktif dalam kedelai, menghambat aktivitas P-gp dan MRP2
(80, 81). Studi in vitro dilakukan secara stabil pada sel embrionik ginjal manusia (HEK) 293
mengekspresikan OATP-B (sel HEK / OATP-B) menggunakan ekstrak bilberry, enchinacea, hijau
teh, pisang, biji anggur, gingkgo dan kedelai menghasilkan penghambatan OATP-B yang signifikan
penggunaan estrone-3-sulfate yang dimediasi (82).
Awortwe et al.
Halaman 7
J Pharm Pharm Sci . Naskah penulis; tersedia di PMC 2015 11 Maret.
Naskah Penulis
Naskah Penulis
Naskah Penulis
Naskah Penulis

Halaman 8
Dalam sebuah studi baru-baru ini, 50 ml ekstrak air Ragi Merah (RYR) "tidak diobati" dari a
konsentrasi 0,5 mg / ml ditambahkan ke kompartemen apikal kultur jaringan Caco-2
piring di hadapan verapamil sebagai substrat probe P-gp. Penelitian menunjukkan 2 kali lipat
peningkatan penyerapan bersih verapamil dari membran apikal ke basolateral
kompartemen, indikasi efek penghambatan potensial RYR pada P-gp usus. SEBUAH
studi lebih lanjut dilakukan pada hewan utuh untuk mengkonfirmasi hasil dari garis sel caco-2. Itu
Hasilnya menunjukkan 30 menit pasca administrasi verapamil di RYR “yang tidak diobati” yang telah diobati
sebelumnya
model tikus menghasilkan konsentrasi plasma 2 kali lipat dari substrat probe P-gp dibandingkan dengan
kontrol yang setuju dengan hasil penelitian in vitro (83).
Ginseng adalah salah satu obat tradisional Tiongkok paling dikenal yang dilaporkan dipamerkan
efek antikanker karena adanya 20 ( S ) -Ginsenoside Rh2 [20 ( S ) -Rh2], elemen jejak dalam
gingseng (84,85). Pada tahun 2010, sebuah penelitian yang dilakukan oleh Zhang dan lainnya mengungkapkan
bahwa kehadiran
20 ( S ) -Rh2 secara signifikan mengurangi transportasi dari tiga substrat probe P-gp klasik; digoxin,
fexofenadine, atau etoposide melintasi Caco-2 monolayers di basolateral ke arah apikal tetapi
peningkatan transport digoxin atau etoposide di apikal ke arah basolateral. Hasil
mengungkapkan bahwa 20 ( S ) -Rh2 menghambat aktivitas penghabisan P-gp sementara mengambil transporter
di apikal
membran diinduksi yang dapat mengakibatkan toksisitas sistemik potensial dari substrat.
Penelitian lebih lanjut dilakukan pada tikus Sprague-Dawley yang diobati secara intragastrik dengan 20 ( S ) -
Rh2
di hadapan tiga probe P-gp substrat sebagai penyelidikan tindak lanjut dari in vitro
hasil. Hasil studi in vivo ini mengungkapkan peningkatan AUC dan Cmax untuk semua
substrat tanpa dampak pada paruh eliminasi terminal mereka. Ini menunjukkan bahwa
Senyawa bioaktif meningkatkan penyerapan substrat dengan menghambat P-gp mirip dengan itu
diamati dalam studi in vitro (86).
Oga dan rekan kerja (2012) menyelidiki dampak obat-obatan herbal yang digunakan untuk perawatan
malaria pada eflux yang dimediasi P-glikoprotein pada sel Caco-2 di hadapan dan
tidak adanya digoxin (87). Investigasi mereka menunjukkan penghambatan signifikan digoxin dari
basolateral ke membran apikal sel Caco-2 monolayer saat diekstrak dari Vernonia
amydalina , Carica papaya dan Tapinanthus sessilifolius diterapkan secara independen. Demikian,
obat-obatan herbal ini dapat meningkatkan ketersediaan hayati obat antimalaria sekaligus
dikelola. Peningkatan sirkulasi sistemik obat antimalaria bisa menjadi racun bagi
hati (88).
Demikian pula pemberian ramuan dan obat yang merupakan substrat untuk P-gp may
baik menyebabkan kegagalan terapi dan toksisitas pra-sistemik karena induksi transporter
atau toksisitas sistemik sebagai akibat dari penghambat transporter eflux. Peran sel in vitro
sistem kultur dalam studi praklinis yang melibatkan IPM karena itu tidak dapat terlalu ditekankan.
Oleh karena itu sel Caco-2 sering digunakan untuk menilai fungsi membran usus
transporter terutama P-gp selama studi HDI karena sebagian besar ramuan dikonsumsi secara oral.
Perangkap Umum dalam Tes Caco-2
Variasi dalam transportasi pasif dan yang dimediasi oleh operator— Relevan secara farmasi
serapan protein transpor (misal transporter peptida, transporter kation organik dan OAT) adalah
kurang diekspresikan dalam Caco-2 monolayer dibandingkan dengan tingkat ekspresi in vivo
(89,90,91). Penelitian menunjukkan permeabilitas antibiotik β-laktam yang buruk (mis
Awortwe et al.
Halaman 8
J Pharm Pharm Sci . Naskah penulis; tersedia di PMC 2015 11 Maret.
Naskah Penulis
Naskah Penulis
Naskah Penulis
Naskah Penulis

Halaman 9
cephalexin dan amoxicillin) dan inhibitor ACE di seluruh sel Caco-2
substrat transporter dipeptida ini sepenuhnya diserap in vivo (92). Juga, sudah
telah menunjukkan bahwa ada variasi yang signifikan dari tingkat ekspresi mRNA efluks
transporter di monolayer sel Caco-2 dibandingkan dengan usus kecil dan besar pada manusia. Untuk
Sebagai contoh, transkripsi BCRP (ABCG2) sekitar 100 kali lipat lebih rendah pada sel Caco-2
dibandingkan dengan jejunum (99,93,94). Perbedaan ekspresi protein transporter di
Monolayer sel Caco-2 menghasilkan temuan negatif palsu yang mungkin tidak berkorelasi dengan in vivo
studi.
Sumber sel Caco-2 dan variasi antar-laboratorium dalam desain protokol berkontribusi
perbedaan dalam permeabilitas paracellular dari senyawa dalam monolayer. Studi telah
menunjukkan bahwa, sumber sel Caco-2 dapat memberikan variasi 100 kali lipat dalam permeabilitas
mannitol (95) dan perbedaan 20 kali lipat dalam TEER karena kondisi budaya yang berbeda dan
komposisi subpopulasi sel (30). Perbedaan antar laboratorium dalam nilai TEER
mempengaruhi estimasi pengangkutan senyawa pasif karena nilai TEER digunakan untuk
tentukan ekspresi persimpangan yang rapat. Misalnya, berat molekul rendah
senyawa hidrofilik (misalnya metformin, ranitidin, atenolol, furosemide atau
hydrochlorothiazide) diserap dengan baik pada manusia. Namun, permeabilitas yang buruk ini
Senyawa telah diamati dalam sel Caco-2 monolayer yang serupa atau bahkan kurang dari itu
manitol. Abnormalitas transportasi obat ini menimbulkan masalah dalam memprediksi dengan tepat
vivo-in vitro korelasi data dari berbagai laboratorium karena hasil variabel.
Ekspresi CYP3A4 yang rendah— CYP3A4 usus memainkan peran vital pada operan pertama
metabolisme obat-obatan dan herbal. Model berbasis sel yang ideal untuk studi permeabilitas usus
harus meniru enterosit gastrointestinal manusia dengan mengekspresikan enzim metabolik
bersama dengan lipid bilayer diselingi dengan transporter dan persimpangan ketat untuk memberikan adil
representasi interaksi antara CYP3A4 dan P-gp. Monolayer sel Caco-2 gagal
untuk mensimulasikan lingkungan usus in vivo karena rendahnya ekspresi CYP3A4 yang
dianggap sebagai enzim metabolisme obat utama dalam sel epitel manusia.
Hilangnya senyawa - Retensi membran dan ikatan tidak spesifik— Membran
retensi juga disebut cacophilicity mengacu pada kecenderungan obat untuk mengikat secara reversibel
Sel Caco-2 menyebabkan pemulihan tidak lengkap dan interpretasi data tidak akurat. Tidak lengkap
pemulihan sangat umum terjadi pada kandidat obat lipofilik. Beberapa faktor termasuk:
jumlah obat yang muncul di kompartemen penerima, konsentrasi awal di
kompartemen donor, dan luas permukaan penghalang fisik (misalnya, lapisan ganda lipid dan
sel monolayer) mempengaruhi permeabilitas obat. Obat ini juga dapat mengikat secara tidak spesifik
perangkat plastik (pelat transwell), mengurangi konsentrasi obat dalam donor dan
kompartemen penerima selama masa inkubasi dan karena itu mengarah pada terlalu rendahnya
perkiraan permeabilitas, dan negatif palsu. Ikatan non-spesifik juga dapat terjadi selama
transfer sampel hasil kultur bersama dengan obat ke dalam wadah lain. Beberapa pendekatan
Semoga bermanfaat untuk mengurangi masalah ini. Konsentrasi donor akhir mungkin lebih disukai
konsentrasi donor awal pada penghentian inkubasi sejak pengikatan non-spesifik
terjadi relatif lebih cepat. Pendekatan kedua melibatkan penambahan serum albumin sapi
kompartemen penerima untuk meminimalkan pengikatan obat lipofilik yang tidak spesifik, dengan demikian,
Awortwe et al.
Halaman 9
J Pharm Pharm Sci . Naskah penulis; tersedia di PMC 2015 11 Maret.
Naskah Penulis
Naskah Penulis
Naskah Penulis
Naskah Penulis

Halaman 10
meningkatkan pemulihan pengujian dan prediksi keseluruhan (96,97,98). Aplikasi organik
pelarut seperti asetonitril ke dalam wadah yang siap menerima kultur yang ditransfer juga telah
membantu mengurangi kehilangan senyawa karena pengikatan non-spesifik ke perangkat plastik.
Kurangnya kelarutan yang memadai— Penilaian permeabilitas senyawa uji dalam Caco-2
diremehkan karena kelarutan dalam air yang buruk. Cosolvent organik seperti DMSO dan
propilen glikol ditambahkan ke kompartemen donor untuk mencegah masalah ini. Namun demikian
Monolayer sel Caco-2 dapat mentolerir pelarut organik ini pada konsentrasi ∼1 - 2% v / v.
Di luar konsentrasi ini, persimpangan sel ketat terganggu dan menjadikan monolayer
tidak praktis. Namun, beberapa pelarut seperti Tween 80, cremophor dan pluronic yang mana
diketahui penghambat pengangkut eflux harus dihindari (99.100.101). PH usus
variasi dari usus kecil atas ke usus besar distal menentukan sifat
senyawa yang diserap pada wilayah tertentu. Misalnya, obat asam lemah tetap tidak berubah
di usus kecil bagian atas karena pH tinggi, oleh karena itu transporular pasif muncul
sebagai jalur penyerapan yang dominan ke dalam sirkulasi. Studi Caco-2 tidak mampu
mensimulasikan perubahan sistem pH usus karena dilakukan pada pH konstan
kondisi (pH apikal 6,5 dan pH basolateral 7,4). Setiap modifikasi pH dalam desain
Protokol sel Caco-2 dapat memengaruhi cytoarchitecture dan meremehkan permeabilitas
karakteristik.
Variabilitas eksperimental lainnya— Laboratorium yang berbeda beroperasi di bawah beragam
kondisi eksperimental seperti pembiakan, nomor bagian dan durasi budaya yang
akun untuk variasi dalam nilai permeabilitas. Variasi antar laboratorium mempengaruhi
tingkat ekspresi transporter eflux yang tergantung pada usia kultur sel (19).
Sub-klon Caco-2 yang mengekspresikan pengangkut eflux tingkat tinggi saat ini lebih disukai
membangun hubungan struktur-transportasi untuk pengangkut eflux. Beberapa tantangan telah terjadi
ditemui selama analisis sampel menggunakan berbagai instrumen seperti HPLC atau LC-MS.
Instrumen ini diharapkan menghasilkan hasil yang akurat karena sensitivitasnya. Namun,
Kehadiran komponen garam yang tinggi dalam buffer transportasi (misalnya HBSS) mengganggu ionisasi
dan karenanya mempersulit pengembangan metode LC-MS yang stabil.
Pendekatan saat ini dan masa depan
Perangkat throughput tinggi berkualitas digunakan oleh laboratorium khusus untuk penyaringan besar
jumlah obat baru. Sebagian besar perangkat baru ini dikembangkan melalui integrasi
memajukan pengetahuan dalam biologi molekuler dan komputer kombinatorial menjadi konvensional di
Indonesia
model vitro. Beberapa perkembangan terbaru dalam uji permeabilitas sel Caco-2 yang
akhirnya dapat menggantikan teknik konvensional di tahun-tahun mendatang yang dibahas
di bawah.
Otomasi dan sistem Robotic— Kultur sel membutuhkan beberapa jam pengulangan,
prosedur manual yang melelahkan untuk menjaga sterilitas absolut. Selain itu,
pemeliharaan kondisi lingkungan yang menguntungkan melalui siklus kultur sel; pertumbuhan,
panen, penyemaian ulang dan analisis penting. Karenanya pertumbuhan sel menuntut kehati-hatian
regulasi beberapa faktor dalam upaya untuk mencapai garis sel Caco-2 yang layak dan konsisten.
Dalam kondisi di mana sejumlah besar uji permeabilitas senyawa dianalisis, ada
Awortwe et al.
Halaman 10
J Pharm Pharm Sci . Naskah penulis; tersedia di PMC 2015 11 Maret.
Naskah Penulis
Naskah Penulis
Naskah Penulis
Naskah Penulis

Halaman 11
adalah kecenderungan kontaminasi sel yang tinggi. Kesulitan ini telah mendorong farmasi
perusahaan untuk merangkul penggunaan sistem kultur sel Caco-2 otomatis. Otomatis
Sistem Caco-2 dapat digunakan untuk mempelajari 200-500 senyawa dalam satu bulan tanpa ada
peningkatan biaya operasi.
Sistem robot mampu melakukan kultur sel dan throughput yang tinggi
tes skrining kandidat obat. Sebagian besar sistem robot melakukan tugas multiguna seperti itu
sebagai pelapis piring, pembibitan dan pemberian makan sel. Sistem robot menggunakan komponen kunci
(Mengartikulasikan lengan dan korsel piring) untuk mengotomatisasi prosedur kultur sel. Mengartikulasikan
lengan memegang piring pada sudut yang berbeda memungkinkan pengguna untuk mengeluarkan media di
dinding
piring, mengurangi kemungkinan kerusakan sel atau membran (19).
Model Caco-2 yang siap digunakan— Model sel Caco-2 yang dimodifikasi yang siap digunakan
analisis permeabilitas dalam waktu kultur 3 - 7 hari telah diproduksi oleh dedicated
laboratorium untuk membatasi periode panjang yang terkait dengan prosedur kultur orang tua. Beberapa
model yang dimodifikasi ini saat ini digunakan untuk analisis permeabilitas obat baru. Khas
contoh model yang dimodifikasi, Biocoat ™ HTS Caco-2 Assay System mempromosikan dengan cepat
diferensiasi sel Caco-2. Sistem ini disertai oleh media khusus
formulasi yang memfasilitasi diferensiasi sel monolayer dalam waktu tiga hari. Utama
industri farmasi secara global sekarang bergantung pada Biocoat ™ HTS Caco-2 Assay System untuk
evaluasi permeabilitas oral obat baru. CacoReady ™ adalah sel berbasis inovatif lainnya
dan kit siap pakai untuk analisis permeabilitas usus. Kit terdiri dari 24 dan 96
insert-terintegrasi mendukung permeabel diunggulkan dengan Caco-2 terdiferensiasi dan terpolarisasi
hambatan pada filter mikroporous polycarbonated. Studi banding untuk menilai permeabilitas
efisien sistem pengujian parental Caco-2 dan Biocoat ™ HTS Caco-2 menggunakan parabens; Sebuah
pengawet yang biasa digunakan dalam industri makanan, kosmetik dan farmasi menunjukkan lebih baik
penyerapan Caco-2 siap pakai seperti yang diilustrasikan oleh gambar 4 (102). Sel Caco-2 yang siap digunakan
memiliki beberapa keunggulan dibandingkan orangtua Caco-2: fleksibilitas tinggi, hemat waktu dan hemat
biaya,
mudah diatur, reproduktifitas tinggi dan mudah beradaptasi dengan prosedur otomatis dan tinggi
penyaringan throughput. Namun, ekspresi enzim dan transporter yang rendah telah terjadi
dilaporkan karena durasi yang tidak memadai untuk budidaya (103.104).
Garis sel Caco-2 yang ditransfusikan— Kemajuan yang dibuat dalam biologi molekuler modern dan
informasi genetik dieksploitasi sepenuhnya untuk meningkatkan ekspresi fungsional pengangkut dan
CYP menggunakan garis sel Caco-2. Tingkat ekspresi pengangkut spesifik di Caco-2 mungkin
dimanipulasi secara sementara atau stabil sesuai dengan preferensi peneliti (105).
Konstruksi jalur sel Caco-2 yang ditransfusikan relevan dengan transporter seperti PEPT1 itu
tidak dapat diekspresikan dalam kondisi budaya normal. Dalam sebuah penelitian dilakukan karakterisasi
mekanisme pengambilan seluler dari ester asam amino penghasil obat antivirus nukleosida di Indonesia
sel-sel Caco-2 yang ditransfusikan secara sementara yang mengekspres peptida usus manusia secara berlebihan
transporter, hPEPT1 (sel Caco-2 / hPEPT1), garis sel yang ditransfeksi diproduksi lima kali
serapan yang lebih tinggi daripada orangtua Caco-2 (106). Namun, induksi transporter eflux sering
lebih mudah dan diekspresikan dengan baik dalam orangtua Caco-2 dibandingkan dengan sel yang
ditransfusikan. Karenanya,
transfeksi transporter eflux dalam sel Caco-2 tidak dianjurkan.
Awortwe et al.
Halaman 11
J Pharm Pharm Sci . Naskah penulis; tersedia di PMC 2015 11 Maret.
Naskah Penulis
Naskah Penulis
Naskah Penulis
Naskah Penulis

Halaman 12
Garis sel Caco-2 juga dapat ditransfusikan dengan vektor CYP ekstra-kromosom. Caco-2
sel-sel yang ditransfeksi dengan CYP3A4 telah berhasil digunakan untuk menyelidiki interaksi tersebut
enzim CYP dan pompa penghabisan di epitel usus (107). Namun,
Caco-2 transfected yang menampung CYP ekstra-kromosom telah ditarik dari
pasar karena kurangnya stabilitas jangka panjang.
Teknologi biologi molekuler telah digunakan untuk memodulasi ekspresi reseptor nuklir
yang merupakan regulator utama ekspresi gen untuk enzim CYP. Sel Caco-2 ditransfusikan
dengan gen PXR dan HNF4 manusia menunjukkan ekspresi yang meningkat dari kedua reseptor nuklir
di bawah kontrol promotor CYP3A4 (108).
Ekspresi fungsional pengangkut eflux dan serapan di Caco-2 monolayer tergantung pada
nomor bagian dan kondisi antar-laboratorium lainnya. Variasi ini menghasilkan
ekspresi yang tidak konsisten dari pengangkut obat selama tes permeabilitas. Dalam beberapa tahun terakhir,
laboratorium berdedikasi telah memperkenalkan garis sel rekayasa yang secara eksplisit over-express a
eflux atau serapan transporter spesifik untuk pemeriksaan interaksi transporter obat yang lebih baik.
Garis sel yang baru dibangun secara selektif mengungkapkan pengangkut minat dan peningkatan
studi interaksi dengan transporter khusus dalam isolasi. Investigasi dua arah
dilakukan di jalur sel Caco-2 yang direkayasa tanpa gangguan dari transporter lain
karena hanya pengangkut tertentu yang diusir. Ekspresi fungsional transporter di
Garis sel yang ditransfusikan tampak lebih stabil daripada sel induk Caco-2.
Knockdown Caco-2 cell cell— Selektif merobohkan gen endogen spesifik
sebuah alternatif untuk membangun garis sel Caco-2 yang dimodifikasi dengan ekspresi transporter yang
berkurang.
Beberapa upaya telah dilakukan untuk menghasilkan garis sel Caco-2 yang kekurangan P-glikoprotein.
Hilgendorf dan rekan kerja pertama kali menggunakan teknik antisense untuk mengurangi transkripsi dan
aktivitas P-gp. Saat ini, teknologi siRNA modern digunakan untuk mengurangi aktivitas Pgp di Indonesia
Sel Caco-2. Meskipun teknologi siRNA secara drastis mengurangi ekspresi P-gp, bertentangan
hasilnya telah dilaporkan (109). Celius dkk. (110) melaporkan penghapusan total itu
P-gp tidak dapat diraih sementara Watanabe dan rekan kerja (111) melakukan percobaan
hilangnya baik ekspresi mRNA dan P-gp MDR1. Penerapan siRNA
teknologi dalam garis sel Caco-2 harus dilakukan dengan hati-hati untuk mencegah kesalahan representasi
data.
KESIMPULAN
Model Caco-2 banyak digunakan sebagai alat untuk permeabilitas dan / atau penyaringan penyerapan
senyawa uji selama proses pengambilan keputusan pada tahap awal penemuan obat. Itu
penggunaan garis sel Caco-2 untuk skrining interaksi ramuan-obat semakin mendapatkan alasan
di akademia dan laboratorium khusus karena popularitas dan penerimaannya. Itu
rekomendasi garis sel Caco-2 oleh FDA sebagai komponen integral dari
Biopharmaceutics Classification System (BCS) telah memberikan keunggulan pada model ini
model berbasis sel lainnya (112). Akibatnya, aplikasi rutin sel Caco-2 untuk
penapisan parameter biofarmasi senyawa uji seperti obat-obatan herbal di Indonesia
laboratorium khusus membutuhkan protokol yang andal untuk menghasilkan hasil yang dapat
direproduksi. Perangkap
disebutkan dalam ulasan ini dapat merusak kredibilitas hasil yang dihasilkan dari berbeda