LAPORAN PRAKTIKUM

PENGENALAN LABORATORIUM, STERILISASI DAN PEMBUATAN

PREPARASI MEDIA KULTUR JARINGAN TANAMAN

Ditulis untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah Praktikum Kultur Jaringan Tumbuhan
Dosen Pengampu Dr. Ixora Sartika Mercuriani, M. Si.

Disusun oleh :

Rismawarsi Astuti 16308141027

Hayyu Arumsari 16308141011

Annas Emma A N A 16308141021

Dina Puasari P 16308141015

JURUSAN PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI YOGYAKARTA

2019
 BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Kultur jaringan adalah salah satu metode yang digunakan dalam
pengembangan Bioteknologi Tumbuhan. Metode ini merupakan prosedur
pemeliharaan dan pertumbuhan jaringan tanaman (sel, kalus, protoplas) serta organ
(batang, akar, embrio) pada kultur aseptis (in vitro). Metode kultur jaringan
diantaranya digunakan untuk perbanyakan tanaman, modifikasi genotip (plant
breeding), produksi metabolit sekunder, pemeliharaan plasma nutfah, penyelamatan
embrio (embryo rescue) (Hartmann dkk., 1997).
Teknik kultur jaringan mensyaratkan kondisi steril baik ruang, peralatan,
bahan maupun seluruh rangkaian kerjanya. Hal ini disebabkan karena pertumbuhan
eksplan didalam kultur harus selalu dalam kondisi aseptis agar tidak terjadi
kontaminasi. Untuk itu semua tahapan pelaksanaan teknik kultur harus dilaksanakan
di dalam laboratorium yang ideal dan harus ditunjang oleh perlengkapan laboratorium
yang memadai serta tata cara kerja yang teliti. Laboratorium sebaiknya mempunyai
pembagian ruangan yang diatur sedemikian rupa sehingga tiap kegiatan terpisah satu
dengan yang lainnya, tetapi masih dapat saling berhubungan dan mudah dicapai.
Menurut Moeso Suryowinoto (2000) berhasil tidaknya kultur jaringan sangat
bergantung pada keadaan aseptik atau sterilnya komponen-komponen kultur jaringan
yang meliputi eksplan, peralatan yang digunakan maupun ruangan yang digunakan
untuk kultur jaringan. Sterilisasi alat harus dilakukan dalam percobaan kultur jaringan
untuk mencegah terjadinya kontaminasi yang dapat merusak kelangsungan percobaan
yang dilakukan di laboratorium. Sterilisasi dapat dilakukan dengan berbagai macam
cara, cara tersebut meliputi sterilisasi secara mekanik, kimia, maupun sterilisasi secara
fisik.
Pengenalan alat laboratorium merupakan langkah pertama sebelum melakukan
percobaan atau penelitian di laboratorium. Dengan mengenal alat, praktikan dapat
mengetahui fungsi masing-masing bagian dari alat tersebut serta cara pengoprasian
atau penggunaan alat-alat yang akan digunakan dalam percobaan atau penelitian yang
dilakukan. Selain itu, dengan mengetahui akan fungsi dan cara penggunaan alat-alat
yang akan digunakan dapat memperlancar jalannya suatu percobaan atau penelitian.
Sehingga dengan berbekal pengetahuan pemahaman akan fungsi dan cara kerja dari
alat yang digunakan kita dapat memperoleh hasil suatu percobaan atau penelitian
yang maksimal.
Selain pengetahuan dan pemahaman akan alat di laboratorium, praktikan juga
dituntut untuk terampil dalam penggunaannya. Hal tersebut harus dibarengi dengan
ketelitian dalam melakukan suatu percobaan ataupun penelitian sehingga didapatkan
hasil yang maksimal.
Dengan pengenalan alat-alat laboratorium. Kita dapat mengetahui berbagai
macam alat yang terdapat di Laboratorium. Selain itu kita juga dapat meminimalisir
resiko kesalahan kerja pada saat melakukan percobaan mikrobiologi. Alat-alat
laboratorium mempunyai cara dan prinsip kerja yang berbeda. Setiap pengguna harus
mengikuti hal-hal tersebut agar dalam menggunakan alat-alat laboratorium tidak
terjadi kerusakan alat ataupun hal-hal yang berbahaya (Widhy.2009).
Selain pengenalan alat laboratorium, sebelum melakukan praktikum atau
penelitian kultur jaringan, praktikan diharuskan dapat membuat media. Media
merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Keberhasilan
perbanyakan dan perkembangbiakan tanaman dengan metode kultur jaringan secara
umum sangat bergantung pada jenis media. Media tumbuh pada kultur jaringan sangat
besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang
dihasilkan (Tuhuteru,2012). Menurut Siregar (2013), media yang biasa digunakan
adalah Murashige & Skoog (MS), karena media MS digunakan untuk semua macam
tanaman terutama tanaman herbasius. Namun, dalam praktikum kali ini tidak hanya
menggunakan media MS, tetapi juga menggunakan media New Phaleopnoosis (NP)
karena media NP memiliki kemiripan unsur-unsur yang digunakan oleh MS.
Oleh karena itu, dalam praktikum kultur jaringan tumbuhan ini setelah
mengenal dan memahami mengenai alat dan cara penggunaannya maka dilanjutkan
dengan pembuatan media yang akan digunakan untuk tempat tumbuh eksplan.
B. Tujuan
1. Dapat mengenali dan mengetahui alat –alat yang dipakai dalam praktikum kultur
jaringan serta dapat mengetahui fungsi-fungsi dari alat di laboratorium kultur
jaringan.
2. Dapat mengetahui cara pembuatan media MS dan media NP dalam praktikum
kultur jaringan tumbuhan.
 BAB II
PEMBAHASAN

Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara

vegetatif. Kultur jaringan merupakan teknik perbanyakan tanaman dengan cara
mengisolasi bagian tanaman seperti daun, mata tunas, serta menumbuhkan bagian-
bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik yang kaya nutrisi dan zat pengatur
tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya sehingga bagian tanaman dapat
memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman lengkap.
Pelaksanaan kerja kultur jaringan tumbuhan memiliki tahapan-tahapan dan
urutan kerja yang khusus. Laboratorium harus diatur sedemikian rupa sehingga ada
tingkatan sterilitas ruangan sesuai dengan tahapan kerja termasuk alur keluar-
masuknya praktikan didalam laboratorium tersebut. Tahapan-tahapan kerja didalam
laboratorium kultur jaringan dibagi dalam 4 kelompok yaitu:
1. Persiapan
Merupakan tahap awal kerja kultur jaringan, dimulai dari menyiapkan alat-
alat, botol-botol kultur dan pembuatan medium (meracik, merebus dan membaginya
kedalam botol-botol sampai pada sterilisasi).
2. Inokulasi
Inokulasi meliputi sterilisasi, pengambilan bagian tanaman (biji anggrek) yang
akan dijadikan sebagai eksplan, kemudian menanamnya didalam atau diatas medium
buatan yang telah disediakan. Untuk inokulasi eksplan ini diperlukan kondisi yang
absolut steril.
3. Pemeliharaan
Setelah diinokulasi, botol kultur diletakkan di rak-rak pemeliharaan di ruang
inkubator untuk diikuti pertumbuhan dan perkembangannya sampai menjadi plantlet.
4. Aklimatisasi
Aklimatisasi merupakan proses penyesuaian/adaptasi plantlet dari kondisi
heterotrof di dalam botol kultur menjadi autotrof yang dapat ditanam pada kondisi
alamiahnya di tanah.
Saat memulai melakukan kegiatan kultur jaringan diperlukan ruang dan
peralatan. Ukuran ruang yang diperlukan dapat disesuaikan dengan volume aktivitas
kultur jaringan yang akan dilakukan. Ruang yang diperlukan untuk kegiatan kultur
jaringan yaitu laboratorium yang ideal yang memiliki: 1.) Ruang persiapan yang di
dalamnya terdapat timbangan analitik, lemari pendingin, hotplate, mikrowave, oven,
pH meter/pH stik, alat-alat gelas standar (labu ukur, erlenmeyer, batang pengaduk dari
gelas, dan wadah kultur), lemari untuk alat dan bahan kimia 2.) Ruang transfer yang
di dalamnya terdapat laminar air flow, dissecting, mikroskop, alat diseksi, lemari
tempat penyimpanan alat-alat steril, dan timbangan kecil. 3.) Ruang kultur yang
dilengkapi dengan rak kultur dan lampu fluorescent, timer untuk mengatur lama
penyinaran, AC untuk mengontrol temperatur, mikroskop binokuler, dan shaker
(Barahima, 2011).
Tabel 1. Ruang dan alat yang ada di laboratorium kultur jaringan tumbuhan FMIPA
UNY
No Gambar Keterangan
1 Ruang persiapan untuk kultur baik
alat, bahan maupun media. Tempat
penyimpanan alat-alat kultur dan
berbagai media sebelum
digunakan.

2 Rak Inkubator
Tempat pemeliharaan eksplan pada
media baik pada tahap induksi,
multiplikasi maupun tahap
perakaran

3
LAF (Laminar Airflow)
Untuk kegiatan isolasi tanaman,
sterilisasi dan penanaman eksplan
dalam media
 Tabel 2. Alat dan bahan sterilisasi
No Gambar Keterangan
1 Botol Jam
Tempat pertumbuhan eksplan

2 Petridish
Tempat pertumbuhan eksplan

3 Dibungkus kertas payung untuk

menghindari kontaminan setelah di
autoclave

4 Meletakan botol jam, botol kultur

dan alat lain yang akan diautoclave

5 Timbangan Analitik

Digunakan untuk menimbang

komposisi media

6 pH Stik

digunakan untuk mengukur

keasaman pH pada laruatan media
7. Autoclave
Digunakan untuk Sterilisasi alat
dan media

8. Hot plate & Magnetic stirer

Digunakan sebagai alat untuk

menghomogenkan bahan

Laboratorium yang ideal untuk melakukan kultur jaringan harus memenuhi

kriteria aman, bersih, dan memiliki penataan ruang yang baik. Untuk memenuhi
kriteria tersebut, dalam Laboratorium Kultur Jaringan FMIPA UNY agar tetap bersih
dan terhindar dari debu maka Laboratorium Kultur Jaringan FMIPA UNY dirancang
dengan jendela yang terbuat dari kaca permanen yang tidak dapat dibuka serta tidak
ada ventilasi dan tertutup rapat. Di dalam ruangan terdapat AC untuk
mempertahankan suhu agar konstan 25-28oC, dan dipasang exhauster untuk menyedot
debu yang ada di dalam ruangan. Pencahayaan dalam ruangan menggunakan lampu
yang terang untuk membuat ruangan menyerupai kondisi di luar ruangan yang
nantinya sebagai lingkungan tempat hidup tanaman yang dikultur, selain itu juga
untuk menjaga intensitas cahaya yang dibutuhkan oleh eksplan untuk
pertumbuhannya.

Laboratorium Kultur Jaringan FMIPA UNY memiliki penataan ruang yang

terbagi menjadi tiga ruangan, yaitu ruang preparasi, ruang inkubasi, dan ruang
inokulasi. Setiap ruangan dalam laboratorium memiliki fungsi yang berbeda-beda.

Ruang preparasi pada Laboratorium Kultur Jaringan FMIPA UNY merupakan

ruangan untuk persiapan dan berfungsi untuk mempersiapkan segala kebutuhan dalam
melakukan kultur jaringan, membersihkan alat-alat yang digunakan dalam kultur
jaringan seperti petridish dan botol jam, membuat media, sterilisasi alat, bahan dan
media, untuk mencuci peralatan, serta untuk menyimpan peralatan. Di dalam ruang
preparasi terdapat berbagai alat, diantaranya kompor gas, rak-rak tempat
penyimpanan alat, box kontainer untuk menyimpan botol kultur, timbangan analitik
untuk menimbang bahan, pH meter/stik, autoclave untuk mensterilkan alat dan bahan,
hot plate beserta magnetic stirer sebagai alat untuk menghomogenkan bahan, bak
untuk mencuci alat, berbagai alat-alat gelas standar seperti gelas ukur berbagai
ukuran, pipet, erlenmeyer berbagai ukuran, gelas piala, pengaduk, petridish, dan botol
jam.
Ruang yang kedua yaitu ruang inokulasi. Ruang inokulasi ini harus steril
karena ruang inokulasi merupakan ruang yang berfungsi untuk isolasi, penanaman,
dan subkultur. Dinding ruangan inokulasi terbuat dari bahan porselin atau bahan lain
yang mudah dibersihkan dan kedap dengan air. Ruang inokulasi harus terisolasi
sedemikian rupa namun masih tetap dapat berhubungan dengan ruangan yang lainnya
agar pekerjaannya menjadi mudah. Pintu penghubung pada ruangan ini harus selalu
tertutup agar tidak terjadi kontaminasi pada saat penanaman maupun subkultur. Pada
saat melakukan isolasi, penanaman, maupun subkultur dalam ruangan ini harus
menggunakan jas laboratorium yang bersih sehingga bakteri atau kontaminan lain
yang menempel pada tubuh maupun pakaian tidak dapat berpindah kedalam
pekerjaan.
Pada ruangan inokulasi terdapat alat yaitu Laminar Airflow (LAF) yang
merupakan meja kerja untuk proses isolasi, penanaman, dan subkultur. Selama
melakukan pekerjaan dalam ruang inokulasi, tangan praktikan dan alat-alat pemotong
seperti scalpel, gunting, dan alat pemotong lainnya harus disterilkan menggunakan
alkohol 96% dan selanjutnya dipanaskan menggunakan bunsen. Pada ruangan
inokulasi terdapat lampu UV ynag berfungsi untuk mensterilkan ruang dan LAF
sebelum digunakan.
Ruang yang terakhir yang terdapat dalam Laboratorium Kultur Jaringan
FMIPA UNY yaitu ruang inkubasi. Ruang inkubasi berfungsi untuk menyimpan hasil
kultur dan merupakan ruang untuk pertumbuhan. Pada ruangan ini kebersihannya
harus dijaga dan sedapat mungkin dihindari terlalu banyaknya orang yang keluar
masuk ruangan inkubasi. Di dalam ruangan inkubasi terdapat rak-rak terbuka yang
bertingkat dengan lampu fluorescent atau neon yang biasa digunakan untuk sumber
cahaya dalam ruang kultur. Keseimbangan spektrum lampu fluorescent sangat baik
dan efisien dalam penggunaan energi diabnding dengan lampu pijar. Bentuk lampu
memungkinkan penyebaran cahaya yang baik dengan panas yang dikeluarkan relatif
rendah sehingga cocok untuk pertumbuhan eksplan yang telah ditanam. Selain lampu,
AC juga merupakan salah satu alat yang penting dalam ruangan ini. AC berfungsi
untuk mengatur suhu sehingga suhu tetap konstan. Selain rak penyimpanan eksplan,
pada ruangan ini juga terdapat lemari penyimpanan bahan.
Sterilisasi alat dan bahan dilakukan sebelum melakukan kultur jaringan.
Barbagai macam alat dan bahan disterilkan menggunakan autoclave. Prinsip kerja
dari autoclave yaitu dengan mensterilkan alat dan bahan menggunakan uap panas
bertekanan 2 atm dengan suhu 121oC selama 15 menit untuk sterilisasi bahan dan 30
menit untuk sterilisasi alat. Autoclave dapat langsung mematikan sel-sel vegetatif dari
suatu mikroba, namun tidak semua bahan dapat disterilisasi menggunakan autoclave,
seperti serum, vitamin, antibiotik, dan enzim.
Autoklaf terutama ditujukan untuk membunuh endospora, yaitu sel resisten
yang diproduksi oleh bakteri, sel ini tahan terhadap pemanasan, kekeringan, dan
antibiotik. Untuk menggunakan autoclave, langkah pertama yang dilakukan yaitu
memeriksa banyaknya air destilasi. Apabila air kurang dari batas yang ditentukan,
maka harus ditambahkan hingga mencapai batas. Air yang digunakan yaitu air
destilasi untuk menghindari terjadinya karat. Setelah air diperiksa, alat dan bahan
yang sudah disiapkan dan dibungkus menggunakan kertas payung dapat dimasukkan,
kemudian autoclave dapat ditutup dengan rapat. Langkah selanjutnya yaitu mengatur
timer selama 15 menit untuk sterilisasi media dan 30 menit untuk sterilisasi alat. Atur
suhu pada autoclave sebesar 121oC. Tunggu hingga air mendidih sehingga uap
memenuhi kompartemen autoclave dan terdesak keluar klep pengaman, kemudian
klep pengaman ditutup dan dikencangkan. Jika alarm pada autoclave berbunyi, hal
tersebut menunjukkan bahwa sterilisasi telah selesai. Tutup autoclave dapat dibuka
ketika tekanan dalam kompartemen turun dan menunjukkan angka nol. Kemudian alat
atau bahan yang disterilisasi dapat dikeluarkan dengan hati-hati.
Sebelum membuat media, terlebih dahulu dilakukan pembuatan larutan stock.
Larutan stock dibuat dengan tujuan untuk memudahkan pengambilan bahan-bahan
kimia khususnya yang dibutuhkan dalam jumlah kecil, tak perlu sering menimbang
karena hal ini kurang praktis. larutan stock disimpan di dalam lemari pendingin agar
tidak mudah rusak dan mencegah terdegradasinya bahan-bahan kimia oleh mikroba
penyebab kontaminasi. pembuatan larutan stock harus dilakukan dengan cermat,
sebab larutan stock yang terlalu pekat akan mengalami pengendapan di lemari es, dan
larutan stock yang terkontaminasi tidak boleh digunakan lagi (Hendaryono dan
Wijayani, 2002).
Larutan stok yang dibuat yaitu larutan stok makronutrient dan larutan stok
mikronutrient. Larutan stok makronutrient untuk media NP dibuat sebanyak 200 ml
untuk 5 kali konsentrasi. Komposisi bahan yang digunakan yaitu 1519,5 mg/l
(NH4)2SO4, 2313,5 mg/l KH2PO4, 160 mg/l NH4NO3, 2123 mg/l KNO3, 3188 mg/l
Ca(NO3)2.6H2O, dan 1282 mg/l Mg(NO3)2. 6H2O. Semua bahan dimasukkan kedalam
100 ml aquadest satu-persatu secara urut. Ketika semua bahan telah dimasukkan
kedalam 100 ml aquadest, langkah selanjutnya adalah menambahkan aquadest lagi
sampai volume nya menjadi 200 ml Saat setiap bahan yang dimasukkan kedalam
aquadest, harus diaduk agar bahan tidak menggumpal. Bahan dihomogenkan
menggunakan stirer.
Larutan stok mikronutrient untuk media NP dibuat sebanyak 200 ml untuk 5
kali konsentrasi. Larutan stok mikronutrient dibuat dengan cara sebanyak 55,75 mg/l
MnSO4.4H2O dalam 100 ml aquadest steril dan dihomogenkan menggunakan stirer.
Kedalam larutan tersebut dimasukkan berturut-turut dengan 21,5 mg/l ZnSO4.7H2O,
15,5 mg/l H3BO3, 2,075 mg/l KI, 0,625 mg/l NO2.MoO4.2H2O, 0,0625 mg/l
CoCl2.6H2O dan 0,0625 mg/l CuSO4.5H2O. Saat memasukkan bahan, harus selalu
diaduk agar campuran tidak menggumpal. Semua bahan dimasukkan satu persatu dan
dihomogenkan menggunakan stirer dalam aquadest hingga volume mencapai 200 ml.
Selanjutnya ialah membuat larutan stok untuk media MS. Larutan stok
makronutrient untuk media MS dibuat sebanyak 200 ml untuk 5 kali konsentrasi.
Larutan stok makronutrient dibuat dengan cara sebanyak 8250 mg/l NH4NO3, 9500
mg/l KNO3, 1850 mg/l MgSO4.7H20, 850 mg/l KH2PO4 dan 2200 mg/l CaCl2.2H2O
Semua bahan dimasukkan kedalam 100 ml aquadest satu-persatu secara urut. Ketika
semua bahan telah dimasukkan kedalam 100 ml aquadest, langkah selanjutnya adalah
menambahkan aquadest lagi sampai volume nya menjadi 200 ml. Saat setiap bahan
yang dimasukkan kedalam aquadest, harus diaduk agar bahan tidak menggumpal.
Bahan dihomogenkan menggunakan stirer.
Larutan stok mikronutrient untuk media MS dibuat sebanyak 200 ml untuk 5
kali konsentrasi. Larutan stok mikronutrient dibuat dengan cara sebanyak 111,5 mg/l
MnSO4.4H2O dalam 100 ml aquadest steril dan dihomogenkan menggunakan stirer.
Kedalam larutan tersebut dimasukkan berturut-turut dengan 43 mg/l ZnSO4.7H2O, 31
mg/l H3BO3, 4,15 mg/l KI, 1,25 mg/l Na2.MoO4.2H2O, 0,125 mg/l CuSO4.5H2O dan
0,125 mg/l CoCl2.6H2O. Saat memasukkan bahan, harus selalu diaduk agar campuran
tidak menggumpal. Semua bahan dimasukkan satu persatu dan dihomogenkan
menggunakan stirer dalam aquadest hingga volume mencapai 200 ml.

Setelah pembuatan stok selesai dilakukan, langkah selanjutnya adalah

melakukan pembuatan media. Media kultur adalah salah satu faktor penentu
keberhasilan. Media kultur merupakan komponen faktor lingkungan yang
menyediakan unsur pertumbuhan tanaman. Media kultur jaringan tanaman berfungsi
sebagai sumber air, menyediakan kebutuhan hara mineral, vitamin, zat pengatur
tumbuh. Secara umum media kultur jaringan terdiri dari bahan organik dan anorganik.
Bahan organik sebagai sumber karbon, zat pengatur tumbuh dan vitamin sedangkan
bahan anorganik seperti hara makro dan unsur hara mikro, memiliki komposisi yang
berbeda-beda pada tiap media baik dari segi jumlah maupun bentuknya. Formulasi
media Murashige dan Skoog (dikenal dengan Media MS) merupakan formula media
yang paling banyak digunakan saat ini, karena media ini bisa diaplikasikan pada
berbagai jenis tanaman. pada praktikum ini telah dilakukan pembuatan formulasi
media (Campbell, 2012).
Pada praktikum pembuatan media MS, dibuat tiga macam formula medium,
yaitu MS+AK (600 ml), MS+AK+ 2,4 D (200 ml), dan MS+AK+ BAP (200ml). Alat-
alat yang digunakan dalam praktikum pembuatan media MS diantaranya adalah Gelas
beker, pipet, timbangan, spatula, pH stick, panci, hot plate, stirrer, dan autoklaf.
Sedangkan bahan-bahan yang diperlukan adalah bahan baku MS yang terdiri dari
larutan stok unsur mikro, unsur makro, besi, vitamin, myoinositol, agar-agar, sukrosa,
dan air kelapa, pH stick, botol jam, dan botol UC.
Medium pertama adalah MS+AK (600ml), langkah pertama yang dilakukan
adalah menyiapkan bahan baku MS dan menyiapkan aquadest 100ml ke dalam gelas
beaker. Langkah selanjutnya adalah memasukkan 100ml aquadest yang telah diukur
ke dalam labu ukur, kemudian ditambahkan unsur makro sebanyak 24ml, kemudian
dipanaskan serta diaduk menggunakan magnet stirrer di atas hot plate. Setelah
homogen, ditambahkan unsur mikro sebanyak 3ml, lalu dipanaskan dan
dihomogenkan. Vitamin sebanyak 6ml ditambahkan kemudian dipanaskan dan
dihomogenkan. Sukrosa sebanyak 12gr ditambahkan, dipanaskan dan dihomogenkan.
Setelah homogen, ditambahkan iron (Fe) sebanyak 3ml dipanaskan dan
dihomogenkan. Kemudian myo inositol sebanyak 12ml ditambahkan, lalu dipanaskan
dan dihomogenkan kembali. Selanjutnya adalah penambahan air kelapa (AK)
sebanyak 90ml. Setelah itu, dilakukan pengukuran pH menggunakan pH stick hingga
pH optimum yaitu 5,6-5,8 atau pada indikator pH stick mendekati indikator nomor 6.
Apabila pH sudah optimum, ditambahkan aquadest hingga volume mencapai 600ml,
kemudian dipanaskan dan dihomogenkan kembali. Setelah itu, ditambahkan agar-agar
sebanyak 4,2 gram lalu larutan tersebut diaduk dan panaskan hingga mendidih.
Setelah mendidih, media dituangkan ke dalam botol jam masing-masing + 40ml.
Media MS yang ke dua adalah dengan memodifikasi media MS dengan air
kelapa dan hormon auksin (1ppm) atau MS+AK+ 2,4 D (200ml). Langkah-langkah
yang dilakukan hampir sama yaitu pertama perlu dipersiapkan aquadest sebanyak
100ml, kemudian unsur makro sebanyak 8ml ditambahkan ke dalam labu ukur yang
sudah berisi aquadest kemudian dipanaskan dan diaduk menggunakan stirrer di atas
hot plate. Kemudian ditambahkan unsur mikro sebanyak 1ml diaduk menggunakan
stirrer di atas hot plate, vitamin sebanyak 2ml ditambahkan dan diaduk menggunakan
stirrer di atas hot plate, kemudian sukrosa sebanyak 4gr ditambahkan dan diaduk
menggunakan stirrer di atas hot plate, kemudian Iron (Fe) sebanyak 1ml ditambahkan
dan diaduk menggunakan stirrer di atas hot plate. Selanjutnya ditambahkan myo
inositol sebanyak 4ml dan diaduk menggunakan stirrer di atas hot plate. Setelah
larutan homogen, air kelapa sebanyak 30ml ditambahkan dalam larutan tersebut lalu
diaduk menggunakan stirrer di atas hot plate. Ditambahkan 2,4 D (auksin) yang
berasal dari stock yang telah dibuat sebanyak 2ml untuk 200ml formula MS dan
diaduk menggunakan stirrer di atas hot plate. Setelah diaduk dengan stirrer di atas hot
plate, diukur pH menggunakan pH stick. pH optimum adalah 5,6-5,8, atau pada
indikator pH stick mendekati angka 6. Setelah diukur pH, kemudian ditambahkan
aquadest hingga volume mencapai 200ml, ditambahkan agar-agar sebanyak 1,4gr,
kemudian diaduk dengan stirrer dan dipanaskan di atas hotplate hingga mendidih.
Setelah mendidih, larutan didiamkan sejenak lalu dituangkan ke dalam botol UC
masing-masing + 15ml.
Media MS yang ketiga adalah dengan mengkombinasikan Air kelapa dan
BAP (2ppm) atau MS+AK+BAP (200ml). Urutan langkah pembuatan media ini sama
dengan media MS yang dikombinasikan dengan air kelapa dan 2,4 D, yaitu dengan
menambahkan unsur makro sebanak 8ml, unsur mikro sebanyak 1ml, vitamin
sebanyak 2ml, sukrosa sebanyak 4gr, Iron (Fe) sebanyak 1ml, Myo inositol 4ml, AK
sebanyak... 30ml, BAP (hormon sitokinin) sebanyak 0,4ml, kemudian dilakukan uji
pH, lalu ditambahkan aquadest hingga volume mencapai 200ml dan ditambahkan
agar-agar sebanyak 1,4 serta dididihkan. Tiap-tiap penambahan nutrisi diselingi
dengan mengaduk larutan dengan magnet stirrer di atas hotplate. Setelah mendidih,
larutan didiamkan sejenak kemudian dituangkan ke dalam botol UC masing-masing +
15ml.
Botol jam dan botol UC yang sudah berisi media dan sudah ditutup dengan
tutup botolnya atau ditutup menggunakan plastik serta diikat menggunakan karet,
selanjutnya disterilisasi dengan menggunakan autoclave. Teknik sterilisasi media
dilakukan selama 30 menit dan media siap disimpan dan digunakan untuk praktikum
selanjutnya yaitu penanaman explan.
Media Murashige & Skoog (media MS) merupakan perbaikan komposisi
media Skoog, terutama kebutuhan garam anorganik. Media MS mengandung 40 mm
N dalam bentuk NO3- dan 29 mm N dalam bentuk NH4+. Kandungan N ini, lima kali
lebih tinggi dari N total yang terdapat pada media Miller, 15 kali lebih tinggi dari
media tembakau Hildebrant, dan 19 kali lebih tinggi dari media White. Kalium juga
ditingkatkan sampai 20 mM, sedangkan P 1.25 mM. Unsur makro lainnya
konsentrasinya dinaikkan sedikit. Pertama kali unsur-unsur makro dalam media MS
dibuat untuk kultur kalus tembakau, tetapi komposisi MS ini sudah umum digunakan
untuk kultur jaringan jenis tanaman lain. Kebutuhan nutrisi mineral untuk tanaman
yang dikulturkan secara in-vitro pada dasarnya sama dengan kebutuhan hara tanaman
yang ditumbuhakan di tanah. Unsur-unsur hara yang dibutuhkan tanaman di lapangan
merupakan kebutuhan pokok yang harus tersedia dalam media kultur jaringan. Antara
lain adalah unsur hara makro dan unsur hara mikro. Unsur-unsur hara tersebut
diberikan dalam bentuk garam-garam mineral. Unsur hara makro adalah hara yang
dibutuhkan tanaman dalam jumlah yang banyak. Hara makro tersebut meliputi,
Nitrogen (N), Fosfor (P), Kalium (K), Kalsium (Ca), Sulfur (S), Magnesium (Mg),
dan Besi (Fe). Unsur hara mikro adalah hara yang dibutuhkan dalam jumlah yang
sedikit. Unsur hara mikro ini merupakan komponen sel tanaman yang penting dalam
proses metabolisme dan proses fisiologi lainnya (Kadhimi, 2014).
Kemudian vitamin yang paling sering digunakan dalam media kultur
jaringan tanaman adalah thiamine (vitamin B1), nicotinic acid (niacin), pyridoxine
(vitamin B6). Thiamine merupakan vitamin yang esensial dalam kultur jaringan
tanaman karena thiamine mempengaruhi pertumbuhan dan perkembangan sel.
Vitamin C, seperti asam sitrat dan asam askorbat, kadang-kadang digunakan sebagai
antioksidan untuk mencegah atau mengurangi pencoklatan atau penghitaman eksplan
(Kadhimi, 2014).
Senyawa organik sering ditambahkan ke dalam media sebagai sumber
pembentuk asam amino dan vitamin. Dalam praktikum yang telah dilakukan,
digunakan air kelapa sebagai komponen senyawa organik. Senyawa organik lain yang
sering ditambahkan adalah ekstrak ragi, ekstrak buah, dan casein hydrolisat. Sebagai
sumber energi, ditambahkan dari senyawa-senyawa yang merupakan sumber
karbohidrat. Dalam praktikum ini digunakan sukrosa yangmana sukrosa merupakan
sumber karbohidrat paling baik bagi tanaman. Sumber karbohidrat lain yang dapat
ditambahkan yaitu glukosa, fruktosa, dan maltosa. Selain sebagai sumber energi,
senyawa ini juga berfungsi sebagai penyeimbang tekanan osmotik media (Laisina,
2013). Fe berfungsi sebagai penyangga (chelatin agent) yang sangat penting untuk
menyangga kestabilan pH media selama digunakan untuk menumbuhkan jaringan
tanaman.Pada tanaman, Fe berfungsi untuk pernapasan dan pembentukan hijau daun.
Sedangkan mio-Inositol sering digunakan sebagai salah satu komponen media yang
penting, karena terbukti bersinergis dengan zat pengaturtumbuh merangsang
pertumbuhan jaringan yang dikulturkan (Kadhimi, 2014).
Pada praktikum pembuatan media MS padat diperlukan agar-agar sebagai
salah satu bahan pembuatan media MS, dimana agar-agar berfungsi untuk
memadatkan larutan yang telah mengandung berbagai nutrisi tersebut. Keuntungan
dari pemakaian agar-agar adalah, agar-agar tidak dicerna oleh enzim tanaman dan
tidak bereaksi dengan persenyawaan-persenyawaan penyusun media (Laisina, 2013).
Zat-zat organik adalah persenyawaan yang mengandung karbon, ditambahkan pada
medium kultur jaringan berupa gula, myo-Inositol, vitamin, asam-asam amino dan zat
pengatur tumbuh. Zat-zat organik tersebut biasanya tidak diberikan pada tanaman
karena tanaman dapat mensintesis sendiri, tetapi pada kultur in vitro, karena eksplan
yang digunakan umumnya berukuran sangat kecil dan tidak marnpu mensintesis
sendiri semua zat-zat organik tersebut, maka zat-zat organik harus ditambahkan pada
medium (Torres, 1989).
Zat pengatur tumbuh (ZPT) adalah senyawa organik ataupun anorganik yang
hanya dibutuhkan tanaman dalam konsentrasi yang sedikit. Zat pengatur tumbuh
(hormon) yang ditambahkan dalam media tanam kultur jaringan bervariasi, baik
jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang
dilakukan. Menutut Paramartha (2012), ZPT yang sering digunakan untuk
menginduksi pertumbuhan pada teknik mikropropagasi adalah golongan auksin dan
sitokinin dimana pada praktikum ini juga digunakan kedua hormon tersebut, yaitu 2,4
D dan BAP (Patel, 2013).
Hormon adalah bahan organik yang disintesa pada jaringan tanaman.
Hormon diperlukan dalam konsentrasi rendah untuk mempengaruhi pertumbuhan dan
perkembangan tanaman. Banyak molekul sintetis organik yang telah dikenal memiliki
aktivitas serupa hormon. Senyawa sintetis dan hormon yang secara alami ada, dikenal
dengan sebutan zat pengatur tumbuh (Heddy, 1991). Penggunaan hormon tersebut
harus tepat dalam perhitungan dosis pemakaian, karena jika terlalu banyak maupun
terlalu sedikit dari dosis yang diperlukan justru akan menghambat bahkan berdampak
negatif terhadap tanaman kultur. Karena interaksi antar hormon dalam suatu media
sangat berpengaruh dalam diferensiasi sel (Kadhimi, 2014).
Faktor penting lain dalam pembuatan media kultur jaingan adalah pH. PH
pada medium tumbuh untuk kultur jaringan harus diperhatikan karena untuk
menjamin ketersediaan unsur hara bagi exsplan di dalam botol kultur. Media yang
baik harus selalu berada dalam pH optimal yaitu 5,6-5,8. Apabila pH kurang dari 5,
media agar akan terlalu lemah, sebaliknya apabila pH di atas 7, maka media agar
terlalu padat dan tidak bisa digunakan untuk penanaman eksplan dengan baik.
Sehingga pH merupakan faktor penting yang harus diatur sedemikian rupa sehingga
tidak mengganggu fungsi membran sel. Apabila ternyata pH < 5,8 maka harus ada
penambahan NaOh. Apabila nilai pH > 5,8 maka harus diberi KCl. Selain itu,
dalam pembuatan media juga harus dalam keadaan yang steril sehingga dilakukan
pembuatan media dalam tempat yang steril, dan juga dilakukan sterilisasi pada media
itu sendiri dengan menggunakan autoclave (Mirsadiq, 2013).
Media NP (New Phaleopnosis) adalah media yang digunakan untuk tumbuhan
Phalaenopsis. Media ini merupakan modifikasi dari MS karena unsur-unsur NP
memiliki kemiripan dengan MS. Media ini memiliki ciri ciri bentuknya serbuk
berwarna putih hingga berwarna krem, dapat larut di dalam air, memiliki konsentrasi
saat digunakan sebesar 25,35 gram per liter. Dalam praktikum kultur jaringan
tumbuhan ini langkah awal yang dilakukan adalah pembuatan media NP sebanyak
400 ml dan 600 ml. Dalam pembuatan media NP dibutuhkan bahan-bahan berupa:
larutan makro dan mikro, larutan besi, vitamin, myoinositol, air kelapa dan juga
sukrosa. Berikut komposisi dan takaran bahan-bahan pembuatan media NP 400 ml
dan 600 ml :
 No Larutan Jumlah untuk NP Jumlah untuk NP
600 ml 400 ml
1. Larutan makro 24 ml 16 ml
2. Larutan mikro 0,75 ml 0,5 ml
3. Besi 3 ml 2 ml
4. Agar 4,2 g 2,8 g
5. Vitamin 6 ml 4 ml
6. Myoinositol 24 ml 16 ml
7. Air kelapa 90 ml 60 ml
8. sukrosa 12 g 8g
Untuk mendapatkan jumlah takaran yang diinginkan yang harus dilakukan
adalah menyiapkan semua bahan-bahan terlebih dahulu, kemudian melihat keterangan
jumlah pada bagian kemasan bahan yang akan digunakan, lalu di dilakukan
pengenceran sesuai dengan jumlah yang akan dibutuhkan. Ketika semua bahan telah
tersedia, maka langkah selanjutnya adalah menyiapkan gelas bekker yang telah diberi
magnetik stirer serta aquades sebanyak 200 ml dan diletakkan di atas hot plate yang
memiliki fungsi untuk menghomogenkan dan juga untuk pemanas. Hot plate juga
merupakan alat untuk mencampur dan memasak media kultur. Hot plate digunakan
untuk memasak segala macam bahan nutrisi dengan melibatkan pengaduk dan
pemanas. Setelah itu, bahan yang telah tersedia dimasukkan ke dalam gelas beker satu
persatu hingga tercampur semua. Setelah air kelapa sudah dimasukkan langkah
selanjutnya adalah mengukur pH.
Menurut Gamborg dan Shyluk (1981) pH harus sedemikian rupa di perhatikan
agar tidak mengganggu fungsi membran sel dan pH dari sitoplasma. Pengaturan pH
selain memperhatikan kepentingan fisiologi sel, juga harus mempertimbangkan
faktor-faktor kelarutan dari garam-garam penyusun media, pengambilan dari zat
pengatur tumbuh dan garam-garam lain, dan efisiensi pembekuan agar-agar. Sel-sel
tanaman membutuhkan pH yang sedikit asam dengan kisaran 5,5 – 5,8. Apabila
belum memenuhi maka ditambahkan aquadest sampe larutan menjadi 400 ml untuk
media pertama dan 600 ml untuk media kedua. Setelah semua telah selesai, maka
larutaan tersebut langsung dipanaskan hingga mendidih dan di diamkan beberapa saat
hingga dingin lalu di tuangkan ke dalam cawan petri yang telah di autoklaf.
C. Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, Laboratorium Kultur Jaringan
FMIPA UNY memiliki penataan ruang yang terbagi menjadi tiga ruangan, yaitu ruang
preparasi, ruang inkubasi, dan ruang inokulasi. Berdasarkan kegiatan sterilisasi alat,
dapat ditarik kesimpulan bahwa sterilisasi alat, bahan seperti aquadest dan media
penting dilakukan dan semua alat yang akan digunakan untuk kultur jaringan harus
disterilisasi terlebih dahulu karena salah satu syarat dalam melakukan kultur jaringan
tumbuhan adalah dalam kondisi yang aseptik supaya tidak terdapat kontaminan dalam
alat – alat tersebut.
 DAFTAR PUSTAKA

Barahima, Abbas. 2011. Prinsip Dasar Teknik Kultur Jaringan. Bandung: Alfabeta
Campbell, et al. 2012. Biologi Edisi Kedelapan Jilid 2. Jakarta: Erlangga.
Gamborg OL, Shyluk JP. 1981.Nutrion, media and characteristic of plant cell and tissue
culture. Di dalam: Thorpe TA (ed). Plant Tissue Culture Methods and Aplication in
Agriculture. New York: Academic Pr
Heddy, Suwarsono. 1991. Hormon Tumbuhan. Jakarta: Raja Grafindo Persada.
Kadhimi, Ahsan, et al. 2014. Tissue Culture and Some of The Factors Affecting Them and
The Micropropagation of Strawberry. Life Science Journal. Vol: 11(8).
Laisina, Jane K. J. 2010. Perbanyakan Ubi Jalar secara In Vitro dengan Menggunakan
Media yang Murah. Ambon: Universitas Pattimur. Vol. 06 No. 02. Hal. 63-67.
Mirsadiq, L. 2013. Teknik Budidaya Tanaman Hortikultura. Surakarta: Universitas Sebelas
Maret Press.
Patel, H., R. Krishnamurthy,. 2013. Elicitors in Plant Tissue Culture. Journal of
Pharmacognosy and Phytochemistry.Vol: 2(2).
Suryowinoto, Moeso. 2000. Pemulihan Tanaman Secara In Vitro. Kanisius. Yogyakarta.
Torres, K. C. 1989. Tissue Culture Techniques for Horticultural Crops. New York: Van
Nostrand Reinhold.
Tuhuteru,S.,M.I.Hehanussa, dan S.H.T. Raharjo.2012. Perttumbuhan dan Perkembangan
Anggrek Dendrobium anosmum pada Media Kultur In Vitro dengan Beberapa
Konsentrasi Air Kelapa. Agrologia 1(1):1-12
Widhy.2009. Pengertian Alat dan Bahan di Laboratorium IPA. Yogyakarta. UNY
 LAMPIRAN

Larutan stock disiapkan Aquadest 100ml Pemanasan larutan di atas

hotplate

Penambahan larutan-laritan Larutan dididihkan Pengukuran volume media

stock dengan gelas ukur

Media dituang ke dalam Media disusun dalam Media disterilisasikan

botol keranjang menggunakan autoklaf