BAB II

TINJAUAN PUSTAKA
A. Leptospirosis
Leptospirosis adalah penyakit zoonosis dengan beban penyakit
global yang berdampak pada negara maju dan berkembang. Ini disebabkan
oleh spirochetes patogen dari genus Leptospira. L.interrogans yang patogen
memiliki lebih dari 250 serovar yang tersusun dalam 25 serogrup. Di Sri
Lanka, dicurigai leptospirosis adalah penyakit yang harus dilaporkan.
(Ministry of Health, 2016)
Spirochetes mengkolonisasi tubulus ginjal proksimal pembawa yang
mencakup hewan ternak liar dan domestik, termasuk hewan pengerat, sapi,
anjing, dan babi, dan diekskresikan dalam urin. Tikus dan hewan pengerat,
sapi, anjing, dan babi telah terbukti menjadi beberapa inang reservoir yang
ada di Sri Lanka. (Ministry of Health, 2016)
Penularan ke manusia dapat langsung dengan inokulasi dengan
jaringan hewan atau cairan tubuh yang terinfeksi, atau tidak langsung
dengan organisme yang masuk melalui permukaan mukosa atau kulit yang
rusak dari urin yang terinfeksi atau lingkungan yang terkontaminasi seperti
tanah lembab di tanah pertanian, danau, sungai dan sungai. Beberapa
penelitian telah menunjukkan kelangsungan hidup leptospira patogen di
lingkungan mulai dari 3-14 hari. (Ministry of Health, 2016)
Mekanisme patogen yang tepat dari leptospirosis belum dijelaskan,
tetapi variasi luas dalam manifestasi klinis menunjukkan beragam faktor
yang berkontribusi. Penyakit ini digambarkan sebagai biphasic dengan fase
bakteremik dan fase imun. Pada fase bakteremia, leptospira berkembang
biak dan menyebar ke seluruh tubuh sehingga menyebabkan kerusakan
jaringan langsung. Pada fase kekebalan, yang ditandai dengan adanya
antibodi IgM dalam darah, leptospira dibersihkan dari sebagian besar situs
tubuh tetapi kerusakan jaringan berlanjut karena mekanisme kekebalan
tubuh. (Ministry of Health, 2016)
Leptospirosis dapat memiliki perjalanan klinis yang sangat bervariasi.
Masa inkubasi biasanya 5–14 hari, dengan kisaran 2–30 hari. Sebagian
besar infeksi akan asimtomatik atau menyerupai flu ringan dan dapat berlalu
tanpa mendapat perhatian medis. Namun, sejumlah kecil kasus dapat
 mengembangkan bentuk penyakit parah dengan kegagalan multi-organ dan
CFR lebih dari 40%.(Ministry of Health, 2016)
Pada fase bakteremik awal, ada demam onset akut dengan menggigil
dan keras, sakit kepala, mialgia, mual dan muntah. Suffusion konjungtiva
biasanya muncul pada hari ketiga penyakit dan merupakan karakteristik
tetapi tidak spesifik. Mialgia adalah karakteristik di betis tetapi juga menonjol
di punggung dan leher. Pada fase imun, demam dan gejala konstitusional
lainnya mungkin menetap pada beberapa pasien. (Ministry of Health, 2016)
Timbulnya keterlibatan organ akan tampak pada penyakit berat
dengan perkembangan oliguria, ikterus, meningisme, perdarahan, syok,
keterlibatan paru, dan miokarditis. Organ yang paling umum terlibat adalah
ginjal dengan nefritis interstitial dan nekrosis tubular akut yang menyebabkan
cedera ginjal akut. Keterlibatan paru dan keterlibatan multi-organ memiliki
CFR yang lebih tinggi. (Ministry of Health, 2016)
Risiko paparan leptospirosis, pekerjaan berisiko tinggi seperti
pertanian padi, pekerjaan konstruksi, penambangan permata, penambangan
pasir. Kegiatan rekreasi di sawah / tanah berlumpur, arung jeram. Kontak
dengan air yang berpotensi terkontaminasi seperti membersihkan saluran /
sumur, mandi dan mencuci di aliran air kecil, sungai dan danau, air banjir.
Kontak dengan hewan atau tisu hewan seperti sapi, kerbau - penangan
hewan, dokter hewan, tukang daging, pekerja pengontrol tikus, pekerja RPH.
Kontak dengan air yang terkontaminasi urin dari hewan yang dikenal sebagai
spesies reservoir adalah kondisi risiko terpenting dalam penularan. Spesies
reservoir yang dikenal termasuk tikus dan hewan pengerat lainnya, kerbau,
sapi, anjing dan babi. Kehadiran kulit yang terluka meningkatkan risiko
infeksi. (Ministry of Health, 2016)
B. Diagnosis Leptospirosis
Pada leptospirosis, karena variabilitas dalam manifestasi klinis,
diagnosisnya sulit berdasarkan kriteria klinis saja. Deteksi dini infeksi akan
memfasilitasi pendekatan yang lebih fokus dan dapat mencegah komplikasi.
Pasien yang diduga secara klinis menderita leptospirosis seharusnya tidak
menunggu hasil tes laboratorium untuk memulai pengobatan. (Ministry of
Health, 2016)
Konfirmasi laboratorium sama pentingnya dengan alasan
epidemiologis dan kesehatan masyarakat. Dengan menentukan serovar
yang menginfeksi, host reservoir potensial dan kemungkinan sumber infeksi
dapat diidentifikasi untuk memandu strategi pengendalian. (Ministry of
Health, 2016)
Diagnosis laboratorium memiliki dua metode: bukti langsung
termasuk demonstrasi leptospira atau asam Deoksiribonukleat (DNA) atau
isolasi, dan bukti tidak langsung didasarkan pada deteksi antibodi spesifik
terhadap leptospira. (Ministry of Health, 2016)
Metode Deteksi Langsung
1. Isolasi leptospira
Leptospiremia terjadi selama inkubasi lambat hingga akhir minggu
pertama dari penyakit akut. Karena itu, darah dan cairan serebrospinal
(CSF) harus diperoleh sesegera mungkin pada presentasi dalam minggu
pertama, sebelum antibiotik. Isolasi leptospira tetap menjadi tes 'standar
emas' yang tersedia di laboratorium rujukan. Karena leptospire adalah
organisme yang sangat menular, ia membutuhkan keamanan bio tingkat
– 3 fasilitas untuk budaya. Selain itu, memakan waktu, padat karya dan
memiliki hasil diagnostik yang rendah. Tetapi ini adalah metode pilihan
untuk mengidentifikasi serovar yang beredar dan berguna untuk uji
kerentanan antibiotik. (Ministry of Health, 2016)
2. Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR memiliki keunggulan dalam mendiagnosis penyakit dini
terutama selama fase leptospiraemik akut (minggu pertama penyakit)
sebelum munculnya antibodi. Sensitivitas dan spesifisitas tes PCR waktu-
nyata sangat tinggi. Metode baru akan mendeteksi leptospira patogen
dan dapat diklasifikasikan ke dalam genomospesies. (Ministry of Health,
2016)
3. Mikroskop Tanah Gelap
Mikroskopi tanah gelap cairan tubuh memiliki sensitivitas yang
sangat rendah dan kurang memiliki kekhususan bahkan di tangan yang
berpengalaman. Sekitar 104 leptospira / ml diperlukan agar satu sel per
bidang dapat dilihat dengan mikroskop tanah gelap. Tidak
direkomendasikan sebagai tes konfirmasi. (Ministry of Health, 2016)
4. Metode Deteksi Antigen
Tes ini tidak tersedia untuk leptospirosis manusia. Saat ini, mereka
hanya digunakan dalam air seni hewan. (Ministry of Health, 2016)
 Metode Deteksi Tidak Langsung
Sebagian besar kasus leptospirosis didiagnosis dengan serologi.
Metode serologis dapat spesifik genus atau serogrup. Antibodi pada
leptospirosis dapat dideteksi pada hari ke 6 sampai 10 penyakit dan
mencapai puncaknya dalam 3 hingga 4 minggu. Tingkat antibodi secara
bertahap surut dalam beberapa minggu hingga bulan, tetapi antibodi spesifik
serovar tetap terdeteksi selama beberapa tahun. Dalam 10% kasus, antibodi
tidak akan terdeteksi. (Ministry of Health, 2016)
1. Uji Aglutinasi Mikroskopis (MAT)
MAT dianggap sebagai metode 'referensi serologis'. Antibodi MAT
biasanya muncul setelah 7 hari penyakit. Diperlukan pengalaman untuk
mengurangi efek subjektif variasi pengamat dalam MAT bahkan di dalam
laboratorium. Selain itu, kultur hidup dari semua serovar / serogrup yang
diperlukan untuk pengujian karena antigen harus dipertahankan. Oleh
karena itu, tes biasanya hanya tersedia di laboratorium rujukan. MAT
yang menggunakan serovar patogenik sangat spesifik dan sensitif ketika
menggunakan serum akut dan penyembuhan. Tetapi memakan waktu
dan berbahaya karena risiko pajanan terhadap antigen hidup. Reaksi
silang dapat terjadi dengan sifilis, hepatitis virus, human
immunodeficiency virus (HIV), demam kambuh, penyakit Lyme,
legionellosis dan penyakit autoimun. (Ministry of Health, 2016)
2. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)
IgM ELISA digunakan sebagai uji diagnostik cepat untuk
leptospirosis di daerah endemis. Banyak laboratorium di Sri Lanka
menggunakan tes ini di pengaturan rumah sakit. Penting untuk
memastikan bahwa uji ELISA yang digunakan memiliki sensitivitas dan
spesifisitas tinggi di pengaturan Sri Lanka. Oleh karena itu disarankan
untuk mendapatkan panduan dalam hal ini dari National Reference
Laboratory untuk diagnosis leptospirosis, Medical Research Institute.
(Ministry of Health, 2016)
C. Polymerase Chain Reaction
PCR sekarang merupakan teknik umum dan sering sangat diperlukan
yang digunakan dalam laboratorium penelitian medis dan biologi untuk
berbagai aplikasi. Ini termasuk kloning DNA untuk sekuensing, filogeni
berbasis DNA, atau analisis fungsional gen; diagnosis penyakit keturunan;
identifikasi sidik jari genetik (digunakan dalam ilmu forensik dan pengujian
paternitas); dan deteksi dan diagnosis penyakit menular.(Patel et al, 2015)
Berbagai macam aplikasi PCR telah menyebabkan daftar varian
teknik yang terus berkembang. Sementara beberapa dioptimalkan untuk
memenuhi persyaratan spesifik dan sangat mirip dengan PCR dasar, yang
lain benar-benar mengubah tekniknya untuk merumuskan aplikasi kreatif
baru di berbagai bidang. Artikel ini mencantumkan beberapa varian PCR
secara alfabet dengan harapan menciptakan kesadaran akan variasi yang
telah dibuat untuk tujuan yang sangat spesifik tetapi mungkin memiliki
aplikasi yang lain, serta untuk membantu dalam meningkatkan kesadaran
akan berbagai aplikasi untuk teknik ini secara umum. (Patel et al, 2015)
1. Allele-specific PCR
Daripada merancang primer untuk bagian invarian genom untuk
memperkuat area yang lebih polimorfik di antara mereka, setidaknya
salah satu primer yang digunakan dalam variasi PCR ini saling
melengkapi dengan area polimorfik, dengan mutasi terletak pada
akhirnya 3 '. Karena primer yang tidak cocok tidak akan memulai
replikasi sedangkan primer yang cocok akan, amplifikasi adalah indikasi
mutasi yang hadir. Ini digunakan dalam genotip SNP. (Patel et al, 2015)
2. Assembly (Polymerase Cycling Assembly atau PCA) PCR
Molekul DNA panjang dibuat dari oligonukleotida panjang dengan
segmen tumpang tindih pendek. Primer dengan tumpang tindih
digunakan untuk membuat produk yang kemudian dapat digunakan
sebagai templat untuk menghasilkan molekul DNA yang panjang
(Stemmer et al., 1995).
3. Asymmetric PCR
Satu untai DNA lebih disukai diperkuat. Ini dilakukan dengan
membatasi atau meninggalkan salah satu primer. Setelah menipisnya
primer terbatas, sintesis DNA dari untai lainnya berlangsung secara
hitung daripada secara eksponensial seperti pada PCR konvensional.
Namun, membatasi primer juga mengurangi suhu anil yang
mempengaruhi efisiensi reaksi (dihindari menggunakan LATE-PCR).
(Patel et al, 2015)
4. Co-Amplification at Lower Denaturation Temperature (COLD) - PCR
 Alel varian diperkuat dari campuran tipe liar dan DNA yang
mengandung mutasi minoritas. Variasi ini digunakan dalam deteksi
kanker. Metode ini memungkinkan untuk amplifikasi preferensi tingkat
rendah dari DNA bermutasi, sedangkan PCR konvensional memperkuat
semua urutan tanpa pandang bulu (Li et al., 2008).
5. Colony PCR
Sejumlah kecil sel bakteri dari koloni bakteri ditambahkan ke
dalam campuran PCR. Periode anil yang diperpanjang awal atau
langkah denaturasi singkat pada 100 ° C digunakan untuk melepaskan
DNA. Ini dapat digunakan untuk menyaring konstruk vektor DNA yang
benar. Primer vektor juga dapat digunakan. Fragmen DNA target
pertama kali dimasukkan ke dalam vektor kloning dan satu set primer
dirancang untuk area vektor yang mengapit situs penyisipan,
menghasilkan amplifikasi dari urutan yang dimasukkan. (Pavlov et al.,
2006).
6. Digital PCR (dPCR)
Gaya PCR ini memungkinkan kuantifikasi jumlah asam nukleat
yang lebih akurat. Daripada setiap sampel yang mengalami satu reaksi
dan keseluruhan sampel dipantau, sampel dipartisi dan reaksi terjadi di
setiap partisi individu. Dengan asumsi populasi molekul mengikuti
distribusi Poisson, setiap bagian akan mengandung eter '0' atau '1'
molekul, yaitu masing-masing negatif atau positif. Setelah amplifikasi
PCR, asam nukleat dikuantifikasi dengan menghitung jumlah sampel
positif. Tidak seperti PCR konvensional, jumlah siklus amplifikasi adalah
kunci dalam menentukan jumlah awal molekul target. Ini memungkinkan
untuk kuantifikasi absolut dengan menghilangkan ketergantungan pada
data eksponensial. (Patel et al, 2015)
7. High Fidelity PCR
Polymerases yang mengikat target mereka lebih andal
menghasilkan produk yang lebih murni. Ini polimerase kesetiaan tinggi
digunakan untuk polimerase kesetiaan tinggi di mana sampel harus
mengandung produk akhir yang sangat murni. (Patel et al, 2015)
8. Hot Start / cold finish PCR
Polimerase hibrida yang tidak aktif pada suhu sekitar digunakan.
Ini hanya aktif pada suhu yang lebih tinggi untuk mencegah amplifikasi
 non-spesifik pada suhu yang lebih rendah. Pada permulaan panas
hanya PCR, campuran reaksi dapat dipanaskan hingga 95 ° C sebelum
penambahan polimerase untuk alasan yang sama (Chou et al., 1992).
9. InterSequence-Specific (ISSR) – PCR
Primer dari sekuens DNA yang sering diulang (disebut
microsatellites) digunakan untuk menghasilkan sidik jari unik dari
panjang produk yang diperkuat. ISSR-PCR memiliki beragam aplikasi
termasuk mengkarakterisasi keterkaitan genetik antar populasi,
mendeteksi variasi klon, dan untuk mendeteksi ketidakstabilan genom
(Zietkiewicz et al., 1994).
10. Inverse PCR
Teknik ini digunakan untuk memperkuat DNA yang mengelilingi
urutan target. Ini memungkinkan amplifikasi dan pengurutan DNA yang
mengelilingi urutan yang dikenal. Ini melibatkan awalnya menundukkan
DNA target ke serangkaian pencernaan enzim restriksi, dan kemudian
mengedarkan fragmen yang dihasilkan oleh ligasi sendiri. Primer
dirancang untuk diperluas keluar dari segmen yang diketahui,
menghasilkan amplifikasi dari sisa lingkaran. Ini sangat berguna dalam
mengidentifikasi urutan ke kedua sisi dari berbagai sisipan genomik
(Ochman et al., 1988).
11. Linear-After-The-Eksponensial (LATE) – PCR
Ini adalah modifikasi dari PCR asimetris yang menggunakan
primer pembatas dengan suhu leleh yang lebih tinggi daripada primer
berlebih yang memungkinkan sejumlah besar produk dibuat setelah fase
eksponensial PCR. Ini digunakan untuk diagnosis genetik sel tunggal
dan identifikasi agen bio ancaman tinggi, karena lebih efisien dan sangat
spesifik daripada PCR konvensional (Pierce dan Wangh, 2007).
12. Long-PCR
Menggunakan Taq polimerase, amplikon lebih dari 50 kb dapat
dihasilkan (Cheng et al., 1994).
13. Methylation-specific PCR (MSP)
Variasi PCR ini digunakan untuk mendeteksi pola metilasi DNA di
pulau-pulau cytosine-guanine (CpG) dan untuk mengkarakterisasi
keadaan metilasi mereka. Menggunakan natrium bisulfit, basa sitosin
yang tidak termetilasi dikonversi menjadi urasil. Ini untuk membuat titik
 adhesi komplementer untuk adenosin dalam primer PCR. Dua
amplifikasi kemudian dilakukan dengan satu pasangan primer anil ke
DNA dengan sitosin dan yang lainnya ke DNA dengan urasil (Herman et
al., 1996).
14. Multiplex-PCR
Beberapa pasangan primer ke berbagai urutan target digunakan
untuk memungkinkan analisis simultan lebih dari satu urutan minat;
namun ada batasan resolusi (dihindari menggunakan MLPA). Ini
berguna dalam pengujian mutasi genetik dan protokol sidik jari DNA
(Hayden et al., 2008).
15. Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)
Beberapa target dapat diperkuat menggunakan satu set primer.
Probe yang digunakan terdiri dari dua oligonukleotida yang menganil
situs target yang berdekatan pada DNA. Satu probe berisi urutan yang
dikenali oleh primer ke depan pada untai DNA 3 'hingga 5' dan probe
lainnya untuk primer terbalik pada untai 5 'hingga 3'. Setelah kedua
probe menganil masing-masing untai DNA mereka, mereka diikat
menjadi probe lengkap. Ini berarti bahwa oligonukleotida yang tidak
terikat tidak diamplifikasi. Teknik ini digunakan untuk analisis mikrosatelit
dan nukleotida polimorfisme tunggal (Hayden et al., 2008).
16. Nested PCR
Jika pengikatan primer yang tidak diinginkan merupakan masalah,
dua set primer dapat digunakan di mana produk dari satu putaran
replikasi DNA digunakan untuk membuat sekuens target tanpa
kontaminasi DNA yang berdekatan yang tidak menarik. (Patel et al,
2015)
17. Quantitative/Real-Time (q) PCR
Teknik ini digunakan untuk mengukur jumlah DNA target yang
hadir sekaligus memperkuatnya. Untuk melakukan ini, digunakan
pewarna fluoresen non-spesifik atau probe fluoresen DNA
oligonukleotida. Probe mengandung molekul berfluoresensi dan
quencher terikat di kedua ujungnya. Penyelidikan ini mengikat DNA
secara khusus untuk urutan target DNA tetapi molekul pendinginan
menyerap cahaya dari reporter fluorescent. Cahaya dipancarkan saat
eksitasi dengan laser. Ketika replikasi urutan target terjadi, polimerase
 menggunakan aktivitas exonuclease untuk menghapus basis probe
dengan basis. Hal ini menyebabkan reporter fluorescent dipisahkan dari
quencher dan pancaran cahaya dapat dideteksi begitu ambang telah
tercapai. Ini memungkinkan untuk kuantifikasi urutan target (Logan et
al., 2009).
18. Splicing by overlap/overhang extension (SOE) PCR
Modifikasi ini digunakan untuk memasukkan mutasi spesifik pada
titik target secara berurutan atau untuk menyisipkan (splice) dalam
fragmen DNA yang lebih kecil. Untuk memisahkan dua molekul DNA,
primer khusus digunakan dengan urutan yang saling bergantungan yang
saling melengkapi dengan untai yang akan dianil. Hasil yang lebih tinggi
dapat dicapai dengan menggunakan PCR asimetris. (Patel et al, 2015)
19. Thermal Asymmetric InterLaced (TAIL) – PCR
Seperti PCR terbalik, ini adalah metode untuk mengisolasi urutan
yang tidak diketahui mengapit area genom yang diketahui (diurutkan).
Sepasang primer yang bersarang dengan suhu anil yang berbeda
digunakan dalam urutan yang diketahui dan primer 'degenerasi'
digunakan untuk memperkuat ke arah lain dari urutan yang tidak
diketahui (Liu et al., 1995).
20. Touchdown PCR
Suhu anil yang digunakan pada awal reaksi adalah 3-5 ° C lebih
tinggi dari biasanya. Suhu diturunkan dengan setiap siklus dan pada
siklus berikutnya suhu anil adalah 3-5 ° C lebih rendah dari normal.
Suhu anil yang lebih tinggi menyebabkan spesifisitas pengikatan primer
yang lebih besar dalam siklus sebelumnya dan suhu anil yang lebih
rendah memungkinkan amplifikasi yang lebih efisien ketika konsentrasi
primer berkurang (Don et al., 1991).
REFERENSI
Ministry of Health, Nutrition and Indigenous Medicine Sri Lanka. National
Guidelines on Management of Leptospirosis. Epidemiology Unit, Ministry of
Health. 2016
Patel SV, Bosamia TC, Bhalani HN, Singh P, Kumar A. Polymerase Chain
Reaction (PCR). Agrobios. 2015 ; 13 (9) : 10-12
Stemmer WP, Crameri A, Ha KD, Brennan TM, Heyneker HL (1995). Gene 164
(1):49–53.
Li J, Wang L, Mamon H, Kulke MH, Berbeco R, Makrigiorgos GM (2008).
Nature Medicine, 14 (5): 579–84
Pavlov AR, Pavlova NV, Kozyavkin SA, Slesarev AI (2006). In Kieleczawa
J. DNA Sequencing II: Optimizing Preparation and Cleanup. Jones and
Bartlett. pp. 241–257.
Chou Q, Russell M, Birch DE, Raymond J, Bloch W (April 1992). Nucleic Acids
Res. 20 (7): 1717–23.
E. Zietkiewicz, A. Rafalski, and D. Labuda (1994). Genomics20 (2): 176–83.
Ochman H, Gerber AS, Hartl DL (1 November 1988). Genetics 120 (3): 621–
3.
Pierce KE and Wangh LJ (2007). Methods Mol Med. 132: 65–85. Cheng S,
Fockler C, Barnes WM, Higuchi R (1994). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91 (12):
5695–9.
Herman JG, Graff JR, Myöhänen S, Nelkin BD, Baylin SB (1996). Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 93 (18): 9821–6.
Hayden MJ, Nguyen TM, Waterman A, Chalmers KJ (2008). BMC Genomics
9: 80.
Logan J, Edwards K, Saunders N, (2009). Real-Time PCR: Current
Technology and Applications. Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-
39-4.
Liu YG, Whittier RF (1995). Genomics 25 (3): 674–81.
Don RH, Cox PT, Wainwright BJ, Baker K, Mattick JS (1991). Nucleic Acids
Res. 19(14): 4008.