◤

UJI CEMARAN
MIKROBA
 -SPESIFIK
MAPING CONCEPT
ANALISIS SIFAT -BAKTERI MENCARI SUMBER
AIR, TANAH,
UDARA, ALAT,
PERSONIL

-NONSPESIFIK -JAMUR

- TPC, AEROBIC PLATE

MELAKUKAN/MEMILIH
COUNT, ALT
- MPN
UJI BATAS KUANTITASI
KARAKTERISASI/ CEMARAN
IDENTIFIKASI
MEMPERHATIKAN SUBSTANSI ALAT, BAHAN
ANALISIS BAKU, MEDIA,
UJI STERILITAS SEDIAAN

ANALISIS MELIPUTI
MIKROBIOLOGI
UJI EFEKTIVITAS MEMPERHATIKAN
SUBSTANSI ANALISIS OBAT, MAKANAN,
ANTIMIKROBA
BAHAN ALAM, HASIL
FERMENTASI

UJI POTENSI DAN

RASIO POTENSI JENIS,
A.B SPEKTRUM

MENGGUNAKAN METODE MEMERLUKAN

PENGERTIAN RESISTENSI
KONSENTRASI DAN
HAMBATAN MENGHASILKAN DATA -DIFUSI AGAR SENSITIVITAS
MINIMUM -TURBIDIMETRI
(KHM)

SUMBER HARUS MEMPERHATIKAN ANALISIS DATA POLA UJI

KESALAHAN STATISTIK
Uji dan Informasi yang berhubungan dengan Mikrobiologi dalam
◤ Farmakope Indonesia edisi V 2014

▪ <51> Uji Batas Mikroba

▪ <61> Uji Efektivitas Pengawet

▪ <65> Uji Kinerja Resistensi Indikator Biologi

▪ <71> Uji Sterilitas

▪ <81> Desain dan Analisis Penetapan Hayati

▪ <91> Penetapan Aktivitas Vitamin B12

▪ <121> Penetapan Kadar Kalsium Pantotenat

▪ <131> Penetapan Potensi Antibiotik Secara Mikrobiologi

▪ <201> Endotoksin bakteri

▪ <1321> Indikator biologik untuk Sterilisasi

▪ <1352> Praktek Laboratorium Mikrobiologi yang baik

▪ <1371> Sterilisasi dan Jaminan Sterilitas pada Suatu Sediaan

 pendahuluan
◤

▪ Uji Batas Mikroba dilakukan untuk memperkirakan jumlah mikroba aerob

viabel di dalam semua jenis perbekalan farmasi, mulai dari bahan baku
hingga sediaan jadi, untuk mengyatakan perbekalan farmasi tersebut bebas
dari spesies mikroba tertentu.

▪ Otomatisasi dapat digunakan sebagai pengganti uji yang akan disajikan,

dengan ketentuan bahwa cara tersebut sudah divalidasi sedemikian rupa
hingga menunjukkan hasil yang sama atau lebih baik. Selama menyiapkan
dan melaksanakan pengujian, specimen harus ditangani secara aseptik.

▪ Jika tidak dinyatakan lain, jika disebut ”inkubasi”, maka yang dimaksud
adalah menempatkan wadah di dalam ruangan terkendali secara termostatik
pada suhu 30° dan 35° selama 24 jam sampai 48 jam.

▪ Istilah “tumbuh” ditunjukan untuk pengertian adanya dan kemungkinan

adanya perkembangan mikroba viabel.
 ◤
<51> Uji Batas Mikroba

▪ Dilakukan untuk memperkirakan pengujian kuantitatif untuk bakteri mesofil dan kapang
yang (viabel) dapat tumbuh pada kondisi aerob didalam semua jenis perbekalan
farmasi, mulai dari bahan baku hinga sediaan jadi
▪ Untuk menyatakan bahwa perbekalan farmasi tersebut bebas dari spesies mikroba
tertentu
▪ Pengerjaan harus dilakukan secara aseptik

▪ Jika produk mempunyai aktifitas antimikroba sebelum diuji lakukan netralisasi

menggunakan inaktivator yang telah dibuktikan tidak toksik terhadap mikroba yang
diuji.
▪ Metode Penghitungan: Pengujian dilakukan dengan metode Penyaringan Membran
atau salah satu Metode Angka Lempeng yang sesuai. Metode lain adalah Angka Paling
Mungkin (APM) yang umum digunakan untuk produk dengan tingkat kontaminasi
rendah.
syarat mutu manisan pala
 ◤
Uji Pendahuluan
▪ Validasi hasil yang akan disajikan disini dalam banyak hal berdasarkan pada ketentuan yang
menunjukkan bahwa spesimen uji tidak menghambat pertumbuhan mikroba yang terdapat
dalam spesimen itu sendiri.

▪ Jadi sebagai uji pendahuluan dilakukan inokulasi secara terpisah enceran spesimen uji dengan
biakan viabel yang terdiri dari Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, dan Salmonella.

▪ Pengujian dilakukan dengan menambahkan 1 ml dari tidak kurang enceran biakan mikroba
berumur 24 jam kepada enceran pertama spesimen uji (dalam dapar fosfat pH 7,2, Media Fluid
Soybean-Casein Digest atau Media Fluid Lactose Medium dan uji sesuai prosedur.

▪ Jika tidak terdapat pertumbuhan mikroba di media bersangkutan, maka pengujian tersebut
dinyatakan tidak berlaku dan diperlukan modifikasi prosedur dengan (1) meningkatkan volume
pengencer dengan tetap mempertahankan bahan uji, atau (2) menambahkan zat inaktivator
dengan jumlah secukupnya ke dalam pengencer, atau (3) suatu kombinasi modifikasi (1) dan
(2) sedemikian rupa hingga terdapat pertumbuhan inokulum.
 Larutan Dapar dan Media
◤

▪ media biakan dehidrat dapat digunakan jika sudah direkonstitusi sesuai

petunjuk produsen atau distributor memiliki bahan yang sebanding dan/atau
menghasilkan media yang sama dengan media yang menggunakan formula
seperti disebut di bawah ini.

▪ Peda pembuatan media menggunakan formula yang disebut di bawah ini,

larutkan bahan padat yang dapat larut dalam air, jika perlu panaskan hingga
larup sempurna, dan tambahkan larutan asam klorida atau natrium
hidroksida secukupnya hingga diperoleh media dengan pH yang diinginkan,
jika sudah siap digunakan. Tetapkan pH pada suhu 25° ± 2°.

▪ Jika pada formula disebut agar, gunakan agar dengan kadar air tidak lebih
dari 15% dan jika disebut air, gunakan Air Murni.
 ◤
Larutan Dapar Posfat pH 7,2

▪ Larutan 34g kalium posfat monobasa P dalam lebih kurang 500 ml

air dalam labu terukur-1000 ml; tambahkan lebih kurang 175 ml
natrium hidroksida 1 N hingga pH 7,2 ± 0,1. Tambahkan air sampai
tanda, dan campur. Masukkan dalam beberapa wadah dan
sterilkan. Simpan dalam lemari pendingin.

▪ Sebelum digunakan, encerkan 1 bagian larutan dengan 800

bagian air, dan sterilkan.
 ◤
Media

Media PCA (Plate Count Agar)

▪ Yeast 2,5 g
▪ Pancreatic digest of Casein 5 g
▪ Glucose 1 g
▪ Agar 15-20 g
▪ Air Suling 1 L
▪ Sebelum digunakan, sesaat sebelum dituang ke dalam cawan, terhadap media
yang telah meleleh dan didinginkan hingga 45° pH diatur hingga 3,5 ± 0,1
menggunakan larutan asam ladrat P steril (1 dalam 10). Media dengan pH tidak
boleh dipanaskan lagi
 ◤

Media FCDSLP (Fluid Casein Digest-Soy Lecithin-Polysorbate 20 Medium)

▪ Digesti pankreatik kasein P 20 g

▪ Lesitin kedele 5 g

▪ Polisorbat 20 P 40 ml

▪ Air 960 mll

▪ Larutkan Digesti pankreatik kasein P dan Lesitin kedele di dalam tangas air pada suhu 48°
sampai 50° selama lebih kurang 30 menit hingga larut. Tambahkan 40 ml Polisorbat 20 P,
campur dan masukkan dalam wadah sesuai yang dikehendaki.

▪ Jika tidak dinyatakan lain, media harus disterilkan dengan pemanasan dalam otoklaf
(seperti yang tertera pada Sterilitas uap air dalam Sterilitas dan Jaminan Strerilitas Bahan
Konfendia. Waktu paparan tergantung pada volume yang disterilkan.
 ◤
Prosedur
▪ Spesimen yang akan diuji disiapkan sedemikian rupa sesuai
dengan sifat fisiknya dan tidak mengubah jumlah dan jenis mikroba
yang semula ada hingga diperoleh larutan atau suspensi dari
semua atau sebagian spesimen dalam bentuk yang sesuai dengan
prosedur uji yang akan dilaksankan.

▪ Untuk bahan padat yang tidak seluruhnya melarut, perkecil

ukuran bahan hingga merupakan serbuk cukup halus, suspensikan
ke dalam pembawa tertentu, dan lakukan pengujian seperti tertera
pada Angka Mikroba Aerob Total, Uji Staphylococcuc aureus dan
Pseudomonas aeruginosa, Uji Salmonella sp dan Escherichia coli.
▪ Untuk spesimen cair yang terdiri atas larutan, suspense dalam air atau suatu larutan
pembawa◤ hidroalkoholik yang mengandung etanol kurang dari 30%, dan untuk bahan padat
yang mudah larut dan praktis larus sempurna di dalam 90 ml dapar posfat pH 7,2 atau
media tertentu, lakukan pengujian seperti tertera pada Angka Mikroba Aerob Total, Uji
Staphylococcuc aureus dan Pseudomonas aeruginosa, Uji Salmonella sp dan Escherichia
coli.

▪ Untuk cairan tidak campur air/salep, krim dan malam dibuat suatu suspensi dengan
menggunakan emulgator steril yang sesuai dalam jumlah yang minimal (misalnya salah satu
polisorbat), gunakan blender mekanik dan jika perlu hangatkan hingga suhu tidak lebih dari
45° san lanjutkan pengujian seperti tertera pada Angka Mikroba Aerob Total, Uji
Staphylococcuc aureus dan Pseudomonas aeruginosa, Uji Salmonella sp dan Escherichia
coli.

▪ Untuk spesimen cair dalam bentuk aerosol, dinginkan wadah dalam campuran alcohol
dan es kering selama lebih kurang 1 jam, buka tutup wadah dan biarkan hingga mencapai
suhu kamar, dan biarkan propelan terbebas, atau jika memungkinkan hangatkan wadah
untuk mendorong propelan keluar. Pindahkan sejumlah tertentu bahan uji yang diperlukan
untuk pengujian seperti yang tertera pada salah satu dari dua paragraph yang telah
diutarakan sebelumnya. Jika hasil pengujian menggunakan residu. Jika ahasil pengujian
menggunakan tidak dapat disimpulkan atau meragukan, ulangi pengujian dengan
menggunakan 20 wadah atau lebih.
 Penyiapan sampel
Metode penyiapan sampel disesuaikan dgn sifat fisik sediaan yang diuji.
• Sediaan larut air larutan dapar fosfat (LDF) ph 7,2 dapar natrium
klorida-pepton (PH 7,0) 1 dalam 10 bagian
• Sediaan berlemak encerkan dgn isoprofil mistrat, LDF, polisorbat 80 1g/L
= 0,1% bila perlu panaskan 40-45°C
• Cairan, padatan, aerosol penyaringan membran (aseptis)

• Jika tidak dinyatakan lain, “inkubasi” adalah menempatkan wadah di dalam ruang
terkendali secara termostatik pada suhu antara 30 – 35°C selama 24 – 48 jam
• Istilah “tumbuh” ditujukan untuk pengertian adanya dan kemungkinan adanya
perkembangan mikroba viable (FI V, 1344)
 ◤

Jumlah mikroba aerob mesofil dalam suatu produk

-Umumnya tidak selalu terkait dengan bahaya

keamanan
pangan
-Bermanfaat menunjukkan kualitas
-Masa simpan, kontaminasi, dan status higienis pada
saat
proses produksi

Makanan dalam kaleng : ALT anaerob dan ALT aerob

dimaksudkan untuk menunjukkan kontaminasi pasca
proses pengemasan
◤

• Menunjukkan bahan baku yang

Nilai Angka terkontaminasi
Lempeng • Sanitasi yang tidak memadai
Total yang • Proses pengolahan (produksi) yang tidak
tinggi sempurna serta kondisi penyimpanan yang
tidak baik

Nilai ALT
106 -108 • Menunjukkan kemungkinan telah terjadi
mikroorganisme kerusakan atau produk mengalami
per gram dekomposisi.
sampel
 dua metode yang dapat dilakukan
◤
untuk Uji Batas Mikroba

▪ 1. Metode Lempeng

▪ Metode ini dilakukan dengan cara inokulasi sediaan uji

(specimen) dengan berbagai pengenceran pada media
agar tertentu. Setelah inkubasi 48 sampai dengan 72 jam,
pertumbuhan mikroba pada berbagai pengenceran diamati
dan dihitung jumlah koloni yang tumbuh.
P ◤

R ▪ Jika perlu encerkan cairan lebih lanjut sedemikian rupa hingga 1 ml diharapkan
dapat menghasilkan 30 koloni sampai 300 koloni. Pipet 1 ml enceran akhir
O masing-masing ke dalam 2 cawan petri steril.
S ▪ Segera tambahkan ke dalam cawan 15 ml sampai 20 ml Media SCDA yang
D sebelumnya telah dicairkan dan didinginkan hingga lebih kurang 45°.

E ▪ Tutup cawan petri, campur contoh dan agar dengan cara memiringkan atau
memutarnya, dan biarkan isi cawan memadat pada suhu kamar. Balikkan cawan
U dan inkubasi selama 48 jam hingga 72 jam. Setelah inkubasi, amati pertumbuhan
R di dalam lempeng, hitung jumlah koloni, dan dari kedua lempeng nyatakan
rata-rata jumlah mikroba tiap g atau ml spesimen. Jika tidak ditemukan koloni
mikroba di dalam cawan dengan enceran awal (1:10), nyatakan hasil pengujian
sebagai: “kurang dari 10 mikroba per g atau ml spesimen”.
 ◤
▪ 2. Metode Tabung Ganda

▪ Metode ini dilakukan dengan menggunakan

beberapa tabung yang berisi media dan
diinokulasikan dengan sediaan uji (spesimen)
konsentrasi tertentu. Setelah diinkubasikan, amati
adanya pertumbuhan mikroba pada setiap tabung.
Jumlah mikroba yang tumbuh tiap g atau ml
spesimen dihitung dari nilai duga terdekat/MPN
(Most Probable Number) berdasarkan table MPN.
P ▪ Ke dalam setiap tabung dari 14 tabung berukuran sama tambahkan mesing-masing 9,0
◤ FSCD steril.
R ml Media

O ▪ Pisahkan 12 tabung dan bagi dalam 4 kelompok masing-masing terdiri dari 3 tabung.
Satu kelompok sebagai control dan 3 kelompok lain sebagai: kelompok 1 (“100”),
S kelompok 2 (“10”), kelompok 3 (“1”), dan 2 tabung lainnya masing-masing dinyatakan
E sebagai tabung A dan tabung B. Ke dalam masing-masing tabung kelompok 1 (“100”)
D dan tabung A dimasukkan 1ml larutan atau suspensi spesimen dan campur.
U ▪ Dari tabung A dipipet 1 ml ke tabung B, dan campur. Tabung A dan tabung B
R masing-masing akan berisi 100 mg (100 l) dan 10 mg (10 l) spesimen. Ke dalam
masing-masing tabung kelompok 2 (“10”) tambahkan 1 ml dari tabung A, ke dalam
masing-masing tabung kelompok (“1”) tambahkan 1 ml dari tabung B. Buang sisa isi
dari tabung dan inkubasikan.

▪ Setelah diinkubasi, amati adanya pertumbuhan di dalam tabung, ketuga tabung control
akan tetap jernih, dan berdasarkan ada tidaknya pertumbuhan di kelompok 1,
kelompok 2 dan kelompok 3, dan menggunakan acuan pada table, nyatakan Nilai Duga
Terdekat (MPN) mikroba tiap g atau ml spesimen.
◤
Metode Most Probable Number (MPN)

▪ Uji penduga (presumptive test) untuk mengetahui adanya

bakteri yang mampu memfermentasikan laktosa, biasanya
dilakukan inokulasi sampel pada laktosa cair

▪ Uji penguat (Confirment Test) untuk mengetahui adanya

bakterikoliform dengan menumbuhkan bakteri pada media
selectif yaitumedia BGLB brilliant green lactose bile broth

▪ Uji pelengkap (Complate Test) untuk menentukan jenis bakteri

coliform dengan cara identifikasi pada media Uji biokimia KIA,
LIA, SIM, Citrat
 Cara Pengujian

1) Siapkan 3 seri media Lb lactosa Broth dan 9 tabung yg telah dilengkapi tabung durham + LB 10 ml
pada 3 tabung (kel 1), + LB 5 ml pada 3 tabung (kel 2),dan + LB 5 ml pada 3 tabung terkhir (Kel 3)
2) Pipet sampel asli tanpa pengenceran 10 ml pada (kel 1), 1,0 ml pada (kel2) dan 0,1 ml pada (kel 3)
3) Inkubasi pada suhu 37°C selama 24-48 jam
4) Amati jumlah tabung yang positif yaitu keruh dan terdapat gas 1/3 bagian dari tabung durham
5) Dari tabung yang positif diambil 1-2 ose secara aseptis dan masukan dalam media BGLB dengan
tabung durham , inkubasi 24 jam dgn suhu 37°C untuk coliform dan 44°C untuk E Coli, amati
(sama no 4)
6) Hasil pengamatan dirujuk pada table MPN
◤
◤
Ciri Pertumbuhan pada media cair
 ◤
Pencatatan Hasil ALT

Penghitungan dan pencatatan hasil ditulis

dalam dua angka

Angka berikutnya dibulatkan ke bawah bila

< 5 dan dibulatkan ke atas apabila > 5
• Sebagai contoh :
• 523 x 103 dibulatkan menjadi 52 x 104
• 83,6 x 103 dibulatkan menjadi 84 x 103

Hasil dinyatakan dalam tiap gram atau tiap

mL sampel
s