LAPORAN KEGIATAN PPDH

ROTASI DIAGNOSA LABORATORIK MIKROBIOLOGI

Yang dilaksanakan di
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI VETERINER
FAKULTAS KEDONTERAN HEWAN
UNIVERSITAS AIRLANGGA

Oleh :
DARMAWAN DWI P., S.KH
160130100111034

PROGRAM PENDIDIKAN PROFESI DOKTER HEWAN

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2017

i
 DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ......................................................................................... i
DAFTAR ISI ..................................................................................................... ii
DAFTAR TABEL ............................................................................................ v
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... vi
BAGIAN 1. BAKTERI : SALURAN PERNAFASAN
BAB I. PENDAHULUAN ................................................................................ 1
1.1 Latar Belakang ............................................................................................. 1
1.2 Rumusan Masalah ........................................................................................ 2
1.3 Tujuan .......................................................................................................... 2
1.4 Manfaat ........................................................................................................ 2
BAB II TINJAUAN PUSTAKA...................................................................... 4
2.1 Sistem Pernafasan Unggas ........................................................................... 4
2.2 Penyakit Saluran Pernafasan Unggas Akibat Infeksi Bakteri ...................... 4
2.2.1 Fowl cholera ...................................................................................... 5
2.2.2 Infectious coryza ................................................................................ 6
2.2.3 Colibacillosis ..................................................................................... 7
2.2.4 Avian Mikoplasmosis ........................................................................ 8
BAB III METODOLOGI PEMERIKSAAN ................................................. 9
3.1 Tempat dan Waktu Pemeriksaan .................................................................. 9
3.2 Bahan dan Materi Pemeriksaan .................................................................... 9
3.2.1 Sampel Hewan ................................................................................... 9
3.2.2 Bahan Pemeriksaan ............................................................................ 9
3.2.3 Alat Pemeriksaan ............................................................................... 9
3.3 Metode Pemeriksaan .................................................................................. 10
3.3.1 Nekropsi dan Pengambilan Sampel Organ ...................................... 10
3.3.2 Sterilisasi Alat .................................................................................. 11

ii
 3.3.3 Pembuatan Media ............................................................................. 11
3.4 Isolasi dan Identifikasi ............................................................................... 14
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................... 16
4.1 Hasil ........................................................................................................... 16
4.1.1 Sampel Hewan Ayam .............................................................................. 16
4.2 Pembahasan ................................................................................................ 18
4.2.1 Isolasi Primer ...................................................................................... 18
4.2.2 Isolasi Sekunder ................................................................................. 25
4.2.3 Identifikasi .......................................................................................... 28
4.3 Diagnosa..................................................................................................... 34
BAB V. PENUTUP ......................................................................................... 37
5.1 Kesimpulan ................................................................................................ 37
5.2 Saran ........................................................................................................... 37
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 38
BAGIAN 2. VIROLOGI
BAB I. PENDAHULUAN ................................................................................ 1
1.1 Latar Belakang ............................................................................................. 1
1.2 Rumusan Masalah ........................................................................................ 2
1.3 Tujuan .......................................................................................................... 2
1.4 Manfaat ........................................................................................................ 2
BAB II TINJAUAN PUSTAKA...................................................................... 3
2.1 Uji Serologis ................................................................................................ 3
2.1.1 Uji Agar Gel Precipitation (AGP) ....................................................... 3
2.2 Egg Drop Syndrome .................................................................................... 5
2.3 Newcastle Disease (ND) .............................................................................. 6
BAB III METODOLOGI ................................................................................ 7
3.1 Tempat dan Waktu ....................................................................................... 7
3.2 Uji AGP........................................................................................................ 7

iii
 3.2.1 Alat dan Bahan ..................................................................................... 7
3.2.2 Metode .................................................................................................. 8
3.3 Inokulasi Virus pada TAB ........................................................................... 8
3.3.1 Alat dan Bahan ..................................................................................... 8
3.3.2 Metode .................................................................................................. 9
3.4 Uji HI ......................................................................................................... 11
3.4.1 Alat dan Bahan ................................................................................... 11
3.4.2 Metode ................................................................................................ 11
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................... 13
4.1 Uji Agar Gel Precipitation (AGP) ............................................................. 13
4.2 Uji Hemaglutinasi Inhibisi (HI) ................................................................. 14
4.2.1 Hasil Inokulasi Sampel Organ pada TAB (Telur Ayam Berembrio) 14
4.2.2 Identifikasi Virus dengan Uji HA .................................................... 17
4.2.3 Identifikasi Virus dengan Uji HI...................................................... 19
BAB V PENUTUP .......................................................................................... 22
5.1 Kesimpulan ................................................................................................ 22
5.2 Saran ........................................................................................................... 22
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 23

iv
 DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
Bagian 1. Bakteri : Saluran Pernafasan
4.1 Perubahan Makroskopis Patologi Anatomi ................................................ 16
4.2 Media Isolasi dari Sampel Pemeriksaan .................................................... 18
4.3 Hasil Uji Identifikasi .................................................................................. 34
Bagian 2. Virologi
4.1 Lama Kematian TAB ................................................................................. 16

v
 DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

Bagian 1 : Bakteri : Saluran Pernafasan

4.1 Jantung ayam mengalami pericarditis ........................................................ 17
4.2a Hasil Streak pada media MCA ................................................................. 20
4.2b Hasil Pewarnaan isolat bakteri ................................................................. 20
4.3a Hasil streak pada media BA ..................................................................... 22
4.3b Hasil pewarnaan isolat bakteri ................................................................. 22
4.4a Hasil streak pada media TSA ................................................................... 23
4.4b Hasil pewarnaan isolat bakteri ................................................................. 23
4.5a Hasil streak pada media CA ..................................................................... 24
4.5b Hasil pewarnaan isolat bakteri ................................................................. 24
4.6 Koloni hasil pemurnian bakteri pada media MCA .................................... 26
4.7 Uji KOH membentuk lendir ....................................................................... 27
4.8 Hasil pewarnaan gram menunjukkan bakteri batang
garam negatif ................................................................................. 27
4.9 Hasil uji Gula – Gula.................................................................................. 29
4.10 Hasil uji SIM ............................................................................................ 30
4.11 Hasil Uji TSIA ......................................................................................... 31
4.12 Hasil Uji Simmon Sitrat ........................................................................... 32
4.13 Hasil Uji pada media Urea Agar .............................................................. 34
Bagian 2: Virologi
4.1 Tidak adanya garis presipitasi pada uji AGPT ........................................... 13
4.2 Telur ayam berembrio (TAB) .................................................................... 14
4.3 Suspensi sampel gerusan organ ayam ........................................................ 14
4.4 Proses peneropongan TAB......................................................................... 15
4.5 Proses inokulasi virus................................................................................. 15
4.6 Hasil uji HA ............................................................................................... 18
4.7 Hasil Uji HI ................................................................................................ 20

vi
BAGIAN 1: BAKTERI : SALURAN
PERNAFASAN
 BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Usaha peternakan dalam bidang perunggasan, khususnya ayam (broiler,

layer maupun ayam buras) mempunyai nilai ekonomis yang sangat penting
dibandingkan dengan jenis usaha peternakan lainnya. Beberapa alasanya yang
mendasari diantaranya yang pertama adalah jumlah populasi ayam di Indonesia
adalah 80-85 juta ayam layer, 1,2 miliyar ayam broiler dan 295 juta ayam buras.
Sedangkan pembibitan (breeder) memiliki kapasitas produksi anak ayam sehari
(DOC), layer 1,8-2 juta ekor per minggu dan untuk broiler 18-20 juta ekor per
minggu (Naipospos, 2004). Namun, usaha peternakan ini merupakan usaha yang
memiliki resiko tinggi, karena sewaktu-waktu dapat terjadi wabah penyakit
menular. Oleh karena itu, perlunya pengelolaan secara efisien dan profesional.

Menurut Tabbu ( 1996) pengelompokkan penyakit pada unggas berdasarkan

target primernya yaitu penyakit pernafasan, penyakit pencernaan, penyakit yang
mengganggu sistem kekebalan, penyakit yang menganggu produksi telur, penyakit
yang menyebabkan tumor dan penyakit lainnya. Penyakit yang termasuk
menyerang dalam sisitem pernafasan diantaranya adalah : Newcastle Disease (ND),
Avian Influenza (AI), Infectious Bronchitis (IB), Infectious Laryngo-tracheitis
(ILT), Chronic Respiratory Disease (CRD) atau CRD Komplek (CRDK), Infectious
Coryza (Snot) dan Aspergillosis (Shane, 1998), kolera unggas, Swollen Head
Syndrome (SHS) (Tabbu, 1996) dan Koliseptisemia (Sharlton et al., 2000).

Pada peternakan ayam, munculnya berbagai macam penyakit dapat

menyebabkan kerigian ekonomi yang cukup besar. Wabah penyakit menuar yang
sangat ganas merupakan risiko terbesar yang harus dihadapi peternak, seperti
wabah penyakit flu burung (Avian Influenza/AI) yang sebelumnya pernah terjadi di
Indonesia. Menurut Akoso (2004) pada akhir tahun 2003 penyakit AI menyebabkan
kematian 7,4 juta ekor unggas, terdiri dari ayam ras, ayam buras, burung puyuh,
itik, merpati dan unggas lainnya. Kerugian ekonomi (potensial) yang
ditimbulkannya diperkirakan mencapai Rp. 7,7 triliun, meliputi kematian unggas,

1
pengurangan kesempatan kerja, gangguan pada industri perunggasan dan industri
pakan serta terhambatnya ekspor dan produksinya ke luar negeri.

Dalam penanganan kasus penyakit unggas, pertama kali yang harus

dilakukan adalah analisis penyebabnya. Dengan melihat gejala klinik dan
menganalisis gambaran pasca mati dari ayam yang dinekropsi, diharapkan dapat
diketahui penyakitnya. Namun terkadang perubahannya tidak jelas, sehingga
diperlukan pemeriksaan (isolasi dan identifikasi) terhadap agen penyebabnya.
Teknik pengambilan sampel yang baik dan benar harus dikuasai dan dipahami oleh
petugas medik veteriner di lapangan agar tidak salah dalam pengambilan sampel
yang akan dikirim ke laboratorium. Berdasarkan hal tersebut maka perlu dilakukan
pemeriksaan terhadap unggas yang terinfeksi penyakit saluran pernafasan
khususnya yang diakibatkan oleh agen infeksi bateri untuk dilakukan isolasi dan
identifikasi, sehingga dapat diketahui agen penyebab penyakit tersebut.

1.2 Rumusan Masalah

a. Bagaimana cara melakukan isolasi dan identifikasi bakteri dari sampel

hewan unggas yang diduga mengalami gangguan pada saluran pernafasan?
b. Bagaimana cara melakukan diagnosa penyakit saluran pernafasan pada
unggas berdasarkan pemeriksaan gejala klinis dan didukung dengan
pemeriksaan mikrobiologi?

1.3 Tujuan

a. Dapat mengetahui cara isolasi dan identifikasi bakteri dari sampel hewan
unggas yang diduga mengalami gangguan pada saluran pernafasan.
b. Dapat mengetahui cara diagnosa penyakit saluran pernafasan pada unggas
berdasarkan pemeriksaan gejala klinis dan didukung dengan pemeriksaan
mikrobiologi.

1.4 Manfaat

Manfaat yang diharapkan secara khusus adalah mahasiswa PPDH (Program

Profesi Dokter Hewan) dapat meningkatkan kemampuan dalam diagnosa suatu

2
penyakit terutama diagnosa secara labaratorium pada penyakit yang disebabakan
oleh bakteri dan manfaat secara umum adalah dapat dijadikanya sumber referensi
bacaan oleh masyarakat umum.

3
 BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Sistem Pernafasan Unggas

Alat pernafasan unggas terdiri dari tiga komponen penting yaitu saluran
pernafasan (hidung, sinus hidung, trakhea dan bronkhus), paru-paru dan kantong
udara (air sac). Paru-paru unggas sangat sederhana dan kurang elastis dibandingkan
dengan paru-paru hewan mamalia. Oleh karena itu, peranan kantong udara dan otot-
otot di daerah abdomen sangat penting pada saat melakukan inspirasi dan ekspirasi.
Umumnya, unggas memiliki sembilan kantong udara yaitu kantong udara
cervicalis, thoracalis cranialis, thoracalis caudalis, abdominalis (masing-masing
sepasang) dan kantong udara clavicularis (tunggal). Beberapa kantong udara
meluas ke bagian dalam tulang atau ke dalam jaringan subkutan. Kantong udara
merupakan suatu rongga dengan dinding tipis dan halus, sehingga sulit dikenali
sewaktu dalam posisi mengempis. Tetapi jika terjadi infeksi kantong udara,
biasanya mengalami penebalan dan peradangan (air saculitis), sehingga mudah
dideteksi sewaktu nekropsi ayam (Say, 1987).

Apabila ditinjau dari aspek pertahanan tubuh, kantong udara ini merupakan
titik lemah, karena jika udara di luar tercemar oleh debu, bahan kimia tertentu
ataupun bibit penyakit, maka cemaran tersebut akan mudah tersebar di dalam tubuh
ternak. Menurut Ressang (1984) menyatakan bahwa alat pernafasan merupakan
organ tubuh yang mudah terserang penyakit, karena adanya hubungan langsung
antara lubang atau rongga hidung dengan alveoli di dalam paru-paru.

2.2 Penyakit Saluran Pernafasan Unggas Akibat Infeksi Bakteri

Penyakit pada saluran pernafasan adalah komponen penting dari kejadian

penyakit keseluruhan pada unggas. Dalam banyak kasus, penyakit pernafasan yang
diamati dalam kelompok unggas mungkin dapat bersifat multisistemik atau
penyakit yang dominan dialami oleh unggas dengan mempengaruhi sistem organ
lainnya. Dalam beberapa kasus seperti infeksi coryza atau infeksi laryngotracheitis
pada awalnya akan menyerang sistem pernafasan dan berlanjut pada kerusakan
organ lainnya. Berbagai agen patogen yang berperan dalam terjadinya infeksi pada

4
saluran pernafasan unggas antara lain virus, bakteri, dan jamur. Beberapa penyakit
pada saluran pernafasan unggas yang disebabkan oleh bakteri antara lain Fowl
cholera, Infectious coryza, Colibacillosis (Glisson, 1998), dan Avian
Mikoplasmosis (Tabbu, 2000).

2.2.1 Fowl Cholera

Kholera unggas atau fowl cholera disebabkan oleh infeksi Pasteurela

multocida dikenal sejak lebih seratus tahun yang lampau. Pertama kali dilaporkan
terjadi wabah menyerang ayam di neara-negara di Eropa tahun 1728 dan di Amerika
Serikat tahun 1867 (Layton, 1984). Semua serogroup P. Multocida, kecuali group
E dapat diisolasi dari berbagai jenis unggas (Rhoades et al., 1989), akan tetapi yang
sering menginfeksi pada unggas ialah serogroup A (Rimler dan Rhoades, 1987).
Manifestasi gejala klinis akibat infeksi P. Multocida pada unggas yang akut ialah
septisemia dengan koagulasi darah intravascular, hemoragik petechial, multivocal
hepatik, splenik nekrosis, dan fibronous pneumonia. Infeksi yang bersifat kronis
pada itik menunjukkan adanya lokalisasi fibrino purulen (nanah) atau nekrosis pada
beberapa bagian organ diantaranya di daerah kepala/sinus hidung, kantong hawa,
paru, jengger, telapak kaki, tulang dan persendian. Dari unggas dengan gejala klinis
kronis tersebut dapat diisolasi P. Multocida (Supar et al., 2000).

Kholera unggas disebabakan oleh Pasteurella mutocida yang merupakan

bakteri gram-negatif, non-motil, tidak membentuk spora dan berbentuk batang
tunggal, berpasangan atau kadang sebagai cincin atau filamen. Organisme ini
terwarnai bipolar dan dapat tumbuh secara aerob maupun anaerob. Berdasarkan
atas bentuk koloni dari Pasteurella multocida, dikenal 3 galur, yaitu koloni yang
halus dan terkapsulasi (sangat virulen), koloni mukoid ( moderat virulen), dan
koloni yang kasar dan terkapsulasi (kurang virulen), yang menyebabkan infeksi
kronis/ pasteurellosis lokal. Disamping itu, terdapat juga galur tidak virulen, yang
bersifat tidak patogenik. Pasteurella multocida tahan hidup di dalam tanah, litter
(alas kandang) atau bahan-bahan yang membusuk selama beberapa bulan.
Walaupun demikian, bakteri ini dapat dibunuh dengan mudah oleh berbagai
desinfektan, kekeringan, dan sinar matahari langsung. Kuman ini dapat dibunuh

5
pada temperatur 56oC selama 15 menit dan temperatur 60oC selama 10 menit.
Larutan 1% formalin, fenol, NaOH, beta-propiolakton atau glutaraldehida dan
larutan 0,1% benzalkonium klorida dapat membunuh sekitar 440 juta kuman
Pasteurella multocida dalam waktu 5 menit pada temperatur 240C (Tabbu, 2000).

2.2.2 Infectious coryza

Penyakit yang diberi nama Bacillus Haemoglobinophilus coryza gallinarum

ini pertama kali ditemukan oleh De Blieck, seorang peneliti Belanda pada tahun
1931-1932. Nama bakteri yang semula Haemoglobinophilus coryza gallinarum
diganti menjadi Haemophilus gallinarum atas usulan peneliti dari Amerika (Eliot
dan Lewis). Bakteri Haemophillus gallinarum diduga memerlukan hemin (faktor
x) dan nocotinamide adenine denucleotide/NAD (faktor v) untuk pertumbuhannya
dan hanya memerlukan faktor v (NAD) untuk menginfeksi penyakit coryza pada
unggas. pertumbuhan invtro pada bakteri ini hanya memerlukan nocotinamide
adenine denucleotide/NAD (faktor v) untuk menginfeksinya. Bakteri Haemophillus
penyebab infeksi coryza pada unggas selain ayam yang memerlukan NAD dan
hemin untuk pertumbuhan invitro dinamakan Haemophillus Paragallinarum (Reid
dan Blackall, 1984). Bakteri ini merupakan bakteri gram negatif, berbentuk batang
pendek atau cocobacilli, terwarnai polar, non-motil, tidak membentuk spora,
fakultatif anaerob dan membutuhkan faktor-v untuk bisa menyebabkan penyakit
pada unggas. organisme ini merupakan organisme yang mudah mati atau
mengalami inaktivasi secara cepat diluar tubuh hospes. Penyakit ini dapat
menyerang ayam kampung, ayam petelur dan ayam pedaging serta sangat mudah
menular dari satu ayam ke ayam yang lain dalam satu kandang (Tabbu, 2000).

Masa inkubasi penyakit ini terjadi antara 1-3 hari, dengan perjalanan
penyakit dapat mencapai 1-3 minggu. Berdasarkan kejadian di dalapangan angka
kematian sangat rendah antara 0-5%, tetapi angka kesakitan dapat mencapai 30-
40% dan sangat berpeluang menyebabakan penurunan produksi telur hingga 10-
50%. Eksudat infeksius yang tercampur dengan air minum dalam kandang akan
mengaami inaktivasi dalam waktu 4 jam pada temperatur yang fluktuatif. Eksudat
pada temperatur 37, bahkan kadang-kadang dapat sampai 48 jam sehingga

6
penyebaran tergolong cepat terutama pada peternakan dengan sistem sanitasi dan
biosecurity yang kurang baik (Tabbu, 2000).

2.2.3 Colibacillosis

Colibacillosis adalah penyakit pada hewan, terutama menyerang hewan

muda, disebabkan oleh bakteri Escherichia coli (E.coli). Pada unggas, infeksi E.coli
dapat menyebabkan penyakit seperti omphalitis, air sacculitis, peritonitis dan
salphingitis. E.coli tergolong Gram positif, tidak tahan asam, motil, memfermentasi
laktosa, merupakan basil yang tidak membentuk spora, berbentuk batang dengan
ukuran 0,5x1,0-3,0 mikrometer. Serotipe-serotipe yang biasa menyerang ayam: O
I, K I, 02, K1, K I dan 078, K8. E.coli mudah ditumbuhkan pada berbagai media
laboratorium. Biakan di atas media pada umur muda berbentuk granular halus
(dengan diameter 1-3 mm) yang menjadi kasar bila umur biakan menjadi bertambah
tua. Pada medium agar Mac Conkey pertumbuhan E.coli berwarna merah dadu.
Dalam media cair pertumbuhannya ditandai dengan kekeruhan dan adanya endapan
dibagian bawah tabung. Bakteri ini dapat tumbuh pada berbagai media yang lazim
digunakan untuk mengisolasi bakteri dan membutuhkan temperatur 18-44oC atau
lebih rendah (Pudjiatmoko, 2014).

Bakteri E.coli dapat menyebabkan penyakit primer pada ayam, tetapi dapat
juga bersifat sekunder mengikuti penyakit lainnya, misalnya berbagai penyakit
pernafasan dan pencernaan. Kolibasilosis pada ayam telah dilaporkan dari berbagai
negara di dunia. Di Indonesia, penyakit ini dapat ditemukan pada berbagai
peternakan di berbagai daerah pada ayam pedaging maupun petelur pada semua
kelompok umur. Di lapangan timbulnya kolibasilosis terutama akibat pengaruh
iminosupresif dari Gumboro dan sebagai penyakit ikutan pada Chronic respiratory
disease (CRD), infectious coryza (snot), swollen head syndrome (SHS), Infectious
laryngotracheitis (ILT) dan koksidiosis. Faktor pendukung timbulnya kolibasilosis,
meliputi sanitasi/desinfeksi yang suboptimal, sumber air minum yang tercemar oleh
bakteri, sistem perkandangan dan peralatan kandang yang kurang memadai, dan
adanya berbagai penyakit yang bersifat imunosupresif seperti Gumboro (Tabbu,
2000).

7
2.2.4 Avian Mikoplasmosis

Infeksi Mycoplasma gallisepticum lebih dikenal dengan nama chronic

respiratory disease (CRD), merupakan penyakit pada ayam, yang ditemukan pada
semua kelompok umur. Infeksi Mycoplasma gallisepticum juga menyebabakan
infectious sinusitis pada kalkun. Manifestasi klinik penyakit ini biasanya
berlangsung lambat, tetapi proses penyakitnya berlangsung lama. Penyakit pada
kantong udara yang disebut dengan airsacculitis merupakan infeksi cempuran
antara Mycoplasma gallisepticum dengan beberapa virus pada saluran pernafasan
dan Escherichia coli (Tabbu, 2000).

Mycoplasma gallisepticum dpat diwarnai dengan Giemsa dan bersifat gram-

negatif lemah. Organisme ini umumna berbentuk cocoid dengan ukuran 0,25-0,5
µm. untuk mengisolasi Mycoplasma gallisepticum dibutuhkan suatu perbenihan
buatan yang diperkaya dengan 10%-20% seru. Organisme ini dapat dibiakkan
dalam bagian yolk atau alantois telur ayam bertunas dan dapat hidup dalam waktu
yang lama dalam cairan yolk atau allanto amnion yang dibekukan. Mycoplasma
gallisepticum dapat hidup di dalam feses selama 1 -3 hari pada temperatur 20oC,
dapat hidup di dalam kuning telur selama 18 minggu pada temeratur 37 oC atau
selama 6 minggu pada temperatur 20oC. Di dalam cairan allantois, organisme ini
tetap infektif selama 4 hari di dalam inkubator, 6 hari pad atemperatur kamar dan
32-60 hari di dalam lemari es. Mycoplasma gallisepticum akan mengalami
inaktivasi di dalam telur tetas yang terinfeksi, jika telur tersebut dipanaskan pada
temperatur 45,6oC selama 12 – 14 jam (Tabbu, 2000).

8
 BAB III METODE PEMERIKSAAN

3.1 Tempat dan Waktu Pemeriksaan

Pemeriksaan ini dilakukan di Laboratorium Bakteriologi dan Mikologi
Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga selama delapan hari mulai
tanggal 27 Januari – 3 Februari 2017.

3.2 Bahan dan Materi Pemeriksaan

3.2.1 Sampel Hewan

Pemeriksaan ini menggunakan sampel hewan ayam buras jenis kelamin
jantan berumur sekitar 5 bulan yang didapatkan dari peternakan ayam di Blitar.

3.2.2 Bahan Pemeriksaan

Sampel pemeriksaan berupa organ sistem pernafasan pada ayam untuk
mendiagnosa penyakit pada saluran pernafasan unggas. Sampel pemeriksaan yang
digunakan berupa swab discarge nasal, gerusan organ pangkal trakea (laring dan
faring), jantung dan hati dari ayam buras. Bahan yang digunakan untuk isolasi
meliputi media Blood Agar (BA), Trypticase Soy Agar (TSA), MacConkey Agar
(MCA), Chocolate Agar (CA) darah kelinci, antikoagulan (sitrat), larutan gula-gula
(manitol, sukrosa, glukosa, laktosa, dan maltose), Simon Sitrat Agar, Triple Sugar
Iron Agar (TSIA), Urea Agar, Sulfit Indol Motility Agar (SIM), aquades steril,
spiritus dan alkohol 70%. Bahan identifikasi biokimia meliputi Hydrogen peroksida
(H2O2), Gentian violet, kalium hidroksida (KOH), Kloroform dan reagen kovacs.
Bahan pewarnaan Gram (kristal violet, lugol, alkohol aseton, safranin), tap water
dan minyak emersi.

3.2.3 Alat Pemeriksaan

Alat yang digunakan untuk isolasi dan identifikasi bakteri penyebab
pernafasan antara lain autoclave, inkubator, cawan petri, tabung reaksi, tabung
durham, erlenmeyer, refrigerator, timbangan mikro, inoculating loop terdiri dari
ose bulat dan ose lurus, mikroskop, bunsen, pemanas, rak tabung reaksi, object
glass, aluminium foil, spuit, botol pewarnaan gram, dissecting set, nampan cawan

9
petri, bak pewarnaan, timer, kertas bungkus sterilisasi, plastik tahan panas, cotton
bud steril, spidol marker, kertas label, alat tulis, kapas, tissue, masker, gloves dan
korek api.
3.3 Metode Pemeriksaan

3.3.1 Nekropsi dan Pengambilan Sampel Organ

1. Unggas masih dalam keadaan hidup, diperiksa tubuh bagian luar dan
diamati gejala klinis.
2. Eutanasi pada unggas dilakukan dengan cara emboli udara melalui foramen
magnum.
3. Diamati warna pial dan cuping telinga. Diperhatikan adanya diare, leleran
dari paru, nares dan mata serta kemungkinan adanya kebengkakan dan
perubahan warna daerah fascia. Dilakukan pengambilan swab discharge
nasal kemudian diletakkan dalam tabung reaksi yang telah diberi aquades
steril.
4. Bangkai dibasahi dengan air yang dicampur sabun, untuk menghindari bulu
tidak berterbangan, hal ini dilakukan untuk mengurangi kontaminasi.
5. Bangkai dibaringkan pada bagian dorsal dan dibuat irisan pada kulit di
bagian medial paha dan abdomen pada kedua sisi tubuh.
6. Paha ditarik ke bagian lateral dan diteruskan irisan dengan pisau sampai
persendian coxo femoralis.
7. Dilakukan irisan kulit pada bagian medial dari kaki atau paha dan diperiksa
otot dan persendian.
8. Dilakukan pengirisan melintang pada kulit daerah abdomen, selanjutnya
kulit ditarik ke bagian anterior dan irisan tersebut diteruskan ke daerah
thorax sampai mandibula. Irisan pada kulit juga diteruskan ke bagian
posterior di daerah abdomen.
9. Pemotongan dan menyingkirkan bagian dada sehingga tampak organ dalam,
selanjutnya diamati letak organ, adanya cairan pada rongga perut/
peritoneum dan rongga dada.

10
 10. Dilakukan pengambilan sampel organ (pangkal trachea, hepar dan jantung)
secara aseptis, yaitu dengan memanaskan alat pemotong dengan bunsen
untuk ditempelkan pada permukaan organ hepar dan jantung.

3.3.2 Seterilisasi Alat

Sterilisasi bertujuan untuk membunuh semua organisme, termasuk spora.
Kegiatan isolasi dan identifikasi penyakit ini menggunakan autoclave untuk
melakukan sterilisasi. Sterilisasi dengan panas dalam bentuk uap jenuh bertekanan
merupakan sarana paling praktis. Uap bertekanan memberikan suhu jauh di atas
titik didih dan mempunyai beberapa keuntungan seperti : pemanasan dapat
berlangsung cepat, mempunyai daya tembus dan menghasilkan kelembaban yang
tinggi sehingga mempermudah koagulasi protein sel-sel mikroba. Suhu yang
digunakan pada sterilisasi menggunakan autoclave adalah 250oF (121oC) dengan
tekanan sebesar 15 lb/in2 (5 kg/cm2) selama 15 menit (Rosilawati dkk., 2010).

3.3.3 Pembuatan Media

Blood Agar (BA)
 Media BA ditimbang sesuai kebutuhan dan dilarutkan ke dalam
aquades lalu di didihkan.
 Setelah itu dilakukan streilisasi pada media dengan menggunakan
autoclave dengan suhu 121oC selama 15 menit.
 Kemudian ditambahkan dengan darah kelinci 7% (5 – 10%) pada suhu
40 – 45oC dan dihomogenkan.
 Media dituangkan ke dalam petri dish steril ditunggu hingga memadat.
 Setelah itu dilakukan uji sterilitas dengan cara diinkubasi pada suhu
37oC selama 18-24 jam.

Chocolate Agar (CA)

 Media BA ditimbang sesuai kebutuhan dan dilarutkan ke dalam
aquades lalu di didihkan.
 Setelah itu dilakukan streilisasi pada media dengan menggunakan
autoclave dengan suhu 121oC selama 15 menit.

11
  Kemudian ditambahkan dengan darah kelinci 7% (5 – 10%) pada suhu
85oC dan dihomogenkan.
 Media dituangkan ke dalam petri dish steril ditunggu hingga memadat.
 Setelah itu dilakukan uji sterilitas dengan cara diinkubasi pada suhu
37oC selama 18-24 jam
Trypticase Soy Agar (TSA)
 Media TSA ditimbang sesuai kebutuhan dan dilarutkan ke dalam aquades
steril, dihomogenkan diatas pemanas hingga larutan jernih.
 Media disterilkan dengan menggunakan autoclave pada suhu 121oC
selama 15 menit.
 Media dituang ke dalam cawan petri steril ditunggu hingga memadat dan
dilabel.
 Setelah padat, dilakukan uji sterilitas dengan cara diinkubasikan di
inkubator pada suhu 37oC selama 18-24 jam.

MacConkey Agar (MCA)

 Menimbang media sesuai kebutuhan, dimasukkan dalan erlenmeyer steril.
 Dilarutkan dengan aquades steril kemudian dihomogenkan diatas pemanas
hingga larutan menjadi jernih.
 Dilakukan strerilisasi pada media dengan menggunakan autoclave pada
suhu 121oC selama 15 menit.
 Media dituangkan ke dalam cawan petri steril ditunggu hingga memadat
dan dilabel.
 Dilakukan uji sterilitas dengan cara diinkubasi pada suhu 37oC selama 18-
24 jam.
Gula – gula
- Ditimbang pepton dan ditambahkan aquadest untuk membuat larutan
pepton dan dihomogenkan
- Panaskan larutan pepton sampai mendidih

12
 - Sterilkan larutan peptop menggunakan autoclave pada suhu 121oC selama
15 menit.
- Dalam 100 ml larutan peptop steril tambahakan masing – masing 2 gram
glukosa, manitol, laktosa, sukrosa dan maltosa.
- Ditambahkan 1,5 ml methyl red.
- Dimasukkan dalam tabung reaksi yang terdapat tabung durham
didalamnya sebanyak 5 ml.

Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

- Ditimbang serbuk TSIA dan dilarutkan dalam aquades

- Didihkan hingga terlarut sempurna
- Disterilkan pada suhu 1210C selama 15 menit menggunakan autoclave
- Setelah suhu menurun (± 500C) dituang dalam tabung dan dimiringkan
sedemikian rupa (dengan sudut ± 450)

Urea Agar

- Ditimbang serbuk urea dan dilarutkan dalam aquades

- Dibiarkan selama 15 menit
- Didihkan kemudian disterilkan pada suhu 1210C selama 15 menit
menggunakan autoclave
- Setelah suhu menurun (± 500C) ditambahkan 5 ml urea cair 40% (SR20)
dan dicampur
- Dituangkan ke dalam tabung reaksi dan dimiringkan sedemikian rupa
(dengan sudut kemiringan 250)

Simon Citrat Agar

- Ditimbang serbuk simon citrat dan dilarutkan dalam aquades

- Dibiarkan selama 15 menit
- Didihkan hingga terlarut sempurna, kemudian disterilkan pada suhu 1210C
selama 15 menit menggunakan autoclave
- Dituangkan kedalam tabung reaksi dan dimiringkan sedemikian rupa
(dengan sudut kemiringan 250)

13
Sulphide Indol Motility (SIM)

- Ditimbang serbuk SIM dan dilarutkan dalam aquades

- Dibiarkan selama 15 menit
- Didihkan hingga terlarut sempurna, kemudian disterilkan pada suhu 1210C
selama 15 menit menggunakan autoclave
- Dituangkan ke dalam tabung reaksi

3.4 Isolasi dan Identifikasi

Pemeriksaan bakteriologis berupa sampel swab nasal, gerusan organ paru-
paru, hepar dan jantung dari ayam kampung dan burung merpati. Isolasi bakteri
pada organ hepar, jantung dan pangkal trakhea dilakukan penanaman sampel pada
media TSA (Trypcase Soy Agar), Blood Agar (BA). Sedangkan isolasi bakteri dari
organ hepar ayam dilakukan penanaman pada MacConkey Agar (MCA) untuk
melihat adanya infeksi sekunder E.coli pada hepar. Isolasi bakteri dari sampel swab
nasal dilakukan penanaman pada media pada Chocolate Agar (CA). Media yang
digunakan untuk penanaman bakteri diinkubasikan 37o C selama 24 jam guna
mengetahui sifat, jenis dan tipe koloni yang tumbuh. Selanjutnya dilakukan
pewarnaan gram lalu diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x.
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan untuk mengetahui bentuk, ukuran,
susunan dan warna bakteri yang tumbuh, sehingga perlu dilakukan pewarnaan.
Pada pemeriksaan ini dilakukan pewarnaan Gram untuk membedakan bakteri gram
positif (+) atau negatif (-).
Metode pewarnaan Gram dilakukan dengan membuat preparat ulas koloni
dan media, kemudian difiksasi hingga kering. Ditambahkan gentian violet,
diamkan selama 5-10 menit Dibilas dengan air yang mengalir. Ditambahkan lugol
dan diamkan selama 2 menit. Dicuci dengan air mengalir kemudian ditetesi alkohol
aseton selama 5-10 detik. Dibilas dengan air. Setelah itu ditetesi safranin selama
10-30 detik kemudian cuci dengan air mengalir. Peparat dikeringkan dengan tissue
lalu diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000 x dan tambahkan
dengan minyak emersi.

14
 Koloni yang tumbuh pada media dilakukan isolasi sekunder untuk pemurnian
koloni dan identifikasi dengan pewarnaan Gram, untuk mengetahui sifat Gram dan
morfologi secara mikroskopis. Selanjutnya koloni yang didapat dilakuan
identifikasi dengan uji katalase dan uji Gram dengan KOH.
Uji katalase dilakukan dengan cara meneteskan larutan H2O2 3% pada objek
glass. Diambil koloni bakteri dengan ose dan didiamkan dengan larutan H2O2 3%
Diamati, apabila timbul gelembung maka reaksi positif (+) jika tidak reaksi negatif
(-). Reaksi negatif menunjukan bahwa koloni tersebut termasuk genus Diplococcus
sp. Reaksi positif menunjukan bahwa koloni tersebut termasuk genus Bassilus sp.
Uji gram dilakukan dengan cara meneteskan larutan KOH 3% pada objek
glass. Diambil koloni bakteri dengan ose dan dihomogenkan dengan larutan H2O2
3% Diamati, apabila timbul gelembung maka reaksi positif (+) jika tidak reaksi
negatif (-). Reaksi positif menunjukan bahwa koloni tersebut termasuk genus
Diplococcus sp.

15
 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 HASIL

4.1.1 Sampel Hewan Ayam

a. Signalement
Jenis Hewan : Ayam
Ras : Gallus domestica
Asal Hewan : Peternakan di Blitar
Jenis Kelamin : Jantan
Usia : ± 20 minggu
Berat badan : ± 0,5 kg
b. Anamnesa
Berdasarkan pemilik, nafsu makan ayam berkurang lebih dari 3 hari,
memisah dari kelompok ayam yang lain. Tampak lemas, kurus dan pada
awalnya beberapa ayam yang lain dan ayam yang sakit ini mengalami
bersin, keluar leleran dari hidung.
c. Temuan klinis
Berdasarkan anamnesa dari pemilik, diakukan pemeriksaan fisik,
didapatkan ayam mengalami pembengkakan pada daerah wajah sampai
daerah pial. Ayam mengalami kesulitan saat bernafas dengan ditandai
sesekali ayam menengadahkan kepala keaats dan membuka mulut untuk
mengambil udara.pada daerah kloaka terlihat kotor. Pertautan massa otot
pada ayam jelek, dengan terlihatnya os sternum pada ayam. Pertumbuhan
bulu ayam jelek dan bulu kusam.
Tabel 4.1 Perubahan Makroskopis Patologi Anatomi
No. Organ N/AN Perubahan
1. Mata AN Bengkak pada area konjungtiva
2. Hidung AN Keluar leleran dari sinus nasal
3. Mulut N -
4. Kepala AN Bengkak pada area kepala

16
 5. Trakea N -
6. Pulmo N -
7. Jantung AN Tampak selaput jantung
(perikardium) mengalami
radang (perikarditis)
8. Hepar AN Radang pada area tepi hepar
9. Air sac AN Pada daerah thoracalis cranialis
sedikit keruh
Keterangan :

N : Normal AN: Abnormal

Gambar 4.1 Jantung ayam mengalami pericarditis

d. Diagnosa Banding
Cronic Respiratory Disease, Fowl Cholera
e. Pemeriksaan penunjang
Pemeriksaan penunjang yang dilakukan adalah dengan melakukan
bedah bangkai, dan pemeriksaan mikrobiologi pada organ pangkal trakea,
jantung dan hepar serta dilakukan swab pada daerah sinus nasal.

17
 Tabel 4.2 Media Isolasi dari Sampel Pemeriksaan

No. Sampel Media Isolasi

1. Swab nasal discharge CA
2. Gerusan Pangkal Trakea BA, TSA
3, Gerusan Hepar BA, TSA
4. Gerusan Jantung BA, TSA, MCA
Keterangan :

MCA : Mac Conkey Agar

BA : Blood Agar
TSA : Tryptic Soy Agar
CA : Chocolate Agar

4.2 PEMBAHASAN
4.2.1 Isolasi Primer

Isolasi mikroorganisme merupakan upaya pembiakkan suatu jenis

mikroorganisme tertentu yang diperoleh dari suatu sampel di dalam suatu media
yang spesifik, sehingga selanjutnya dapat dilakukan identifikasi dan konfirmasi.
Media spesifik merupakan media yang digunakan untuk mendiagnosis atau
menganalisis metabolisme suatu mikroorganisme. Setiap mikroorganisme memiliki
kebutuhan akan zat pertumbuhan yang spesifik sehingga hal ini dapat dijadikan
acuan dalam pemilihan media untuk isolasi, identifikasi dan konfirmasi (Pelczar,
2006).
Pada umumnya media yang digunakan untuk membiakkan mikroorganisme
mengandung; air, protein, karbohidrat, sumber karbon, nitrogen, sulfur, fosfat,
oksigen, hidrogen, asam amino dan vitamin. Suatu media yang memenuhi
kebutuhan mikroorganisme untuk bertahan hidup dan melakukan aktivitasnya
secara normal diperlukan untuk melakukan isolasi jenis mikroorganisme tertentu.
Setiap media spesifik memiliki kandungan senyawa tertentu yang dapat mendukung
pertumbuhan mikroorganisme tertentu tetapi menghambat pertumbuhan
mikroorganisme lainnya (Lay, 1994). Dalam hal ini, media yang digunakan untuk

18
mengisolasi mikroorganisme tertentu dari sampel gerusan organ ayam adalah media
MCA, BA, CA dan TSA. Berikut adalah hasil pemeriksaan isolat mikrooganisme
pada beberapa media tersebut;
a. Media Mac Conkey Agar (MCA)
Mac Conkey Agar (MCA) adalah salah satu jenis media padat yang
digunakan untuk identifikasi mikroorganisme. Mac Conkey Agar (MCA)
termasuk dalam media selektif dan diferensial bagi bakteri. Jenis bakteri tertentu
akan membentuk koloni dengan ciri tertentu yang khas apabila ditumbuhkan
pada media ini. Mac Conkey Agar (MCA) merupakan media selektif untuk
isolasi dan identifikasi bakteri gram negatif. Media ini digunakan untuk
membedakan bakteri yang memfermentasi laktosa dan yang tidak
memfermentasi laktosa. Media ini mengadung agar, peptone, laktosa, garam
empedu, sodium chloride, dan neutral red sebagai indikator warna. Media ini
akan menghambat pertumbuhan bakteri gram positif dengan adanya garam
empedu yang akan membentuk kristal violet. Bakteri gram negatif yang tumbuh
dapat dibedakan dalam kemampuannya memfermentasikan laktosa. Koloni
bakteri yang memfermentasikan laktosa berwarna merah bata dan dapat
dikelilingi oleh endapan garam empedu. Endapan ini disebabkan oleh
penguraian laktosa menjadi asam yang akan bereaksi dengan garam empedu.
Bakteri yang tidak memfermentasikan laktosa biasanya bersifat patogen.
Golongan bakteri ini tidak memperlihatkan perubahan pada media. Hal ini
berarti warna koloninya sama dengan warna media. Warna koloni dapat dilihat
pada bagian koloni yang terpisah (Lay, 1994).
Hasil pemeriksaan pada media MCA menunjukkan bahwa isolat bakteri
yang tumbuh berwarna merah bata, dengan koloni kecil hingga besar dan
beberapa ada yang mucoid (Gambar 4.2a). Sesuai dengan fungsinya, media
MCA digunakan untuk membedakan bakteri yang mampu memfermentasi
laktosa dengan bakteri yang tidak mampu memfermentasi laktosa. Bakteri yang
dapat tumbuh pada media ini antara lain Pseudomonas, Salmonella, E.coli,
Enterobacter, Klebsiella dan Shigella. Menurut Luis et al (2004), koloni
Pseudomonas, Salmonella dan Shigella yang tumbuh di media ini cirinya halus

19
 dan tak berwarna karena tidak mampu memfermentasi laktosa. Sedangkan
koloni E.coli, Klebsiella dan Enterobacter gram negatif akan memproduksi
asam dan berwarna merah bata karena mempunyai keistimewaan dapat
memfermentasi laktosa. Beberapa jenis bakteri seperti Klebsiella dan
Enterobacter dapat memproduksi mucoid sehingga tampak lembab. Hal ini
terjadi karena bakteri membentuk kapsul melalui metabolisme kandungan
laktosa di dalam media. Anderson (2013) juga menambahkan, kemampuan
bakteri E.coli dalam memfermentasi laktosa menyebabkan terjadinya penurunan
pH, sehingga mempermudah absorbsi neutral red untuk mengubah koloni
menjadi merah bata. Berdasarkan hasil pemeriksaan mikroskop dengan
pewarnaan gram, didapatkan hasil bakteri berbentuk kokobasil (batang pendek)
bersifat Gram negatif maka diduga bakteri tersebut adalah Escherichia coli
(Gambar 4.2b) Sehingga untuk mengetahui secara pasti jenis bakteri yang
tumbuh pada media isolasi maka perlu dilakukan pemurnian.

Gambar 4.2a Hasil streak Gambar 4.2b Hasil pewarnaan

pada media MCA isolat bakteri
Sumber: Dokumentasi pribadi Sumber: Dokumentasi pribadi

b. Media Blood Agar (BA)

Blood Agar (BA) merupakan media padat dan media diferensial. Media
diferensial adalah media yang ditambah zat kimia tertentu sehingga suatu
mikroorganisme membentuk pertumbuhan untuk mengklasifikasikan suatu
kelompok jenis bakteri. Media ini dapat membedakan bakteri patogen
berdasarkan efek exotoksin hemolitik bakteri terhadap eritrosit. Media Blood
Agar (BA) juga bukan termasuk jenis media selektif karena semua jenis bakteri
dapat tumbuh pada media ini. Komposisi Blood Agar (BA) yaitu mengandung

20
trypton, soy peptone, sodium khloride, lithium khloride, magnesium sulphate,
agar dan eritrosit domba/kelinci (Madigan dan Martinko, 2005).
Blood Agar (BA) digunakan untuk membedakan bakteri hemolitik dan
nonhemolitik yaitu berdasarkan kemampuan bakteri tersebut untuk melisiskan
sel-sel darah merah. Ada tiga jenis hemolisis yaitu beta hemolisis, alfa hemolisis,
dan gamma hemolisis. Beta hemolisis merupakan lisis lengkap sel darah merah
dan hemoglobin sehingga bakteri pada media berwarna kehijauan. Alfa
hemolisis mengacu pada lisis parsial/lisis sebagian dari sel darah merah dan
hemoglobin sehingga bakteri pada media berwarna kecoklatan. Hal ini
menghasilkan perubahan warna disekitar menjadi abu-abu kehijauan. Gamma
hemolisis yaitu tidak terjadi hemolisis dimana tidak ada perubahan warna dalam
media (Lay, 1994).
Hasil streak sampel pada media BA menunjukkan bahwa terdapat koloni
bakteri yang tumbuh berwarna putih kekuningan, dengan koloni kecil hingga
besar, beberapa koloni tampak mucoid dan terdapat koloni yang mampu
menghemolisis media serta adanya koloni yang berwarna putih mengkilat yang
sedikit bening (Gambar 4.3a). Pada hasil penanaman sampel ini didapatkan dua
koloni bakteri. Golongan bakteri yang dapat tumbuh pada media ini antara lain
Pasteurella, Klebsiella, Streptococcus, Staphylococcus, Enterococcus, Listeria,
Clostridium, E.coli dan Bacillus (Luis et al, 2004). Menurut Madigan dan
Martinko (2005), beberapa jenis bakteri yang mampu menghemolisis media dan
menyebabkan perubahan warna pada media menjadi kehijauan adalah bakteri
golongan Pasteurella dan Streptococcus. Terjadinya hemolisis dan perubahan
warna media menjadi kehijauan disebut golongan beta hemolisis. Hal ini
disebabkan karena golongan bakteri ini memiliki exotoksin yang mampu
melisiskan atau menghancurkan eritrosit. Oleh karena itu perlu dilakukan
pemurnian untuk mengetahui secara pasti jenis bakteri yang tumbuh pada media
isolasi. Hasil identifikasi bakteri secara mikroskopis dengan pewarnaan gram

21
 didapatkan bakteri Gram positif berbentuk basil (batang) diduga bakteri yang
tumbuh adalah bakteri Bacillus sp (Gambar 4.3b).

Gambar 4.3a Hasil streak pada Gambar 4.3b Hasil pewarnaan

media BA isolat bakteri

Sumber: Dokumentasi pribadi Sumber: Dokumentasi pribadi

Sel dari bakteri Bacillus sp. berbentuk batang dan lurus, panjang tubuhnya
0,5-2,5 x 1,2 – 10 µm. sering tersusun berpasangan atau membentuk rantai,
dengan membuat atau melingkar. Termasuk bakteri Gram positif dan motil atau
bergerak dengan flagella. Endospora berbentuk oval atau sesuatu yang bulat atau
silindris dan sangat resisten pada kondisi yang merugikan atau tidak mendukung.
Bersifat aerobik atau anaerobik fakultatif, dengan kemampuan fisiologis yang
beragam terhadap panas, pH dan kadar garam. Ditemukan di berbagai macam
tempat atau habitat, sebagian kecil bersifat pathogen terhadap vertebrata atau
invertebrata (Holt, 2000). Sehingga, pada media ini tidak ditemukan adanya
bakteri pathogen penyebab gangguan pernafasan pada unggas. Adanya
kontaminasi bakteri Bacillus sp. diduga sebagai penyebab tidak tumbuhnya
bakteri pada saluran pernafasan.
c. Media Trypticase Soy Agar (TSA)
Trypticase Soy Agar (TSA) merupakan media agar yang digunakan untuk
kegiatan pengisolasian dan pembudidayaan berbagai macam mikroorganisme
yang bersifat aerobik. Medium ini digunakan untuk berbagai tujuan yang
mencakup pemeliharaan stok budidaya, isolasi berbagai macam spesies
mikroorganisme, serta sebagai dasar untuk media termasuk darah. Komposisi
dari TSA ini antara lain Approximate Formula, Per Liter Purified Water,

22
Pancreatic Digest of Casein, Papaic Digest of Soybean, Sodium Chloride, Agar
(Biberstein and Yuan, 2004). Kelemahan dari media TSA yaitu semua
mikroorganisme mampu tumbuh di media ini karena TSA termasuk media
universal sehingga mempersulit untuk identifikasi koloni.

Gambar 4.4a Hasil streak pada Gambar 4.4b Hasil pewarnaan

media TSA isolat bakteri

Sumber: Dokumentasi pribadi Sumber: Dokumentasi pribadi

Hasil dari penanaman pada media TSA didapatkan koloni berwarna putih
kompak dengan daerah tengah yang menebal dan berwarna lebih gelap
konsistensi lunak (Gambar 4.4a) dan hasil pemeriksaan mikroskopis dengan
pewarnaan gram terlihat bakteri basil pendek, gram negative (Gambar 4.4b)
sehingga dapat disimpulkan bahwa pada media TSA tidak ditemukan bakteri
Pasteurella multocida diduga pada media TSA ditemukan bakteri E.coli. Koloni
Pasturella sp pada TSA yaitu dengan ciri membentuk koloni bewarna Putih
kebiruan atau putih kehijauan fluorosence, berbentuk mukoid (berlendir) dan
semakin lama menjadi bentuk smouth (halus) atau rough (kasar). Bakteri P.
multocida menimbulkan gas yang berbau (Priadi dan Natalia, 2000). Pada
pemeriksaan ini koloni yang tumbuh berwarna putih kompak dengan bagian
tengah berwarna gelap dan ketika dilakukan pewarnaan gram didapatkan
morfologi bakteri berbentuk batang pendek. Menurut Anderson (2013) bakteri
E. coli merupakan kuman dari kelompok gram negatif, berbentuk batang dari
pendek sampai kokus, saling terlepas antara satu dengan yang lainnya tetapi ada
juga yang bergandeng dua-dua (diplobasil) dan ada juga yang bergandeng seperti
rantai pendek, tidak membentuk spora maupun kapsula, berdiameter ± 1,1 – 1,5

23
 x 2,0 – 6,0 µm. Sehingga, bakteri yang tumbuh pada media TSA adalah bakteri
E. coli.
d. Chocolate Agar (CA)
Chocolatea Agar (CA) adalah medium pertumbuhan non selektif
diperkaya. CA berisi sel-sel darah merah yang telah dilisiskan pada suhu 80oC.
CA digunakan untuk pertumbuhan bakteri yang membutuhkan Nictonamide
Adenine Dinukleotida (NAD) dan hematin yang berada di dalam sel darah
merah. Bakteri yang membutuhkan NAD dan hematin seperti Haemophilus
sp, Neisseria spp, dan Gardnerella. CA sama seperti Blood Agar (BA) tetapi
pada CA,darah yang digunakan di lisiskan terlebih dahulu sebelum dimasukan
ke larutan agar. Setelah darah lisis sel eritrosit mengeluarkan bahan-bahan
intraseluler seperti haemoglobin, hemin, dan koenzim Nicotinamide Adenine
Dinucleotida (NAD) yang dapat digunakan oleh bakteri yang sukar tumbuh.
Darah yang lisis memberikan warna coklat pada media sehingga disebut dengan
agar coklat (Smith, 1997).

Gambar 4.5a Hasil streak pada Gambar 4.5b Hasil pewarnaan

media CA isolat bakteri

Sumber: Dokumentasi pribadi Sumber: Dokumentasi pribadi

Penanaman sampel dari swab dischrage nasal ayam kampung pada

media CA diharapkan menumbuhkan koloni dan dapat mengidentifikasi adanya
bakteri Haemophilus sp., yang ditandai dengan koloni bulat putih dan mengkilat
(Biberstein and Yuan, 2004). Pada media CA didapatkan koloni bewarna putih
krem, non hemolisis (Gambar 4.5a) dan hasil pemeriksaan mikroskopis
berbentuk coccus gram negative (Gsmbar 4.5b). Berdasarkan hasil diatas,

24
 isolasi primer tidak menunjukan adanya pertumbuhan koloni bakteri
Haemophilus sp. Haemophilus paragallinarum merupakan bakteri gram-negatif,
berbentuk batang pendek atau cocobacilli, tercat polar, non-motil, tidak
membentuk spora, fakultatif anaerobe dan membentuk faktor-V (Tabu, 2000).
Pada biakan media koloni akan membentuk zona (daerah) warna kuning di
sekeliling dan dibaawah bakteri Haemophilus sp (Blackall, 1990). Sementara
pada hasil biakan sampel di media ini tidak ditemukan koloni yang membentuk
zona.
4.2.2 Isolasi Sekunder
Dalam pemurnian mikroba dikenal istilah yaitu isolasi mikroba dan kultur
murni. Pemurnian merupakan kegiatan untuk mendapatkan koloni murni
mikroorganisme yang ditumbuhkan sebelumnya. (Rohimat, 2002). Kultur murni
adalah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel
tunggal, artinya mikroba ditumbuhkembangkan dari bakteri yang dihomogenkan
dengan kata lain bakteri di isolasikan agar didapatkan bakteri murni yang
dibutuhkan nantinya dalam kegiatan praktikum. Objek yang harus diperhatikan
adalah bakteri (Suriawiria, 2005).
Pemurnian dilakukan dengan memindah sebagian koloni mikroorganisme
ke dalam media pertumbuhan yang baru sehingga di dapat koloni murni yang di
harapkan. Pemurnian bakteri dilakukan dengan cara penggoresan menggunakan
jarum ose yang dipanaskan terlebih dulu sampai berwarna merah dan didiamkan
sebentar hingga tidak panas lagi kemudian digunakan untuk mengambil koloni
bakteri, setelah pengambilan koloni bakteri baru dilakukan penggoresan dengan
pola zig-zag pada cawan petri yang talah diberi media tumbuh bakteri (Rohimat,
2002). Pada pemeriksaan ini yang dilakukan pemurnian adalah pada sampel MCA
dari gerusan hepar ayam, dikarenakan hasil yang didapat menunjukkan hasil yang
diduga positif adanya pertumbuhan bakteri E. coli.
a. Media Mac Conkey Agar (MCA)
Hasil pemeriksaan pada media MCA menunjukkan bahwa isolat bakteri
yang tumbuh berwarna merah bata, dengan koloni kecil hingga besar dan
beberapa ada yang mucoid (Gambar 4.6) Koloni yang mucoid diduga

25
merupakan koloni bakteri E. coli, sehingga dilakukan isolasi pemurnian untuk
memastikan jenis koloni. Hasil dari isolasi sekunder koloni menunjukkan koloni
yang berukuran sedang, merah bata, methalik, smooth, keping atau sedikit
cembung.

Gambar 4.6. Koloni hasil pemurnian bakteri pada media MCA

Koloni yang telah dimurnikan kemudian dilakukan uji morfologi. Uji

morfologi dilakukan dengan melakukan uji KOH dan pewarnaan gram dari
kolonibakteri. Pemeriksaan menggunakan larutan KOH 3 % berguna untuk
memperjelas pemeriksaan pewarnaan gram. KOH dinyatakan positif jika
terdapat lendir atau gel (Lay, 1994). Bakteri yang dibiakkan pada media MCA
dari sampel termasuk gram negative karena terdapat bentukan lendir atau gel
(KOH +) pada uji KOH (Gambar 4.7). Hasil pewarnaan gram menunjukkan
bakteri merupakan kelompok gram negatif berbentuk batang (Gambar 4.8)

26
 Gambar 4.7. Uji KOH membentuk lendir

Gambar 4.8. Hasil pewarnaan gram menunjukkan bakteri

batang gram negatif

Hasil pemurnian dan uji morfologi bakteri memperkuat dugaan bahwa

isolate koloni merupakan bakteri E. coli. Bakteri E. coli merupakan kuman dari
kelompok gram negatif, berbentuk batang dari pendek sampai kokus, saling
terlepas antara satu dengan yang lainnya tetapi ada juga yang bergandeng dua-
dua (diplobasil) dan ada juga yang bergandeng seperti rantai pendek, tidak
membentuk spora maupun kapsula, berdiameter ± 1,1 – 1,5 x 2,0 – 6,0 µm
(Anderson, 2013). Hal tersebut terlihat dari hasil pewarnaan dan uji KOH yang
menunjukkan bakteri gram negative dengan bentuk batang. Koloni E. coli

27
 memiliki ukuran sedang, berwarna merah bata, methalik, smooth, keping atau
sedikit cembung (Biberstein, 2004). Koloni dengan karakteristik tersebut
terbentuk pasca isolasi sekunder.

4.2.3 Identifikasi
a. Uji Katalase
Beberapa bakteri yang memiliki flavoprotein dapat mereduksi O2 dengan
menghasilkan hidrogen peroksida (H2O2) atau superoksida (O2-). Kedua bahan
ini merupakan bahan yang toksik dan menghancurkan kompenen sel dengan
sangat cepat. Bakteri harus dapat mempertahankan diri seperti dengan produksi
O2 atau akan terbunuh.
Beberapa bakteri dapat memproduksi enzim yang dapat mengkatalisis
superoksida yaitu peroksida dismutase, dan juga katalase atau peroksidase yang
dapat mendekstruksi hidrogen peroksida. Katalase adalah enzim yang
mengkatalisasikan penguraian hydrogen peroksida (H2O2) menjadi air dan O2.
Hidrogen peroksida terbentuk sewaktu metabolisme aerob, sehingga
mikroorganisme yang tumbuh dalam lingkungan aerob dapat menguraikan zat
toksik tersebut. Uji katalase ini dilakukan dalam membedakan Staphylococcus
dan Streptococcus untuk mengidentifikasi kelompok bakteri bentuk coccus.
Kelompok Streptococcus bersifat katalase negatif dan Staphylococcus bersifat
katalase positif.
Uji Katalase dilakukan dengan meneteskan hidrogen peroksida (H2O2)
3% pada gelas obyek yang bersih. Kemudian biakan bakteri dioleskan pada gelas
obyek yang sudah ditetesi hidrogen peroksida dengan ose bulat. Suspensi
dicampur secara perlahan menggunakan ose, hasil yang positif ditandai oleh
terbentuknya gelembung-gelembung udara dan hasil negatif apabila tidak
terbentuk gelembung udara (Hadioetomo, 1990).
Hasil yang didapatkan setelah dilakukan uji katalase pada biakan
bakteri dalam media Mc Conkey Agar yaitu menunjukkan hasil positif, terdapat
adanya gelembung udara pada saat mencampurkan biakan dengan hidrogen
peroksida (H2O2) 3% di atas objek glass.

28
 Pada uji katalase, semua isolat bakteri bereaksi positif setelah ditetesi
H2O2 3%, hal ini di tandai dengan adanya pembentukkan gelembung udara pada
kedua isolat. Hal ini menunjukkan bahwa seluruh isolat memiliki enzim katalase
yang dapat mendegradasi hidrogen peroksida (H2O2) menjadi air dan O2.
Menurut Capuchino & Sherman (1992) selama respirasi aerobik
mikroorganisme aerob, anaerob fakultatif, dan mikroaerofilik menghasilkan
hidrogen peroksida. Penumpukkan hidrogen peroksida ini akan mengakibatkan
kematian pada mikroorganisme kecuali mereka dapat mendegradasi hidrogen
peroksida secara enzimatik. Organisme yang menghasilkan enzim katalase
dengan cepat mendegradasi hidrogen peroksida. Lay (1994) menyatakan bahwa
katalase adalah enzim yang mengkatalisasikan penguraian hidrogen peroksida
(H2O2) menjadi air dan O2. Hidrogen peroksida bersifat toksik terhadap sel
karena bahan ini menginaktivasikan enzim dalam sel, oleh sebab itu
mikroorganisme yang hidup dalam sel harus menguraikannya. Menurut Freney,
et al (1999) semua galur staphylococcus adalah katalase positif.
b. Uji Gula-gula
Uji gula-gula yang dilakukan pada praktikum ini adalah uji maltosa,
laktosa, sukrosa, manitol, dan glukosa. Uji gula-gula bertujuan untuk
mendeterminasi kemampuan bakteri dalam mendegradasi gula dan
menghasilkan asam organik yang berasal dari tiap-tiap jenis gula. Dari hasil uji
yang telah dilakukan, bakteri dapat memfermentasi gula (sukrosa dan maltosa)
yang ditunjukkan dengan adanya perubahan warna media menjadi kuning.

A B C D E
Gambar 4.9. Hasil Uji Gula-Gula, Glukosa positif (A), Laktosa positif (B),
Maltosa positif (D), Manitol positif (D), dan Sukrosa positif (E).

29
 Pertama-tama kaldu karbohidrat ditandai dengan etiket, kemudian biakan
bakteri diinokulasikan ke dalam kaldu karbohidrat, selanjutnya diinkubasikan
pada suhu 37oC selama 24 jam. Uji gula-gula bersifat positif apabila terlihat
perubahan warna menjadi kekuningan dan negatif apabila warnanya tetap merah
(Lay, 1994).
c. SIM (Sulfat Indol Motility)
Uji SIM dilakukan untuk membedakan bakteri motil dan bakteri non
motil. Motilitas bakteri dapat diamati dari pertumbuhan bakteri pada media.
Diambil bakteri dengan menggunakan jarum ose, kemudian bakteri ditanam
secara tegak lurus ditengah medium SIM (sulfat indol motility) dengan cara
ditusukkan, diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Hasil positif (+)
ditunjukkan dengan pertumbuhan bakteri menyebar menjauhi garis inokulasi
(pergerakan) sehingga media manjadi keruh. Hasil negatif (-) ditunjukkan
dengan pertumbuhan hanya terlihat disepanjang garis inokulasi dan media tidak
menjadi keruh.

Gambar 4.10. Hasil uji SIM (Sulfat Indol Motility) menunjukkan

hasil positif (+) ditandai warna keruh dan adanya pertumbuhan
yang menjalar ke atas.

Hasil yang diperoleh pada uji ini adalah positif (+), hal ini terlihat adanya
penyebaran yang berwarna putih seperti akar disekitar inokulasi. Hal ini
menunjukan adanya pergerakan dari bakteri yang diinokulasikan, yang berarti

30
 bahwa bakteri ini warna hitam, yang berarti bakteri ini menghasilkan Hidrogen
Sulfat (H2S) (Waluyo, 2004).
d. TSIA
TSIA (Triple Sugar Iron Agar) adalah media deferensial yang digunakan
dalam menentukan fermentasi karbohidrat dan produksi H2S. Selain itu, uji
TSIA ini juga dapat mendeteksi adanya gas hasil dari metabolisme karbohidrat.
TSIA membedakan bakteri berdasarkan fermentasi mereka laktosa, glukosa dan
sukrosa dan produksi hidrogen sulfida. TSIA yang paling sering digunakan
dalam identifikasi Enterobacteriaceae, meskipun berguna untuk bakteri gram
negatif lainnya (Lehman, 2005). Hasil dari pengamatan untuk uji TSIA pada E.
coli menunjukan hasil dengan gas positif dan H2S negatif. Warna kuning pada
keseluruhan media tersebut dikarenakan E. coli pada media TSIA dapat
memfermentasikan glukosa, laktosa dan sukrosa. Gas positif dikarenakan gas
yang dihasilkan oleh fermentasi karbohidrat akan muncul sebagai celah di media
atau akan mengangkat agar-agar dari bagian bawah tabung (Leboffe, 2011).

Gambar 4.11. Hasil Uji TSIA menunjukkan adanya perubahan

warna menjadi warna
kuning pada agar
Triple Sugar Iron Agar, biasanya digunakan untuk konfirmasi pengujian
E. coli dan dapat digunakan untuk identifikasi bakteri gram negatif yang
memfermentasi dekstrosa/laktosa/sukrosa dan produksi H2S yaitu dengan
ditunjukkan adanya perubahan warna agar menjadi berwarna kuning. Dari fungsi
tersebut media ini dapat diusulkan untuk konfirmasi Salmonella dan

31
 memilahkan dari Pseudomonas yang tumbuh pada media lain BSA dan BGA.
Terjadinya fermentasi dekstrosa oleh Salmonella akan menurunkan pH menjadi
asam. Kondisi ini akan menyebabkan perubahan phenol red (media merah)
menjadi kuning. Sedangkan Pseudomonas karena tidak mampu memfermentasi
dekstrosa, maka media akan tetap berwarna merah. Dengan demikian media ini
dapat dengan mudah memilah Salmonella dari Pseudomonas (Waluyo, 2004).
e. Simmon Sitrat
Uji Simmon Sitrat bertujuan mendeteksi kemampuan suatu organisme
untuk memanfaatkan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi.
Bakteri diinokulasi pada medium yang mengandung natrium sitrat dan indikator
pH bromothymol biru. Media juga mengandung garam amonium anorganik,
yang digunakan sebagai satu-satunya sumber nitrogen. Pemanfaatan sitrat
melibatkan enzim citrat permease, yang memecah sitrat menjadi oksaloasetat
dan asetat. Oksaloasetat lebih lanjut dipecah menjadi piruvat dan CO2. Produksi
Na2CO3 serta NH3 dari pemanfaatan natrium sitrat dan garam amonium masing-
masing menghasilkan pH basa. Hal ini menyebabkan perubahan warna medium
dari hijau menjadi biru (Hemraj, 2013). Simmon sitrat atau nama lainnya
Simmons Citrate Medium mengandung amonium dihidrogen fosfat, natrium
klorida, natrium sitrat. Magnesium sulfat, agar, bromtimol biru, aquades dan
memiliki pH 6,9 (Waluyo, 2004).

Gambar 4.12. Hasil uji Simmon Sitrat

32
 Dari hasil uji yang telah dilakukan didapatkan bahwa bakteri tidak
menggunakan citrat sebagai sumber energi, yang ditunjukkan dengan tidak
adanya perubahan warna dan media tetap berwarna hijau. Media ini digunakan
untuk mengetahui suatu organisme yang mempunyai kemampuan dalam
menggunakan citrat sebagai sumber carbon utama. Simmon Citrate Agar
digunakan untuk mengidentifikasi bakteri golongan Enterobacteriaceae dan
beberapa bakteri Gram negatif. Berikut metode pemeriksaan menggunakan
Simmon Sitrat:
1. Diambil koloni tunggal dengan menggunakan ose ujung lurus.
2. Dilakukan streak pada permukaan miring media.
3. Dilakukan inkubasi pada suhu 370C selama 24 jam.
4. Dilakukan pengamatan.
Interpretasi Hasil:
1. Adanya pertumbuhan : warna biru
2. Tidak adanya pertumbuhan : warna hijau (tidak berubah).
f. Urea Agar
Media ini digunakan untuk mengetahui adanya aktifitas urease pada
mikroorganisme. Berikut metode pemeriksaan dengan media Urea Agar :
1. Diambil koloni tunggal dengan menggunakan ose ujung lurus.
2. Dilakukan streak pada permukaan miring media.
3. Dilakukan inkubasi pada suhu 370C selama 24 jam.
4. Dilakukan pengamatan.
Interpretasi Hasil:
1. Apabila urea dihydrolisa, amoniak akan dibebaskan dan menyebabkan
medium berubah menjadi alkalis.
2. Positif bila berwarna merah.
3. Negatif bila berwarna kuning atau tidak ada perubahan warna.

33
 Gambar 4.13. Hasil Uji pada media Urea Agar
Pada media ini tidak menunjukkan adanya perubahan warna. Media
tetap berwarna kuning yang berarti bakteri tidak dapat mengurai urea. Uji
Urease berguna untuk mengidentifikasi organisme yang mampu
menghidrolisis urea yang dapat menghasilkan amonia dan karbon dioksida
terutama untuk mengetahui mikrooeganisme tersebut mempunyai enzim
urease atau tidak. Urease merupakan enzim konstitutif yang menghidrolisis
urea menjadi karbon dioksida dan ammonia (Brink, 2013).
Tabel 4. 3 Hasil Uji Identifikasi
Sampel Simon Urea
No. Katalase Gula SIM TSIA
Media Sitrat agar
1 MCA + + + + - -
Berdasrkan uji identifikasi yang dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa
bakteri yang tumbuh berdasarkan sifat-sifat yang ditunjukkan pada hasil
pemeriksaan adalah bakteri Eschericia coli.
4.3 Diagnosa
Berdasarkan gejala klinis dan pemeriksaan mikrobiologis didapatkan hasil
bahwa ayam tersebut menderita penyakit Chronic respiratory disease yang bersifat
kompleks, dengan ditandai adanya infeksi bakteri E.coli pada pemeriksaan
mikrobiologis organ hepar. Chronic respiratory disease (CRD) merupakan
penyakit menular menahun pada ayam yang disebabkan oleh Mycoplasma

34
gallisepticum yang ditandai dengan sekresi pada hidung berupa cairan kataralis,
kebengkakan muka, batuk dan terdengarnya suara sewaktu bernafas. Chronic
respiratory disease (CRD) pada ayam menimbulkan kerugian yang besar dalam
industri perunggasan dikarenakan sifatnya yang endemik dan terjadi tidak hanya di
Indonesia melainkan di banyak negara di dunia (Ley, 2003). Menurut OIE (2007)
CRD termasuk dalam nitifiable disease, artinya jika terjadi kasus CRD di lapang
harus segera dilaporkan ke pemerintah untuk segera ditanggulangi.
Penyebab utama CRD adalah Mycoplasma gallisepticum (MG). MG
merupakan organisme prokaryotik terkecil, termasuk dalam kelas Molicutes yang
memiliki dinding sel lunak (Ley, 2003). Sel mikoplasma dikelilingi oleh 3 lapis
plasma membran yang elastis, oleh karena itu mikoplasma resisten terhadap
penisilin dan derivatifnya yang memiliki target pada dinding sel (Pugh, 1991).
Ukuran sel MG bervariasi antra 0,2-0,8 µm, berbentuk pleomorpik bervariasi dari
sperikal atau seperti buah pear sampai filamen bercabang atau helikal (Ley, 2003).
Sel dapat diwarnai dengan pewarnaan Giemsa atau Gram. Bentuk koloni pada
media agar seperti telur mata sapi dengan ukuran 0,1 – 1,0 cm, bulat , permukaan
halus dan ditengahnya ada bagian padat dan menonjol yang disebut bleb (Tajima et
al. 1982). Sel mikoplasma sangat rentan terhadap suhu udara luar dan dapat
bertahan hidup diluar tubuh ayam 1 hari pada suhu 37oC atau sampai 3 hari pada
suhu 20oC (Ley, 2003).
Mekanisme infeksi, MG masuk melalui rongga hidung kemudian melekat
pada reseptor epitel yang disebut sialoglycoprotein (Patron recognition
receptorssites) yang dimediasi oleh adhesin dan protein yangdisebut bleb
(Pathogen associate molecular patrons)yang terletak pada ujung organ sel
mikoplasma(Tajima et al., 1982). Selanjutnya, sel mikoplasma melakukan
penetrasi dan merusak mukosa epitel sambil memperbanyak diri. Dengan
perantaraan gerakan silia epitel dan bleb, sel mikoplasma bergerak menuju kantong
membran udara abdominal (Szathmary and Stipkovits, 2006). Mekanisme infeksi
MG sampai masuk ke indung telur atau oviduct dan menyebabkan penyebaran
vertikal sampai saat ini belum diketahui. Peradangan yang terjadi pada jaringan
epitel bukanlah akibat dari toksin mikoplasma tetapi lebih disebabkan karena

35
respons imun dari induk semang berupa reaksi peradangan (Razin et al., 1998).
Peradangan ini menyebabkan terhambatnya perkembangan sel T helper 1 (Th1 cell)
sehingga sel T sitotoksik (killer cytotoxic T cell) menjadi tidak aktif yang
mengakibatkan infeksi patogen menjadi persisten (Gaunson et al., 2000; Szatmary
and Stipkovits, 2006). Akibat lain yaitu terjadi peningkatan produksi Tumor
necrosis factor α (TNFα) yang mengakibatkan respon sel Th2 menurun, yang
mengakibatkan respon netralisasi antibodi terhadap infeksi bakteri atau virus juga
menurun drastis (Szatmary and Stipkovits, 2006). Kondisi ini menjelaskan kenapa
infeksi mikoplasma menyebabkan imunosupresif terhadap ayam yang terinfeksi
MG.

Pada pemeriksaan patologis, kelainan utama yang diakibatkan oleh CRD

ialah radang sekresi hidung katar dalam alat pernafasan mulai dari rongga hidung,
sinus sampai kantung udara. Kantong udara terlihat keruh dan bereksudat kasar.
Bila terjadi komplikasi dengan bakteri, perubahan hebat ditemukan berua
perikarditis, pehihepatitis fibrinosa atau fbrino purulenta disertai dengan radang
masif kantong udara. Selain gangguan alat pernafasan telah dilaporkan terjadi
salpingitis. Hal ini sesuai dengan hasil pemeriksaan post mortem ayam bahwa
ditemukan adanya radang pada selaput jantung atau perikarditis, pembengkakan
daerah muka dan pada rongga hidung keluar cairan kataral. Faktor predisposisi
yang memperparah terjadinya infeksi yaitu umur (ayam muda lebih peka
dibandingkan dengan dewasa), jenis kelamin (ayam jantan lebih peka dibandingkan
dengan ayam betina), stres, bau amoniak, lingkungan yang berdebu serta perubahan
suhu yang mendadak (Kleven, 1990). Pada infeksi yang kompleks dengan infeksi
lain seperti infeksi Escherichia coli atau viral maka gejala klinis menjadi lebih
parah (Ley, 2003).

36
 BAB V PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Ayam sampel menunjukkan adanya gejala klinis berupa pembengkakan
pada daerah wajah sampai daerah vial dan bulu terlihat kusam. Pemeriksaan yang
dilakukan meliputi pemeriksaan hasil nekropsi, pemeriksaan mikrobiologi terhadap
organ pangkal trachea, hepar, dan jantung, serta dilakukan swab pada daerah sinus
nasal. Berdasarkan gejala klinis dan pemeriksaan mikrobiologi yang menunjukkan
adanya bakteri E.coli, maka ayam mengalami Chronic Respiratory Disease (CRD)
kompleks.
5.2 Saran
Sebaiknya dalam melakukan pemeriksaan dilakukan penyimpnan sampel,
sehingga jika didapatkan hasil yang bias atau dubius dapat dilakukan pemeriksaan
ulang.

37
 DAFTAR PUSTAKA

Anderson, C. 2013. Great Adventures in the Microbiology Laboratory 7th Ed.

Pearson. Pp: 175-176.
Biberstein, E. L. and Yuan Chung Zee,. 2004. Review of Veterinary Microbiology.
Blackwell Scientific Publications, Inc. Boston. USA.
Brink B. 2013. Urease test protocol. American society for microbiology.
http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/2871-urease-
testprotocol
Cappucino, J.G. dan Sherman, N. 1992. Microbiology a Laboratory Manual. The
Benjamin/Cummings Publishing. USA: 485 hlm.
Freney, J., Kioos, W.E., Hajek., and Webster, J.A. (1999) Recommended minimal
standard for description of new Staphylococcal species. Int. J. Syst. Bacterio.
49: 489-502.
Gaunson, J.E., C.J Philip, K.G. Whithear and G.F. Browning. 2000. Lymphocytic
infiltration in the chicken trachea in response to Mycoplasma gallisepticum
infection. Microbiol Reading 146: 1223-1229.
Hadioetomo, R.S. (1990) Mikrobiologi dasar dalam praktek teknik dan prosedur
dasar laboratorium. Penerbit PTGramedia, Jakarta. Hal 103-104
Hemraj V, Diksha S, Avneet G. A Review On Commonly Used Biochemical Test
For Bacteria. Innovare Journal of Life Science. 2013. 1-7.
Kleven, S.H. 1990. Summary of discussions of avian mycoplasma team. Avian
Pathol.19: 795-800.
Lay B. W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada.
Jakarta. 167 hlm.
Ley, D.H. 2003. Mycoplasma gallisepticum infection. In: Diseases of Poultry. 11th
Ed. Saif, Y.M., H.J. Barnes, A.M. Fadly, J.R Glisson, L.R. McDougals and
D.E. Swayne (eds). CD Rom version produces and distributed by Iowa State
Press. A Blackwell Publishing Company. Pp 722-744.

38
Luis, M.D.L., Pezzlo M.T., Janet T.S., and Paterson E.M. 2004. Color Atlas of
Medical Bacteriology. Washington D.C: ASM Press. Pp: 103.
Madigan, M., dan Martinko J. 2005. Brock Biology of Microorganism 11th Ed.
Prentice Hall.
OIE. 2007. World Organisation for Anmal Health (OIE). Quarterly Epidemiology
Report October-December 2007 (Asian and Pacific Region). Published by the
OIE Regional representation for Asia and the Pacific in Collaboration with the
Secretariat of the Pacific Cmmunity Sanseido BLDG., 4 F, 2-4-10 Kojimachi,
Chiyoda-ku, Tokyo 102-0083.Japan.
Pelczar, M.J. 2006. Dasar-dasar Mikrobiologi 1. Jakarta: UI Press.
Priadi, A dan L. Natalia. 2000. Patogenesis SE pada sapi bali dan kerbau. Gejala
klinis, perubahan patologis, reisolasi, deteksi P. multocida dengan media kultur
dan PCR. JITV. 5(1):65-71.
Razin, S.K., S. Pratik, S. Amer, J.A. Newman, P. Singh and A. Silm. 1998.
Lymphoproliferative response of specific pathogen-free chickens to
Mycoplasma gallisepticum strain PG31. Avian Pathol. 27 : 277-283.
Rohimat, Srikandi. 2002. Analisis Mikrobiologi Pangan. PT. Raja Grafindo :
Jakarta.
Smith A., and Baker M. 1997. Cefsulodin chocolate blood agar: a selective medium
for the recovery of Haemophilus influenzae from the respiratory secretions of
patients with cystic fibrosis. J. Med. Microbiol. - Vol. 46 883-885.
Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti, Jakarta.
Szatmary, S. And L Stipkovits. 2006. Interaction of mycoplasma and the chicken
immune system. International Novaritis Poultry Symposium, Puerto
Vallarta Jalisco, Mexico. Pp. 1-24.
Tajima, M., T. Yagihashi and Y. Miki. 1982. Capsular material of Mycoplasma
gallisepticum and its possible relevance to the pathogenic process. Infect.
Immun 36:830-833.

39
BAGIAN 2 : VIROLOGI
 BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Usaha peternakan ayam seringkali terkendala oleh berbagai penyakit

menular di antaranya penyakit tetelo atau Newcastle Disease (ND) maupun flu
burung atau Avian Influenza (AI). Penyakit ND dan AI merupakan penyakit virus
menular strategis (Kementan, 2013) yang dapat mengancam usaha peternakan
unggas serta menimbulkan kerugian sangat bear (Sudarisman, 2009). Penyakit AI
bahkan dikategorikan sebagai kelompok penyakit zoonosis berbahaya karena dapat
menyerang unggas dan hewan mamaliaserta menulari manusia, bahkan bersifat
mematikan baik pada hewan maupun manusia yang terinfeksi. Meskipun virus AI
dapat menginfeksi mamalia tetapi virusnya masih tetap virus strain avian (Kandun
et al., 2006). Derajat keparahan unggas akibat penyakit AI sangat bervariasi mulai
dari infeksi yang bersifat asimtomatik (tanpa gejala klinis) sampai bersifat fatal
multisistemik (Swayne, 2000).

Sampai saat ini penyakit ND dan AI tetap endemik d banyak negara (OIE,
2012), termasuk di antaranya di Indonesia dengan kejadian penyakit yang terus
berlangsung sepanjang tahun (Kencana et al., 2012). Selain menghambat produksi
peternakan, kerugian lain yang ditimbulkan oleh penyakit ND maupun AI adalah
biaya penanggulangannya yang sangat besar terutama untuk melakukan tindakan
biosekuriti dan sanitasi terhadap lingkungan yang telah tercemar virus (Sudarisman,
2009). Selain penyakit ND dan AI, kerugian pada peternak dapat diakibatkan oleh
penyakit egg drop syndrom (EDS) pada ayam layer.

Egg drop syndrome- 1976 (EDS 76) meurpakan penyakit infeksius pada
ayam betina layer yang manifestasinya berupa penurunan produksi telur secara
cepat, kegagalan mencapai puncak produksi telur berbentuk tidak teratur, kerabang
lembek atau tanpa kerabang dan depigmentasi (Dinev, 2007). Penyakit tersebut
ditimbulkan oleh virus dan telah menjadi penyebab utama penurunan produksi
produksi telur di seluruh dunia (Adair dan Joan, 2008). Virus EDS sebagai salah
satu adenovirus memiliki bentuk simetris ikosahedral, mengandung moleku linier

1
tunggal dari double stranded deoxyribonucleic acid (ds DNA), tidak beramplop,
dan bereplikasi di nukleus membentuk inklusi (Quinn et al., 2007).

Salah satu tindakan yang diharapkan mampu melindungi ayam dar penyakit
adalah dengan melakukan tindakan vaksinasi (Paniogo, 2007). Namun demikian
sampai saat ini wabah ND tetap menjadi masalah yang serius di industri peternakan
ayam (Xiao et al., 2012). Sama halnya dengan penyakit ND, penyakit lainnya
seperti AI maupun EDS merupakan penyakit yang endemis yang sangat ditakuti
peternak karena penularan penyakit berlangsung sangat cepat dengan tingkat
kematian yang sangat tinggi. Perlunya ketepatan dalam deteksi penyakit, baik
melalui pengujian titer antibodi protektif maupun spesifitas dari antigen yang diuji
untuk melihat penyebab penyakit pada unggas. Sehingga, dilakukan pemeriksaan
serologis berupa pemeriksaan Agar Gel Presipitation Test (AGPT) dan uji HI.

1.2 Rumusan Masalah

a. Bagaimana cara pemeriksaan penyakit unggas secara serologis melalui

metode AGPT dan HI?
b. Bagaimana cara mendiagnosa suatu penyakit secara serologis?

1.3 Tujuan

a. Dapat mengetahui cara melakukan pemeriksaan penyakit unggas secara

serologis melalui metode AGPT dan HI
b. Dapat mengetahui cara mendiagnosa suatu penyakit secara serologis.

1.4 Manfaat

Manfaat yang diharapkan adalah mahasiswa PPDH dapat meningkatkan

kemampuan laboratorik terutama dalam pemeriksaan serologis dan menentukan
diagnosa dari hasil pemeriksaan yang didapatkan.

2
 BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Uji Serologis

Uji serologis adalah pengujian yang menggunakan serum sebagai sampel

yang digunakan untuk melihat titer antibodi di dalam tubuh hewan. Penggunaan uji
serologis ini mempunyai beberapa ttujuan, diantaranya adalah untuk memantau
hasil vaksinasi. Uji serologis dapat digunakan sebagai peneguhan diagnosa suatu
penyakit. Titer antibodi dari penyakit viral seperti Newcastle disease (ND), Avian
Influenza (AI), Infectious bursal disease (IBD/Gumboro), Infectious bronchitis (IB)
dan Egg drops syndrome (EDS) maupun penyakit bakterial yaitu Salmonellosis,
Choryza dan Chronic respiratory disease (CRD) dapat diketahui melalui uji
serologis. Ada beberapa cara lain yang dipakai pada uji serologi misalnya Agar Gel
Presipitasi (AGP), Enzyme linked Immuno Absorbent Assay (ELISA), maupun
Serum Netralisasi Test (SNT) seringkali digunakan sebagai pembanding dengan uji
HI ( Kusmaedi, 2001).

2.1.1 Uji Agar Gel Precipitation (AGP)

Agar gel precipitation test (AGPT) digunakan untuk melihat reaksi
pengendapan antara antigen dengan antibodi spesifik. Pengendapan akibat
reaksi antigen dengan antibodi ini diperlihatkan oleh adanya garis presipitasi
di media agar gel. Antibodi dan antigen homolog akan menunjukan adanya
bentukan garis presipitasi, namun sebaliknya antibodi dan antigen yang tidak
homolog dengan antigen maka tidak akan menunjukkan adanya bentukan garis
presipitasi pada media agar (Swayne et al., 2006).
Menurut Crowle (2014) terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi
keberhasilan dari hasil uji agar gel presipitasi (AGP) yang diinkubasi selama
48 jam yaitu;
 pH
Sampel dapat mengalami presipitasi jika media berada pada pH 7,0-
7,2. Sedangkan pada pH 5,0-5,5 tidak menyebabkan terjadinya presipitasi.
pH yang optimal untuk terjadinya reaksi antara antigen dan antibodi berkisar
pada pH 6-8. Antigen tidak akan membentuk garis presipitasi apabila

3
 kondisi pH dibawah standar, dikarenakan antigen akan terlarut dan tidak
berdifusi melalui agar pada konsentrasi garam yang tinggi atau pH yang
rendah.
 Temperatur
Temperatur inkubasi pada reaksi aglutinasi bervariasi, kurang lebih
50- 56°C. Sedangkan pada yang lain pada suhu 27°C. Suhu optimal untuk
terjadinya reaksi antara antigen dan antibodi ialah berada pada kisaran suhu
40°C. Sampel pada uji AGP yang diletakkan dalam suhu ruang
kemungkinan mengakibatkan berkurangnya kelembaban dan akan
menyebabkan pori-pori dari agar sebagai tempat berdifusinya antigen dan
antibodi akan mengecil karena kering.
 Kelembaban
Media agar tidak boleh disimpan dalam lemari es karena agar akan
menjadi kering, pada temperatur panas media akan menjadi cair. Sehingga
tempat penyimpanan dibuat menyerupai lembah dengan nampan yang diberi
kapas dan air.
 Media Agar
Media yang digunakan adalah media agar semisolid, dapat juga
dipakai agar gelatin/silika. Media yang paling umum digunakan adalah
agar-agar. Tidak dianjurkan membiarkan media agar menjadi padat lalu
mencairkannya kembali lebih dari 2 kali karena dapat memberikan hasil
yang kurang baik.
 Jarak sumuran
Jika jarak sumuran terlalu jauh atau tidak sama antara kiri dan kanan
dapat mengakibatkan tidak terbentuknya garis presipitasi karena kecepatan
antara antigen atau antibodi berdifusi tidak sama sehingga jarak yang jauh
mengakibatkan tidak terbentuknya garis presipitasi.
 Lama inkubasi
Pembentukan ikatan antigen-antibodi membutuhkan waktu sekitar 2-
3 hari. Jadi jika waktu inkubasinya kurang dari waktu yang ditentukan
kemungkinan garis presipitasi belum terbentuk.

4
  Aviditas dan avinitas seimbang
Uji AGP membutuhkan antibodi dan antigen dengan konsentrasi
tinggi, apabila antibodi yang digunakan memiliki afinitas dan aviditas yang
rendah maka tidak akan terbentuk garis presipitasi. Semakin tinggi afinitas
antibodi terhadap antigen maka akan terbentuk interaksi yang stabil.
Antibodi yang memiliki aviditas yang tinggi berupa antibodi yang bersifat
multivalent dengan antigen multivalent akan lebih stabil ikatannya dan
mudah terdeteksi
2.2 Egg Drop Syndrome

Egg drop syndrome-1976 (EDS-76) merupakan suatu penyakit viral pada

ayam petelur yang disebabkan oleh adenovirus yang mempunyai kemampuan untuk
mengaglutinasi eritrosit. Penyakit ini tersifat oleh adanya kegagalan untuk
mencapai puncak/target produksi dan adanya ayam sehat yang menghasilkan
sejumlah telur yang mempunyai kerabang tipis atau telur tanpa kerabang. Jika EDS-
76 telah ditemukan pada suatu peternakan, maka penyakit ini lebih merupakan
penyebab kegagalan untuk mencapai target produksi oleh karena gangguan kualitas
kerabang menjadi kurang menonjol walaupun gejala tersebut masih tetap
ditemukan pada kelompook ayam tersebut (Tabbu, 2000).

Penyakit EDS umumnya menyerang ayam layer betina berumur lebih dari
36 minggu (Quinn et al., 2007). Masa inkubasinya berlangsung singkat yaitu antara
tiga sampai empat hari. Penyakit EDS pada ayam broiler ditemukan pada umur lima
sampai enam minggu, tetapi bersifat subklinis (Kencana, 2012). Gejala awal infeksi
virus EDS berupa hilangnya pigmentasi pada telur. Hal tersebut diikuti munculnya
telur berkerabang tipis, lembek atau bahkan tanpa kerabang. Kerabang yang tipis
seringkali memiliki permukaan yang kasar dengan tekstur seperti pasir atau
memiliki granula kasar di salah satu ujungnya (Adair dan Joan, 2008).

Isolasi dan propagasi virus EDS dapat dilakukan dengan menggunakan telur
berembrio (in ovo). Pemilihan rute inokulasi dan umur embrio yang akan digunakan
ditentukan oleh selektivitas virus terhadap membran tertentu atau fase
perkembangan embrio (Burleson et al., 1992). Rute inokulasi yang dapat digunakan

5
untuk isolasi virus EDS adalah pada ruang allantois. Inkubasi telur sebelum
inokulasi adalah 38oC sampai 39oC pada inkubator. Kelembapan hars dijaga pada
60% dan telur dibalik minima sekali per hari. Viabilitas embrio dalam telur
diperiksa sebelum diinokulasi dengan cara meneropongnya menggunakan cahaya
di ruang gelap. Lima sampai enam hari setelahdiinkubasi pembuluh darah dapat
terlihat pada telur fertil sedangkan pada telur infertil tampak kosong dan transparan
(Merchant and Packer, 1961). Inokulasi virus pada ruang allantois menghasilkan
virus pada cairan allantois. Virus yang ada kemudian dapat dipanen dengan
mengambil cairan allantois (Mahy and Hillar, 1996).

2.3 Newcastle Disease (ND)

Virus ND merupakan virus dari famili Paramyxovirus sub famili

Paramyxovirus genus Avulavirus pada kelompok Avian Paramyxovirus Serotipe 1
(AMPV-1) yang berbentuk pleumorfik (Murphy et al., 1998). Asam nukleat virus
ND adalah RNA yang berbentuk single standed RNA (ssRNA) dan berpolarisasi
negatif. Replikasi virus terjadi pada sitoplasma sel (Oliver, 2004). Asam nukleat
virus dapat menyandi 6 protein struktural yang meliputi nukleoprotein (NP),
phosphoprotein (P), protein matrik (M), protein fusi (F), hemaglutinin-
neuraminidase (HN), dan RNA dependent RNA Polymerase (L) (Spradbrow,
1992), serta menyandi 2 protein non struktural yaitu protein V dan protein W
(MacLachlan dan Dubovi, 2011). Protein V berperan melawan interferon
sedangkan protein W tidak diketahui fungsinya (Murphy et al., 1998).

Virus ND terdiri dari amplop, kapsid, dan asam nukleat. Pada amplop
terdapat protein HN, protein F, dan lipid membran serta mengandung nukleokapsid
heliks simetris berbentuk seperti paku yang memiliki panjang 1 μm dan diameter
18 nm. Pada kapsid terdapat protein M dan NP (Aldous dan Alexander, 2001).
Protein F berperan memicu fusi virus dengan membran sel inang sementara protein
HN berperan dalam perlekatan dengan sel inang, menjaga kestabilan virus, dapat
mengikat molekul permukaan sel inang yang mengandung residu asam sialat baik
glikolipid atau glikoprotein. Bukti dari perlekatan tersebut terlihat dari
terbentuknya butiran berpasir pada uji hemaglutinasi (OIE, 2008). Protein M adalah

6
protein paling melimpah yang berperan dalam membatu perakitan virus dengan
bahan glikoprotein dan ribonukleoprotein serta berperan dalam pengendali sintesis
RNA namun protein M akan terlepas setelah memasuki sitoplasma sel inang. Dan
protein P dan protein L yang membungkus genom RNA berfungsi untuk transkripsi
genom RNA menjadi mRNA (MacLachlan dan Dudovi, 2011).

Penularan penyakit ND terjadi secara kontak langsung melalui inhalasi

(aerosol) dari partikel debu serta secara oral melalui konsumsi pakan dan air minum
yang terkontaminasi feses atau leleran hidung dan mulut ayam terinfeksi (Kencana,
2012). Mekanisme penyebaran penyakit antara daerah satu dengan daerah lainya
dipengaruhi oleh stabilitas relatif virus dan inang. Penularan secara vertikal jarang
terjadi namun beberapa kasus yang muncul kemungkinan penularan melalui
kontamiansi feses yang mengandung virus ND pada kulit telur. Namun ini masih
belum pasti apakah penularan secara vertikal berasal dari virus yang lebih patogen
meskipun dalam sebuah percobaan dengan dosis virus yang sangat rendah, virus
ND dapat diisolasi dari ayam yang baru menetas. Ayam yang terinfeksi dapat
mengeluarkan virus selama 1 sampai 2 minggu kecuali burung psittacine yang
dapat mengeluarkan virus selama berbulan-bulan. Burung ini menjadi sumber
penular penting dari virus Newcastle Disease di daerah endemis (CFSPH, 2008).

Selain melalui kontak langsung, penularan penyakit juga melalui kontak

tidak langsung yaitu melalui peralatan kandang seperti tempat pakan/minum, alat
transportasi, dan pekerja kandang (OIE, 2004). Selain faktor-faktor yang telah
disebutkan itu, pergantian musim, perpindahan ayam, sifat virus, dan perantara
virus juga dapat berperan dalam penyebaran penyakit ND (Ronohardjo dan Yusuf,
1995).

7
 BAB III METODOLOGI

3.1 Tempat dan Waktu

Kegiatan PPDH rotasi diagnosa laboratorik mikrobiologi ini dilakukan
di Laboratorium Mikrobiologi (Virologi) Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Airlangga selama delapan hari mulai tanggal 6 Februari 2017
sampai dengan tanggal 13 Februari 2017.

3.2 Uji AGP

3.2.1 Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan untuk pengujian agar presipitasi ini
adalah cawan petri, gelas obyek, gel punch dan kertas hisap. Sedangkan
bahan yang digunakan antara lain adalah larutan agar (8 gram NaCl; 1,5
gram agar No.1 (oxoid), Buffer Sorensen (10x) ditambah 100 ml),
antigen dan antibodi standard, antigen dan antibodi yang akan diuji.
3.2.2 Metode
 Larutan agar dituang pada cawan petri dan dibiarkan memadat.
 Setelah memadat dibuat lubang pada agar menggunakan gel punch
dengan pola yang sudah ditentukan, biasanya berbentuk lingkaran.
 Setelah lubang terbentuk, lubang diisi dengan antibodi (As) (berupa
serum) sebanyak 0.025 ml dan pada lubang lainnya diisi dengan
antigen (Ag) sebanyak 0.025 ml di sebelah lubang yang berisi
antibodi sesuai pola.
 Setelah semua lubang terisi, gel diinkubasi selama 24 jam pada suhu
kamar.
 Setelah itu dilakukan pengamatan.

3.3 Inokulasi Virus pada TAB

3.3.1 Alat dan Bahan
Telur berembrio umur 8-10 minggu, lampu teropong, selotip,
etanol 70% bor atau paku, gunting, spuit 1 cc, kapas, cawan petri,

8
 incubator, organ trakhea, limpa, paru, dan otak yang berasal dari ayam
diduga mengalami suspect Newcastle Disease.
3.3.2 Metode
3.3.2.1 Pengamatan Telur Melalui Peneropongan
 Pilih tempat yang gelap.
 Tekan lubang terowong lampu teropong kepada cangkang
telur.
 Nyalakan lampu.
 Diamati bagian dalam telur. Pastikan pembuluh darah
korioalantoik telur berembrio kelihatan jelas sekali dan embrio
bergerak-gerak, bentuk embrio juga jelas kelihatan, khususnya
mata embrio yang besar dan kehadiran ruang udara.
3.3.2.2 Pengumpulan Sampel Virus dari Organ
 Organ yang diduga mengandung vurus suspect Newcastle
Disease berupa trachea, limpa, paru-paru, dan otak terlebih
dahulu ditimbang seberat 0,4 gram dan dilakukan penggerusan
organ sampai halus dengan penambahan pasir kuarsa.
 Setiap sampel organ ditambahkan 3,6 ml larutan PZ dan
dicampur rata.
 Setelah terampur rata, cairan tersebut dimasukkan ke dalam
tabung steril dan ditutup dengan sumbat karet.
 Selanjutnya dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 2500
rpm selama 15 menit sampai terbentu supernatant dan
endapan.
 Supernatan inilah yang siap diinokulasikan ke dalam telur
ayam berembrio.
3.3.2.3 Inokulasi Virus ke dalam Ruang Alantoik
 Telur disinari dengan bantuan lampu peneropong, diberi tanda
batas dengan pensil antara ruang hawa dan isi telur.

9
  Kulit telur pada daerah ruang hawa ±3-5 mm dari tanda batas
ruang hawa dibuat lubang dengan bor/paku.
 Jarum spuit dimasukkan ke dalam lubang paku sedalam ± 1 cm
sejajar dengan sumbu panjang telur.
 Suspensi virus disuntikan sebanyak 0,1 ml ke dalam telur
berembrio.
 Lubang paku ditutup dengan selotip. Telur berembrio
diinkubasi pada suhu 37ºC selama 4 hari dengan posisi vertikal
(ruang hawa sebelah atas). Setiap hari diamati, apabila terdapat
embrio mati, telur disimpan didalam kulkas. Telur yang
embrionya mati lebih dari 24 jam atau yang masih hidup
sampai akhir pengamatan (setelah 4 hari), dimasukkan dalam
lemari es untuk pengamatan.
 Telur dipecah pada daerah ruang hawa dan dilakukan
pengujian terhadap cairan alantois atau perhatikan adanya
perubahan pada embrio.
3.3.2.4 Mengumpulkan Cairan Alantoik (Panen virus)
 Letakkan telur di dalam almari es selama beberapa jam atau di
dalam peti beku suhu -20°C selama 1 jam. Hal ini bertujuan
untuk membunuh embrio serta mengecilkan pembuluh darah
supaya pengumpulan cairan yang mengandung virus
dilakukan tanpa pencemaran dengan sel darah merah.
 Bersihkan lapisan cangkang di bagian atas ruang udara telur
dengan etanol.
 Pecahkan cangkang di atas ruang udara dan gunting cangkang
hingga membentuk lubang.
 Gunakan pipet Pasteur untuk menghindari embrio dan kuning
telur, ambil cairan alantoik dengan menggunakan pipet
Pasteur lain.

10
3.4 Uji HI
3.4.1 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada uji ini antara lain mikroplate,
mikropipet, cawan petri, yellow tip, gunting dan pinset. Bahan yang
digunakan untuk uji HA dan HI adalah PZ, Antigen ND sampel, Eritrosit
ayam 0,5%, antiserum positif ND dengan titer 102, 105 dan 1010 serta
antigen kontrol ND 4HA unit.
3.4.2 Metode
3.4.2.1 Persiapan membuat eritrosit 0,5%
 Pencucian eritrosit dengan cara menambahkan PZ pada darah
dan mencampurnya sampai homogen.
 Dilakukan sentrifugasi pada larutan tadi selama 10 menit pada
2500 rpm.
 Dibuang supernatant dan buffy coat
 Diulangi kedua langkah di atas sebanyak tiga kali/sampai PZ
tampak bersih.
 Dibuat campuran eritrosit 0,5% dari eritrosit 10% dengan
mencampurkan 3 ml eritrosit 10% dalam 60 ml PZ.
3.4.2.2 Uji HA Mikroplate (untuk mendapatkan antigen 4 HA unit)
 Diisi lubang mikroplate nomor 1-6 dengan 0,025 ml PZ
menggunakan mikropipet. Lubang yang diisi sebanyak tiga
baris (baris I, II dan III).
 Diisi lubang nomor 1 dari baris I, II dan III dengan antigen
sebanyak 0,025 ml.
 Dilakukan titrasi dengan cara mengambil dari lubang nomor 1
sebanyak 0,025 ml dan mencampurkannya ke lubang nomor 2.
Demikian seterusnya sampai lubang nomor 4.
 Ditambahkan eritrosit 0,5% ke semua lubang sebanyak 0,05 ml.
 Diinkubasikan mikroplate selama 30 menit pada suhu kamar
sebelum kemudian membaca titernya.

11
3.4.2.3 Uji HI Mikroplate
 Diisi lubang mikroplate nomor 1-12 dari baris A,B,C, dan D
dengan 0,050 ml PZ menggunakan mikropipet.
 Diisi lubang nomor 1-12 dari baris A dan B dengan serum ND
sebanyak 0,025 ml dengan pengenceran bertingkat.
 Diisi lubang nomor 1-12 dari baris C dan D dengan antigen
sampel dari cairan alantois TAB sebanyak 0,025 ml.
 Diinkubasi selama 10-15 menit.
 Ditambahkan eritrosit sebanyak 0,050 ml pada semua lubang 1-
12 dari baris A, B, C, dan D.
 Diinkubasi selama 15 menit.
 Dibaca hasilnya.

12
 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Uji Agar Gel Precipitation (AGP)

Hasil uji AGPT pada As X sebagai antibodi (Ab) dengan AgEDS sebagai
antigen (Ag) tidak menunjukkan terbentuknya garis presipitasi yang berwarna putih
diantara kedua well (Gambar 4.1) . Hal ini menunjukkan tidak adanya homologi
antara Ag dengan Ab yang tidak dicerminkan dengan adanya garis presipitasi.
Pengikatan antara antigen dan antibodi memerlukan struktur yang cocok antara
keduannya (Kennedy, 1985). Pada uji presipitasi, suatu Ab yang berdifusi ke agar
memiliki kecocokan atau homolog dengan Ag akan berikatan dengan Ag yang
berdifusi dalam agar sehingga terlihat berupa garis presipitasi.

Gambar 4.1 Tidak adanya garis presipitasi pada uji AGPT

Prinsip uji presipitasi agar (AGPT) adalah reaksi pengendapan antigen oleh
antibodi spesifik. Pengendapan antigen ini diperlihatkan dengan adanya garis
presipitasi pada media. Garis presipitasi dapat muncul bila antibodi pada serum
maupun sampel homolog terhadap antigen yang digunakan. Pembentukan garis
presipitasi diinisiasi oleh terbentuknya kompleks molekul antigen-antibodi yang
saling bereaksi diikuti dengan proses agregasi dan sedimentasi kompleks tersebut.
Pembentukan garis presipitasi melibatkan ion antigen divalen atau multivalen dan
sangat tergantung pada proposi antigen terhadap antibodi (Barriga, 1981). Reaksi
ini juga dipengaruhi oleh pH, suhu, avinitas atau kestabilan kompleks antigen-

13
antibodi dan afinitas atau kekuatan ikatan kompleks antigen-antibodi (Tizzard,
2004).

4.2 Uji Hemaglutinasi Inhibisi (HI)

4.2.1 Hasil Inokulasi Sampel Organ pada TAB (Telur Ayam Berembrio)
Pada pemeriksaan ini dilakukan penanaman virus yang diambil dari sampel
organ ayam pada ruang chorioalantois. Telur yang digunakan adalah telur Spesific
Pathogenic Free (SPF) yaitu telur yang tidak mengandung organisme pathogen
yang dapat menimbulkan antibodi dalam telur tersebut sehingga dapat
menimbulkan kegagalan pertumbuhan bagi virus yang akan ditanam (OIE, 2000).
Virus yang ditanam adalah virus Newcastle Disease (ND) yang berasal dari
suspensi gerusan beberapa organ ayam (otak, pulmo, trachea, limpa) yang diduga
terserang ND, untuk dapat menanam virus secara in ovo ini digunakan telur ayam
berembrio dengan kondisi embrio masih hidup.

Gambar 4.2 Telur ayam berembrio Gambar 4.3 Suspensi sampel gerusan
(TAB) organ ayam

Sumber : Dokumentasi pribadi Sumber : Dokumentasi pribadi

Telur berembrio yang digunakan berumur 10–12 hari diamati dengan lampu
teropong di kamar gelap untuk mengetahui apakah embrio tersebut masih hidup
atau sudah mati, indikasi bahwa embrio tersebut masih hidup adalah adanya
gerakan embrio di dalam telur (embrio akan menjauhi sinar) dan adanya pembuluh
darah. Digunakan telur ayam berembrio (TAB) umur 10–12 hari karena pada saat
itu ruang dan cairan chorioalantoisnya sedang berkembang sehingga daerahnya

14
menjadi luas, maka inokulasi pada ruang chorioalantois ini akan lebih mudah dan
mengurangi resiko. Telur yang digunakan berjumlah 12 butir dengan masing-
masing organ dibuat 3 penanaman pada TAB.
Telur yang telah dilakukan candling diberi tanda pada area kantong hawa.
Dilakukan pembuatan lubang diarea kantong hawa secara aseptis dengan
melakukan desinfeksi terlebih dahulu menggunakan alkohol 70%. Kemudian
inokulasi virus dilakukan dengan cara memasukkan suspensi virus ke dalam lubang
yang berada di atas embrio dengan menggunakan spuit 1 ml, ukuran jarum 28 G.
Penyuntikan dilakukan dengan sudut 45° ke arah bagian runcing telur agar tidak
mengenai embrio. Injeksi dilakukan ke dalam cairan chorioalantois untuk membuat
daerah aman sehingga lingkungan internal embrio tidak terganggu dan agar virus
mudah menyebar dan melekat pada sel yang mempunyai reseptor yang cocok
dengan virus tersebut.

Gambar 4.4 Proses peneropongan TAB Gambar 4.5 Proses inokulasi virus
Sumber: Dokumentasi pribadi Sumber: Dokumentasi pribadi

Penambahan bahan ke dalam telur akan meningkatkan tekanan di dalam telur

yang dapat mempengaruhi pertumbuhan embrio dan virus, oleh karena itu dibuatlah
lubang pada kulit telur di atas rongga hawa untuk membuat jalan keluar sedikit
udara sehingga tekanan dalam telur tetap konstan saat diinokulasi. Kemudian
lubang tersebut ditutup dengan menggunakan selotip untuk mengembalikan kondisi
dalam telur yang steril dan terhindar dari kontaminasi lingkungan luar. Telur yang
telah diinokulasi kemudian diinkubasikan pada suhu 37 °C selama 5 hari untuk

15
kemudian diamati pertumbuhan atau kematian embrio, perubahan yang terjadi, dan
dilakukan panen virus (Purchase, 1999).
Pada hari pertama dan kedua setelah inokulasi virus, embrio dalam TAB
belum ada yang mengalami kematian. Kemudian pada hari ketiga (>60 jam)
kematian sebanyak 7 TAB. Hari keempat (>72 jam) kematian sebanyak 2 TAB
sampai pada hari kelima(>90 jam) kematian sebanyak 2 ekor dan masih hidup ada
1 TAB . Kematian embrio dalam TAB tersebut dapat disebabkan oleh keganasan
atau virulensi dari virus dan juga bisa disebabkan oleh kesalahan perlakuan. Tingkat
virulensi berhubungan dengan tropisme jaringan dan sistem kekebalan inang.
Spesies inang, status imun, umur, lingkungan, ko-infeksi dengan organisme lain,
dosis virus, dan jalur paparan juga dapat memengaruhi keparahan penyakit (Umali
et al., 2013).
Virulensi virus juga dapat dilihat dari waktu munculnya kematian embrio;
virus yang mampu mematikan embrio dalam waktu <60 jam setelah inokulasi
digolongkan ke dalam galur velogenik, jika kematian embrio terjadi antara 60-90
jam termasuk ke dalam galur mesogenik dan virus yang mematikan embrio dalam
waktu >90 jam termasuk dalam galur lentogenik (Cattoli et al., 2011). Kemudian
kesebelas embrio dalam TAB yang mati tersebut kemudian disimpan pada
refrigerator untuk menghindari kebusukkan daripada TAB tersebut. Kemudian
pada hari keenam dilakukan pengujian terhadap seluruh TAB tersebut
menggunakan uji Hemaglutination (HA) untuk membuktikan bahwa penyebab
kematian dari TAB tersebut adalah virus ND. Apabila didapatkan hasil positif pada
uji HA, maka dilanjutkan dengan uji Hemaglutination Inhibition (HI). Berikut
adalah hasil daripada pengujian pada TAB tersebut.
Tabel 4.1. Lama kematian TAB
Lama Kematian TAB
Sampel
>60 Jam >72 Jam > 90 Jam

Trakea 1 Mati

Trakea 2 Mati

16
 Trakea 3 Mati

Limpa 1 Hidup Hidup Mati

Limpa 2 Mati

Limpa 3 Hidup Hidup Hidup

Otak 1 Mati

Otak 2 Hidup Hidup Mati

Otak 3 Hidup Mati

Paru – paru 1 Mati

Paru – paru 2 Mati

Paru – paru 3 Hidup Mati

4.2.2 Identifikasi Virus dengan Uji HA

Isolasi virus pada cairan alantois dilakukan dengan cara mengambil cairan
alantois yang berisi virus dari organ yang diduga terkena ND dan telah diinkubasi
selama 5 hari. Pengambilan cairan alantois dilakukan pada semua sampel telur
menggunakan mikropipet yang sebelumnnya telah dilubangi pada bagian kantung
hawa. Identifikasi virus pada TAB yang diduga ND dilakukan dengan
menggunakan uji HA dan HI. Uji HA adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui
ada tidaknya virus yang dapat mengaglutinasi eritrosit pada sampel.
Sampel eritrosit yang digunakan harus murni sehingga membutuhkan darah
ayam tanpa divaksin. Pencucian eritrosit dilakukan tiga kali dengan menggunakan
larutan PBS ph 7,2, larutan ini digunakan sebagai pencuci eritrosit, selain PBS
larutan yang digunakan dan memiliki fungsi yang sama yaitu NaCl fisiologis.
Penggunaan larutan PBS pH 7,2 ini agar eritrosit tidak mengalami difusi osmosis.
Apabila eritrosit mengalami difusi dapat mengakibatkan lisis pada sel darah.
Apabila eritrosit mengalami osmosis dapat mengakibatkan krenasi pada sel darah.
Sehingga larutan PBS dan NaCl dapat digunakan sebagai larutan isotonis pada
eritrosit. Selanjutnya eritrosit dibuat sediaan 10% yaitu 1 ml eritrosit diencerkan

17
menggunakan larutan PBS 9 ml. Kemudian eritrosit dijadikan 0,5% yaitu sediaan
larutan eritrosit 10% diambil 0,5 ml selanjutnya ditambahkan 4,5 ml larutan PBS.
Pengenceran ini dilakukan agar eritrosit tidak terlalu pekat agar antigen dapat
mengikat dan mengaglutinasi eritrosit.

Gambar 4.6 Hasil Uji HA

Sumber: Dokumentasi pribadi
Hasil uji HA pada gambar di atas, terlihat adanya aglutinasi pada darah pada
sampel pulmo dengan titer 23 dan Limpa dengan titer 24. Hal ini menunjukkan
bahwa virus yang terdapat di dalam cairan alantois adalah virus yang dapat
mengaglutinasi eritrosit. Selanjutnya dikarenakan terdapat hasil positif, maka
dilakukan uji lanjutan HI, sehingga antigen yang diduga ND perlu dilakukan
pengenceran antigen menjadi 4 HA unit.
Beberapa virus mampu mengaglutinasikan sel darah merah. Kemampuan ini
sebagai contoh dari aktivitas biologik dan aktivitas ini dapat dihambat oleh antibodi
tertentu. Sisi partikel virus yang spesifik dapat berinteraksi dengan reseptor
mukoprotein pada sel darah merah dan permukaan sel lain. Interaksi dari sisi
reseptor dan virion membuat aglutinasi sel darah merah menjadi tampak. Enzim
virus neuraminidase memecah ikatan antara virus dan sel, dan melepas keduanya

18
ke dalam larutan. Antigen adalah bagian virus yang mengandung ikatan dan antigen
dari virus digunakan untuk uji hemaglutinasi (Swayne et al., 2006).
Kemampuan ND mengaglutinasi eritrosit disebabkan oleh ikatan
hemaglutinin pada reseptor permukaan sel. Adanya enzim neuraminidase yang
dimiliki oleh virus ND berperan untuk melepaskan progeni virus dari permukaan
sel dan mencegah reattachment sehingga dapat menginfeksi sel-sel baru. Aktivitas
enzim neuraminidase akan menghambat kerja hemaglutinin untuk menempel pada
sel inang dengan menghilangkan reseptor sialic acid (Rout, 2007). Alexander dan
Senne (2008) juga menambahkan bahwa perlekatan ND pada reseptor diikuti
dengan fusi membran virus pada membran sel. Reaksi fusi dapat menyebabkan
penggabungan dua atau lebih sel inang hingga membentuk syncytia ketika partikel
virus membentuk tunas pada sel. Dinding eritrosit yang kaku akan lisis ketika virus
keluar dari sel.
Virus-virus Avian dapat mengaglutinasi sel darah merah, termasuk
didalamnya NDV (Newcastle Disease Virus), Virus influenza dan adenovirus.
Hambatan dari aglutinasi oleh antibodi spesifik merupakan dasar dari uji HA dan
HI cepat pada plate. Uji HA dan HI cepat pada plate merupakan uji yang sesuai dan
cepat dilakukan yang penerapannya lebih luas untuk kontrol berbagai penyakit
Avian seperti Newcastle Disease maupun Micoplasmosis (Swayne et al., 2006).
Tes HA positif akan menunjukkan adanya suspensi agregat eritrosit yang
berkeping-keping. HI cepat plate menunjukkan positif apabila tidak terlihat
aglutinasi pada cairan korioalantois yang diberi antiserum NDV. Uji HA cepat
biasanya dipakai untuk mengidentifikasi virus yang mampu menghemaglutinasi
eritrosit ayam. Uji HA lambat digunakan untuk mengetahui titer virus, kemampuan
virus dalam menginfeksi yang ditandai dengan adanya hemaglutinasi eritrosit. Titer
virus dapat diketahui dengan melihat sumuran terakhir pada nomor tertinggi (end
point) yang menunjukkan adanya hemaglutinasi positif. Hal itu ditandai dengan
adanya agregat-agregat di dasar sumur (Swayne et al., 2006).
4.2.3 Identifikasi Virus dengan Uji HI
Pengujian HI menggunakan sampel pulmo yang menunjukan titer HA 2 3
dengan titer antibodi ND 25. Setelah mengetahui titer antigen, langkah selanjutnya

19
menentukan 4 HA Unit. Sampel antigen pulmo titer 23 dilakukan perhitungan
suspensi virus dengan 4 HAU, yaitu 23/4= 2, artinya,1 ml vol Antigen ND didalam
1 ml larutan PZ (NaCl Fisiologis 0,9 %).
Serum yang digunakan pada pengujian ini dari ayam. Serum merupakan
bagian dari komponen darah yang didalamnya terdapat antibodi. Serum
berupa cairan tubuh (bagian dari plasma darah) yang memilki kekebalan terhadap
adanya penyakit yang masuk kedalam tubuh dan berwarna kuning jernih, Pada
serum ayam terkandung vaksin ND, sehingga dapat diketahui titer antibodi yang
dimiliki oleh ayam pedaging dapat diukur dengan pengujian HI. Serum disimpan
pada suhu -20°C atau -28°C, namun serum mampu bertahan selama 3-5 hari.

Gambar 4.7. Hasil Uji HI

Sumber: Dokumentasi pribadi
Pada hasil uji HI yaitu pada kontrol positif (well A1 – A7) ditunjukan dengan
terjadinya garis presipitasi. Well A1 – A3 ymenunujukan bahwa pada kontrol positif
memiliki titer antibodi 23. Sedangkan pada sampel gerusan pulmo ayam (Well B1 -
B7) dittunjukan dengan hasil yang negatif. HI dinyatakan positif jika terdapat
endapan eritrosit berbentuk titik ditengah lubang dan bila microplatenya
dimiringkan akan didapatkan eritrosit yang mengalir, sedangkan HI dinyatakan
negatif jika menunjukkan adanya suspensi agregat eritrosit yang berkeping-keping,
apabila mikroplate dimiringkan eritrosit tidak mengalir.
Hasil uji HI dengan hasil kontrol positif menunjukan titer antibody 23 dan
pada sampel menunjukan hasil negatif, hal in bisa diakibatkan oleh beberapa faktor
yaitu : 1. Lama penyimpanan AsND (Antiserum ND), Antibody yang sudah

20
diencerkan bersifat lebih tidak stabil daripada yang bersifat concentrated sehingga
jika setelah mengalami pengenceran harus disimpan pada suhu -20oC, jika antibody
mengalami kerusakan maka ketika dilakukan uji HI maka titer antibodi akan
menurun. 2. Sampel hasil gerusan organ pulmo belum menunjukan angka
pengenceran 4 HAU, maka sebelum dilakukan uji HI perlu dilakukan retritrasi dan
dilakukan uji HA kembali. Apabila didapatkan perbedaan hasil titer HA dari hasil
sebelumnya yaitu 23 maka harus dilakukan pengulangan pengujian atau
pengenceran kembali 4 HAU (retritasi). 3. Kesalahan tekhnis dapat mempengaruhi
hasil dari uji HA / HI.
Titer HI dinyatakan sebagai kebalikan pengenceran serum tertinggi yang
dapat menghambat hemaglutinasi 100%. Pada pengenceran serum kelipatan dua
titer HI pada umumnya dinyatakan sebagai logaritma berbaris dua dan pada uji HI
yang diulang beberapa kali untuk mendapatkan suatu nilai yang lebih mendekati
ketepatan, digunakan rata-rata titer geometrik atau Geometgric Mean Titer (GMT)
yaitu rata-rata logaritma beberapa ulangan yang ada (Merchant and Packer, 2004).
Ayam memiliki sistem pertahanan didalam tubuhnya yang cukup
berkembang sehingga ayam sangat responsive terhadap virus yang memaparnya.
Sehingga uji ini perlu digunakan unuk mengetahui titer antibody yang berfungsi
sebagai sistem imun atau pertahanan dalam tubuh ayam pedaging. Ayam memilki
sensivitas yang sangat tinggi terhadap adanya protein asing, sehingga meskipun
pemberian vaksin yang sedikit maka akan memberikan respon pembentukan
antibodi. Hal ini dikarenakan ayam khususnya ayam pedaging terdapat kelenjar
Harederian yang terletak di daerah nasotrakheal dan Bursa Fabricius yang
memungkinkan unggas atau ayam sangat responsive terhadap adanya protein asing
(Fenner, 1993).

21
 BAB V PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Uji serologis dapat digunakan untuk mengukur dan menentukan
keberhasilan hari vaksinasi dengan melihat pembentukan titer antibodi protektif.
Berdasarkan hasil pemeriksaan AGPT pada sampel AsX dan AgEDS tidak
terbentuk garis presipitasi dinatara kedua well hal ini menunjukkan bahwa kedua
sampel tersebut tidak homolog. Pada pemeriksaan uji HI sampel organ ayam (paru,
limpa, trakea dan otak) didapatkan titer HA positif pada organ pulmo 23 dan limpa
24. Sedangkan hasil uji HI menunjukkan hasil negatif pada sampel dengan tidak
terbentuknya aglutinasi.
5.2 Saran
Sebaiknya dapat dilakukan peemriksaan ulang pada pengujian HI
dikarenakan untuk melihat apakah hasil yang diperoleh disebabkan oleh kesalahan
pemeriksa atau sampel yang digunakan (Antiserum) yang telah lama sehingga
menunjukkan hasil yang bias.

22
 DAFTAR PUSTAKA

[Kementan] Kementerian Pertanian 2013. Keputusan Menteri Pertanian No.

4026/Kpts/OT.140/4/2013/ Tentang Penetapan Jenis Penyakit Hewan
Menular Strategis. Jakarta
Adair, BM., and A. S. Joan. 2008. Egg drop syndrome In: Saif, Y.M, A.M. Fadly,
J.R Glisson, L.R McDougald, L.K Nolan, and D.E Swayne. Disease of
Poultry. Twelfth edition. Blackwell Publishing. Iowa. USA.
Cattoli, G., L. Susta, C. Terregino, and C. Brown. 2011. Newcastle disease: A
review of field recognition and current methods of laboratory detection. J.
Vet. Diag. Invest. 23(4):637-656..
Dinev, I. 2007. Diseases of poultry a colour atlas. Ceva Sante Animal. Stara Zagora
Fenner. F. 1993. Virology Veteriner Edisi kedua. New York: Academic Press Inc.
Kadun, I.N., E. Tresnaningsih, WH. Purba, V. Lee, G. Samaan, S. Harun, C.
Septiawati, T. Setiawati, E. Sariwati, dan T. Wandra. 2008. Factors
associated with case fatality of human H5N1 virus infections in Indonesia:
a case seris. Lancet 372:744-749
Kencana, dan A. Y Gusti. 2012. Penyakit Virus Unggas. Udayana University Press:
Denpasar.
Merchant and Packer. 2004. Veterinary Bacteriology and Virology. USA: Iowa
State University Press.
OIE. 2000. OIE Manual of Standards for Diagnostic Test and Vaccines. 4th ed.
Paris.
OIE. 2012. Newcastle disease. OIE Terrestrial Manual. Chapter 2.3.14
Paniogo, M. 2007. Vaccination againts Newcastle disease in the hatcheries. Ceva
Animal Heatlh Asia. Selangor. www.thepoultrysite.com
Purchase, H. G., 1999. A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of
Avian Phatogens, Third Edition. Amerika: Kendal/hint Publishing
Company.
Quinn, P.J., B.K.E Marley, M. Carter, W.J.C. Donnelly, F.C. Leonard, and D.
Maghire. 2007. Veterinary Microbiologyy and Microbial Disease.
Blackwell Science. Singapore
Rout, S.N. 2007. The role of Newcastle Disease Virus Internal Protein in
Pathogenesis. Desertation. University of Maryland. Maryland (US).
Smith, GJD., T.S.P. Naipospos, TD. Nguyen, MD. de Jong, D. Vijaykrishna, TB.
Usman, SS. Hasan, TV. Dao, NA. Bui, YHC. Leung. 2006. Evolution and

23
 adaptation of H5N1 Influenza virus in avian and human host in Indonesia
and Vietnam. J Virol 350: 258-268
Sudarisman. 2009. Pengaruh perkembangan sistem produksi ayam terhadap
perubahan genetik dan biologik virus Newcastle disease. Wartazoa. 9 (3).
Swayne, D.E., J.R. Glisson, M.W. Jackwood, J.E. Pearson and W.M. Reed. 2006.
A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian
Pathogens, 4th ed. International Book Distributing Co. Pub. USA.
Swayne, DE., and DL. Suarez. 2000. Highly pathogenic avian influenza. J Rev Sci
Tech 19: 463-482
Tabbu, CR. 2000. Penyakit ayam dan penanggulangannya, penyakit bakterial,
mikal, dan viral Volume I. Kanisius: Yogyakarta
Umali, D.V., H. Ito, T. Suzuki, K. Shirota, H. Katoh, and T. Ito. 2013. Molecular
epidemiology of Newcastle disease virus isolates from vaccinated
commercial poultry farms in non-epidemic areas of Japan. Virol. J. 10:330.
Xiao, S., A. Paldurai, B. Nayak, A. Samuel, EE. Bharoto, TY. Prajitno, PL. Collins,
and SK. Samal. 2012. Complete genome sequences of Newcastle disease
virus strains circulating in chicken populations of Indonesia. Journal of
Virology 5969-5970

24