ARTIKEL

https://doi.org/10.1038/s41467-019-09326-3 BUKA

Struktur plastik-merendahkan Ideonella sakaiensis MHETase

terikat substrat
Gottfried J. Palm 1, Lukas Reisky 2, Dominique Bottcher 2, Henrik Müller 2, Emil AP Michels 1,
1,4
Miriam C. Walczak 2, Leona Berndt 1, Manfred S. Weiss 3, Uwe T. Bornscheuer 2 & Gert Weber

Daya tahan ekstrim polyethylene terephthalate (PET) puing-puing telah diberikan itu beban lingkungan jangka panjang. Pada
1234567890 ():,;

saat yang sama, usaha daur ulang saat ini masih kekurangan keberlanjutan. Dua enzim bakteri baru-baru ini menemukan

bahwa Speci fi Cally menurunkan PET merupakan solusi yang menjanjikan. Pertama, Ideonella sakaiensis PETase, konsensus

struktural baik ditandai

α / β- enzim hidrolase kali lipat, mengkonversi PET untuk mono (2-hidroksietil) tereftalat (MHET). MHETase, enzim
kunci kedua, menghidrolisis MHET ke PET reaktan tereftalat dan etilena glikol. Di sini, kami melaporkan struktur
kristal aktif MHETase ligan bebas dan MHETase terikat dengan analog MHET nonhydrolyzable. MHETase, yang
mengingatkan esterases feruloyl, memiliki klasik α / β- domain hidrolase dan substrat spesifik tutup domain
berunding fi kota. Dalam terang pemetaan berbasis struktur situs aktif, aktivitas tes, studi mutagenesis dan fi pertama
perubahan struktur-dipandu substrat spesifik fi kota menuju bis- (2-hidroksietil) tereftalat (BHET) dilaporkan di sini,
kami mengantisipasi MHETase untuk menjadi sumber daya berharga untuk lebih memajukan enzimatik degradasi
plastik.

1 Biologi Struktural molekul, University of Greifswald, Felix-Hausdorff-Str. 4, 17487 Greifswald, Jerman. 2 Bioteknologi & Enzim Katalisis, University of Greifswald, Felix-Hausdorff-Str. 4, 17487 Greifswald,

Jerman. 3 Makromolekul Kristalografi, Helmholtz-Zentrum Berlin für Materialien und Energie, Albert-Einstein-Straße15, 12489 Berlin, Jerman. 4 Hadir alamat: makromolekul Kristalografi, Helmholtz-Zentrum
Berlin für Materialien und Energie, Albert-Einstein-Straße 15, 12489 Berlin, Jerman. Para penulis ini memberikan kontribusi sama: Gottfried J. Palm, Lukas Reisky. Korespondensi dan permintaan untuk
bahan harus ditujukan kepada UTB (email: uwe.bornscheuer@uni-greifswald.de ) Atau GW (email: gert.weber@helmholtz-berlin.de )

KOMUNIKASI ALAM | (2019) 10: 1717 | https://doi.org/10.1038/s41467-019-09326-3 | www.nature.com/naturecommunications 1

ARTIKEL KOMUNIKASI NATURE | https://doi.org/10.1038/s41467-019-09326-3

dan etilena glikol pada temperatur tinggi, meskipun dengan aktivitas rendah 8 - 11 . Enzim

SEBUAH produksi industri PET diluncurkan segera setelah penemuannya dan

telah secara bertahap meningkatkan, diproyeksikan
ppreciating menjadi
sintesis sederhana, lebih dari
ketahanan 70 juta
dan daya
pada tahun 2020 1 . 2 . Salah satu keuntungan terbesar dari PET adalah inertness
ton
tahan,
optimasi dengan bioteknologi telah berhasil untuk beberapa derajat 12 - 17 . namun
sejauh ini tidak menyebabkan enzim, yang sepenuhnya dapat menembus dan
menurunkan lapisan tebal PET sangat kristal dengan cara ramah lingkungan yang
kimia karena hidrofobisitas asam tereftalat (TPA) bagian, rendering itu hampir hemat biaya dan.
tahan terhadap degradasi lingkungan. Meskipun PET dan plastik polimer sintetis
lainnya dianggap tidak beracun, partikel yang lebih besar dan butiran mikro Baru-baru ini, strain bakteri Ideonella sakaiensis 201-F6 ditemukan dan terbukti
daripadanya tahan lama, di mana-mana di laut atau habitat darat dan menumpuk tumbuh pada PET rendah kristalinitas fi LMS. Dua α / β- enzim hidrolase kali lipat ( α /
dalam organisme hidup 3 - 5 . Seringkali, mereka juga pewarna berpotensi beracun β- hidrolase), PETase dan MHETase, bekerja sama untuk menurunkan PET dalam
dan aditif operator 5 - 7 . upaya daur ulang saat ini hanya mencakup sebagian kecil dua langkah melalui MHET, menghasilkan TPA dan etilena glikol - blok bangunan
dari limbah PET dan hasil menurunkan produk nilai yang lebih rendah. Mereka yang diperlukan untuk putaran baru sintesis PET (Gambar. 1 Sebuah) 10 . 18 . struktur
bergantung pada penambahan jumlah besar polimer perawan dan signi fi konsumsi kristal baru-baru ini PETase terikat ligan con fi rmed diprediksi α / β- hidrolase kali lipat,
tidak bisa energi 4 . Atau, beberapa enzim telah diidentifikasi fi ed yang dapat substrat dijelaskan mengikat, modus katalisis dan bahkan diizinkan peningkatan sifat
menghidrolisis PET untuk TPA katalitik atau perubahan substrat spesifik fi kota 16 . 17 . 19 - 21 . Dibandingkan dengan
diketahui

Sebuah
HAI HAI
PETase H 2 HAI
HO
OO HAI OO OH
n
MEMBELAI MHET

HAI O HAI
MHETase OH +
HO HO
H 2 HAI
OO OH HO OH

MHET ethylene glycol asam tereftalat

(EG) (TPA)

b c

d e

Gambar. 1 Struktur I. sakaiensis MHETase menampilkan arsitektur domain bipartit. Sebuah I. sakaiensis PETase dan MHETase mendegradasi PET untuk tereftalat asam dan etilena glikol. produk samping yang
tidak ditampilkan. b struktur MHETase dengan α / β- hidrolase domain (MHETase Hyd) berwarna salmon dan domain tutup (MHETase tutup) warna biru muda. Disul fi de obligasi ditampilkan sebagai tongkat. c Close-up
pandangan MHETase catalytic triad, lubang oxyanion dan molekul-molekul air di situs substrat mengikat. d A. oryzae FaeB (PDB-ID: 3WMT 24 ), α / β- hidrolase domain (AoFaeB Hyd) di merah merah, tutup domain
(AoFaeB Lid) di cyan. e Close-up pandangan AoFaeB catalytic triad, lubang oxyanion dan molekul-molekul air di situs substrat-mengikat. garis putus-putus menunjukkan ikatan hidrogen, sudut rotasi
berhubungan dengan gambaran itu. Berinteraksi residu ditampilkan sebagai tongkat dan diwarnai oleh jenis atom. Karbon - seperti yang diberikan untuk molekul masing-masing; nitrogen - biru; oksigen - merah;
belerang - kuning. oksigen air ditampilkan sebagai bola hijau. Kalsium ditampilkan sebagai bola ungu

2 KOMUNIKASI ALAM | (2019) 10: 1717 | https://doi.org/10.1038/s41467-019-09326-3 | www.nature.com/naturecommunications

KOMUNIKASI NATURE | https://doi.org/10.1038/s41467-019-09326-3
PET-merendahkan esterase, PETase dari I. sakaiensis menunjukkan aktivitas yang
lebih tinggi pada suhu kamar dan PET sangat kristal 10 .
Sebaliknya, struktur I. sakaiensis MHETase, enzim kedua - dan penting untuk
degradasi PET penuh - masih belum diketahui. MHETase awalnya ditugaskan untuk
keluarga enzim tanase, yang termasuk Blok X dari α / β- enzim hidrolase kali lipat
klasifikasi fi ed dalam database ESTHER 10 . 22 . Keluarga ini termasuk jamur dan
tannases bakteri dan esterase feruloyl. signi lainnya fi tannases bakteri cantly berbeda
dapat ditemukan di sebuah berbeda Blok H (Tannases_bact) dalam database ini.
Secara konsisten, MHETase terbukti secara eksklusif menghidrolisis MHET tapi tidak
BHET, PET, p- nitrophenyl (PNP) ester alifatik atau senyawa ester aromatik seperti etil
gallate dan etil ferulate yang dikonversi oleh enzim lain dari keluarga tanase,
menunjukkan substrat tertentu yang sangat terbatas fi kota 10 . Semua enzim
plastik-merendahkan diketahui sejauh menampilkan α / β- lipat hidrolase. MHETase,
bagaimanapun, adalah mungkin untuk memiliki perancah belum pernah terjadi
sebelumnya untuk enzim merendahkan plastic-. Hal ini dapat dimanfaatkan dalam
rangka meningkatkan katalisis dan untuk memperluas substrat spesifik fi kota dan
dengan demikian signi fi cantly muka enzimatik degradasi polimer plastik.
Di sini, kami menyajikan struktur kristal I. sakaiensis PETase, MHETase dan
MHETase terikat substrat analog nonhydrolyzable (MHETA) atau asam benzoat.
Sebuah pemetaan berbasis struktur situs aktif dengan mutasi dan studi mengikat
dengan substrat yang berbeda digunakan untuk menentukan dasar molekuler untuk
penghambatan produk dan dipandu pengembangan MHETase varian dengan
aktivitas ditingkatkan terhadap MHET atau bahkan substrat tertentu diubah fi kota
menuju BHET. Kami mengantisipasi data kami untuk signi fi cantly memajukan
pemahaman saat enzim merendahkan poliester sintetik syn.
hasil
Struktur dan filogeni dari I. sakaiensis MHETase. Kami telah menentukan
struktur kristal rekombinan dan puri fi ed I. sakaiensis MHETase dalam bentuk
ligan-bebasnya (2,05 resolusi Å), MHETase terikat dengan nonhydrolyzable
mono (2hydroxyethyl) tereftalamida (MHETA, 2,1 resolusi Å) atau asam
benzoat (BA, resolusi 2,2 Å) serta ligan bebas PETase ( resolusi 2,0 Å)
(Gambar Tambahan. 1, 2a - f, Tambahan Tabel 1). Struktur PETase
diselesaikan dengan penggantian molekul (MR) menggunakan koordinat
struktural T. fusca cutinase TfCut2 (entry 4CG1 PDB 11 . 23 ; lihat Metode).
Struktur MHETase diselesaikan dengan pipa MR menggunakan struktur
feruloyl esterase baru-baru ini (PDB masuk 6G21, lihat Metode). Arsitektur
domain keseluruhan dari 65 kDa MHETase menyerupai esterases feruloyl,
dengan domain tutup disisipkan di antara β- untai 7 dan α- helix 15 dari α / β- hidrolase
kali lipat (Gambar. 1 b, Tambahan Gambar. 1).
Seperti diamati sebelumnya untuk esterases feruloyl, kehadiran situs pengikatan
kalsium struktural adalah con fi rmed oleh X-ray fl spektroskopi uorescence untuk MHETase bagian dari α / β- domain hidrolase, substrat spesifik fi kota hampir secara
(Gambar. 1 b, Tambahan Gambar. 2b). Demikian juga, salah satu dari fi ve disul fi de obligasi eksklusif diberikan oleh domain tutupnya (Gbr. 2 a, b). kontak hidrofobik antara
adalah fl Anking triad catalytic (dibentuk oleh S225, H528, D492) dan lubang oxyanion
terdiri dari atom nitrogen backbone amida dari G132 dan E226 (Gambar. 1 c) 24 .
Dalam struktur ligan bebas dari MHETase, beberapa molekul air dipelihara
oleh jaringan ikatan hidrogen di substratebinding situs (Gambar. 1 c). Selagi α / membuat kontak ke R411, yang diadakan di tempat oleh S416, S419 dan
β- domain hidrolase super membebankan baik dengan yang paling dekat
struktural dicirikan feruloyl esterase homolog FaeB dari A. oryzae ( 1,60 Å
rmsd untuk 280 dari 342 residu selaras, 32,5% identitas asam amino), domain
tutup MHETase berisi beberapa loop tambahan yang nyata berbeda dari FaeB
(2,33 Å rmsd untuk 148 dari 215 residu selaras, 18,9% identitas) (Gambar . 1 b,
d) 24 . Struktur keseluruhan MHETase dan FaeB secara struktural mirip (2.04 Å
rmsd untuk 421 dari 559 residu selaras) meskipun relatif rendah
KOMUNIKASI ALAM | (2019) 10: 1717 | https://doi.org/10.1038/s41467-019-09326-3 | www.nature.com/naturecommunications
ARTIKEL
jumlah identitas asam amino (27,5%). Ketika membandingkan MHETase dengan
struktur tanase dikenal, misalnya tanin asil α / β-
hidrolase dari Lactobacillus plantarum ( LptE), jelas bahwa hanya lipatan
keseluruhan α / β- domain hidrolase mirip (2,77 Å rmsd untuk 195 dari 282
residu selaras, 13,8% identitas), sedangkan perbedaan yang sangat besar
(5.24 Å rmsd) diamati untuk domain tutup (Tambahan Gambar. 3a, b) 25 . PETase
dan MHETase hanya berbagi α / β- hidrolase kali lipat (2,87 Å rmsd untuk 184
dari 262 residu selaras;. Tambahan Gambar 3c).
Sebuah kelompok analisis filogenetik MHETase dengan esterases feruloyl
dan tannases dari Blok X dalam database ESTHER. Terletak di cabang tanpa
struktur lain (Tambahan Gambar. 4). Struktur dari kerabat MHETase terdekat
yang 3WMT dan 6G21, dua esterase feruloyl dari Aspergillus oryzae.
Dengan mereka, saham MHETase tidak hanya katalitik triad S225- H528-D492
(3WMT: S203-H457-D417, 6G21: S169-H421-D381) tetapi juga G132 (G125, G91)
sebagai bagian dari lubang oxyanion dan C224-C529 (C202-C528, C168-C422),
yang disul fi de obligasi memegang residu katalitik Ser dan bersama-sama Nya 24 . Semua
residu ini berada dalam domain katalitik, disul yang fi de obligasi khas (> konservasi
80%) untuk keluarga tanase di Blok X α / β-
hidrolase sesuai dengan database ESTHER (Gambar. 1 b - e) 22 . 24 .
Domain tutup esterases feruloyl menampilkan yang sama α-
lipat heliks, tetapi urutan asam amino tidak dapat disejajarkan tanpa informasi
struktural. Sebuah saku mengikat - seperti itu untuk MHET di MHETase - juga ada
di esterases feruloyl, tetapi tidak satu pun dari residu lapisan adalah kekal.
Namun, perbandingan MHETase situs aktif dengan yang FaeB mengungkapkan
beberapa residu sekitar triad katalitik yang dapat berkontribusi untuk substrat
posisi dengan cara yang sama (misalnya L235, F354 dan L245, F415 di FaeB
dan MHETase, masing-masing) (Gambar. 1 c, e). Kemungkinan besar, itu adalah
perubahan dalam substrat, terutama kelompok asam karboksilat dari MHET vs
fenolik (metil eter) kelompok dan ikatan rangkap elongating dari ferulates yang
telah menimbulkan perbedaan ini. Substrat dari tannases, misalnya gallates,
lebih mirip setidaknya sehubungan dengan ukuran mereka untuk MHET.
Satu-satunya struktur tanase tersedia di kompleks dengan etil gallate adalah dari Lactobacillus
plantarum ( 4J0K), yang termasuk keluarga tanase bakteri di Blok H dari α / β-
hidrolase sesuai dengan database ESTHER 22 . 25 . The tanase domain katalitik
yang suf fi sien dilestarikan, sehingga catalytic triad superimposes baik.
Namun, urutan berbeda sangat, disul yang fi de obligasi hilang dan domain
tutupnya memiliki lipatan yang sangat berbeda.
Struktur MHETase terikat dengan ligan nonhydrolyzable. Utama rantai
konformasi dalam struktur kompleks MHETase-MHETA hampir identik dengan
MHETase tanpa substrat (rmsd 0,54 Å) dan menyoroti posisi MHET untuk
katalisis. Sementara katalitik triad dan lubang oxyanion residu merupakan
cincin fenil dari MHETA dan α / β- domain hidrolase dibatasi untuk terutama
F495, dan untuk G132 tingkat yang lebih rendah dan A494. Mencolok,
MHETA erat terikat oleh residu domain tutup F415, L254 dan W397 sekitarnya
hampir seluruh MHETA fenil bagian. Dua oksigen dari karboksilat bebas
amida tulang punggung G258, yang mempertahankan jaringan ikatan
hidrogen melibatkan tiga molekul air.
Meskipun secara keseluruhan kesamaan yang tinggi, perbandingan rinci struktur
MHETase dalam ketiadaan dan kehadiran substrat mengungkapkan induced- fi Mekanisme
t pada MHETA mengikat (Gambar. 2 c, d). Dalam struktur ligan bebas, F415
menunjuk jauh dari
3
ARTIKEL KOMUNIKASI NATURE | https://doi.org/10.1038/s41467-019-09326-3

Sebuah b

c d e

Gambar. 2 Struktur dari I. sakaiensis MHETase terikat dengan analog MHET nonhydrolyzable. struktur menjelaskan substrat tertentu fi kota dan mengungkapkan induced- fi t substrat mengikat modus. Sebuah Co-struktur
MHETase terikat MHETA (kuning), α / β- hidrolase domain (MHETase Hyd) di orange, tutup domain (MHETase Lid) warna biru laut. Inset, kiri bawah - kembali fi ned F HAI - F C- menghilangkan peta kerapatan elektron
(hijau) berkontur di 3 σ untuk MHETA. MHETA dari re fi ned
fi Struktur nal ditampilkan sebagai tongkat. b Close-up pada MHETA (kuning) terikat pada situs aktif dari MHETase. c, d permukaan molekul MHETase situs aktif c tanpa dan d dengan terikat MHETA,
catalytic triad dan F415 ditampilkan sebagai tongkat. e Close-up pandangan asil tanin α / β- situs aktif hidrolase dari
L. plantarum ( PDB-ID: 4J0K 25 ) terikat etil gallate (EthGal, kuning), ditumpangkan pada helix α 5 dari MHETase (tidak ditampilkan). α / β- Hidrolase domain (LptE Hyd) di zaitun, tutup domain (LptE Lid) warna biru gelap.
simbol rotasi menunjukkan pandangan relatif Sebuah. skema warna untuk berinteraksi residu dan oksigen air seperti pada Gambar. 1 . Kalsium ditampilkan sebagai bola magenta

situs aktif dan dengan demikian membuka untuk substrat mengikat. Asosiasi dari yang MHETase seperti yang ditunjukkan untuk PETase-1- (2-hidro
MHETA kemudian memicu dekat rotasi 180 ° dari rantai samping F415 sekitar χ xyethyl) 4-metil tereftalat (HEMT) dan p- nitrophenol (PNP) co-struktur
1, menutup situs aktif dan mengkonsolidasikan interaksi. (Tambahan Gambar 5 a - c). Khususnya untuk PETase, tidak adanya domain
tutup membatasi jumlah residu yang terlibat dalam pengakuan substrat
Terakhir, tidak seperti PETase, MHETase mengikat substrat yang sangat erat segera turun ke empat.
dengan K m 7,3 pM 17 . Perbandingan permukaan molekul aktif-situs LptE, PETase
dan MHETase di negara-negara substrat terikat mereka menggambarkan Terutama bagian fenil dari HEMT dan juga pnp terikat oleh kontak
aksesibilitas pelarut yang lebih tinggi dari LptE dan PETase, yang sebagian terkait hidrofobik dari Y85, M132, W156 dan I179, tetapi metil ester atau hidroksil
dengan induced- fi Mekanisme t diamati untuk MHETase dan jumlah residu kelompok dalam 4-posisi HEMT atau PNP, masing-masing, sepenuhnya
menghubungi substrat masing-masing (Gambar. 2 c, d, Tambahan Gambar 5 a - d). terkena pelarut massal ( tambahan Gambar 5 a - c). Singkatnya, kompleksitas
pengakuan substrat oleh MHETase jelas membedakannya dari enzim lain,
seperti tannases atau bahkan PETase.
Posisi substrat di situs aktif dari MHETase mengingatkan pada asil tanin α /
β- hidrolase dari L. plantarum Terlepas dari seluruh substrat, bahkan substrat sub-struktur dan analog seperti
terikat etil gallate (LptE) tetapi menampilkan ditandai perbedaan sehubungan asam benzoat atau asam nikotinat yang mampu mengikat erat MHETase seperti yang
dengan residu menghubungi substrat pada antarmuka (Gbr. 2 b, e). Dalam diamati dalam costructure masing-masing dan dalam pemindaian diferensial fl uorimetry
struktur LptE, gugus fenil etil gallate secara eksklusif dihubungi oleh I206 dan (DSF) KASIH ukur yang (Tambahan Gambar 6a, Gambar. 3 ). Hal ini lagi terutama
G77 dari α / β- tutupnya residu domain, yang menetapkan kontak ke asam benzoat dan
hidrolase domain sedangkan tiga kelompok hidroksil yang hydrogen terikat D421 menempatkannya di posisi identik sebagai MHETA (Tambahan Gambar 6b).
dari α / β- domain hidrolase dan untuk K343 dan E357 dari domain tutup. Dengan
demikian, kontribusi dari LptE tutup domain ke substrat mengikat jauh berkurang,
dibandingkan dengan situasi di MHETase. Perbandingan potensi MHETase ligan dengan variasi terbatas oleh DSF
con fi rms yang kelompok fungsional diakui oleh situs pengikatan MHETase
(untuk pengendalian kualitas ligan, lihat Tambahan Gambar 7a - f). analisis
struktural kami menunjukkan bahwa R411 memaksa muatan negatif ketat
spektrum ligan MHETase dan implikasi untuk situs aktif. diperlukan di posisi 4 dengan ikatan ester dihidrolisis, yang jelas
Posisi substrat-pengikatan PETase fundamental berbeda

4 KOMUNIKASI ALAM | (2019) 10: 1717 | https://doi.org/10.1038/s41467-019-09326-3 | www.nature.com/naturecommunications

KOMUNIKASI NATURE | https://doi.org/10.1038/s41467-019-09326-3 ARTIKEL

- -
TIDAK 2 TIDAK 2 TIDAK 2
2 N OH OO OH OH OO NO 2

2 N
OO O NH
NOH thiophenolate
HAI - HAI S- S
9 10
OH
Sebagian negatif (RNO 2-)
1 2 5 6
fenolat

OO HN O OO
HAI - HAI -

SOO O Sebagai OH
OH OH
Netral Amida Ester 3 4 Negatif, sp 3 ( RXO
Nitrocompounds TIDAK 2 3-)
OOOO
arsonates
7 8 sulfonat 11 12

HAI HAI - HAI HAI - HAI HAI -

oleh ligan

Bermuatan negatif,

fenolat Negatif, sp 3 13 14 15
-
8 HAI HAI HAI - HAI HAI -

7 Negatif, sp 2
T m - T m ( ligan bebas) di K

TIDAK
6

-
OO
5
16 17 18
HAI HAI - HAI HAI - HAI HAI -
4

2 OH
HN O OO

19 OH 20 OH 21
-10
0 5 10 15 20 Negatif, sp 2 ( RCO 2-)
jumlah ligan Stabilisasi karboksilat

Gambar. 3 scanning diferensial fl uorimetry dari MHETase dengan berbagai ligan. Stabilisasi MHETase tipe liar yang diukur dengan peningkatan suhu leleh ( T m) dibandingkan dengan protein ligan bebas ( T m,
ligan-free) jelas tergantung pada kelompok fungsional, yang mengikat ke belakang situs substrat mengikat. kelompok fungsional netral (abu-abu) mempengaruhi T m terlemah, kelompok sebagian negatif
(kuning) lemah, bermuatan negatif kelompok lebih kuat, tergantung pada geometri mereka: sedang tetrahedrally terkoordinasi (oranye) dan planar trigonal paling kuat (merah). Ligan diencerkan ke 10mm

fi Konsentrasi nal (diamond penuh). Sebuah solusi jenuh (dengan 43,5% DMSO) diencerkan 2,2 kali lipat, jika senyawa tidak sepenuhnya larut (kotak). Untuk senyawa menghambat pengukuran
diandalkan oleh penyerapan (4-nitrofenol, 4-nitrothiophenol, asam 2-hidroksibenzoat) atau fl uorescence (BHET) 1 mM fi Konsentrasi nal digunakan (diamond kosong). T m nilai-nilai yang dilaporkan
sebagai disediakan oleh perangkat lunak Prometheus (maksimum kemiringan untuk saya 330 nm / saya 350 nm perbandingan). Percobaan dilakukan sebagai pengukuran tunggal. Ligan penomoran
ditunjukkan pada Tambahan Tabel 3

menjelaskan mengapa diesters dan diamides tidak menunjukkan mengikat Fungsi asam substrat adalah tambahan con fi rmed oleh aktivitas tes dengan
MHETase. BHET mengikat demikian dikecualikan dan MHET hanya akan R411A varian dan R411Q. mutan menunjukkan peningkatan yang kuat K m dan
mengikat dalam orientasi yang tepat tetapi tidak dengan kelompok hidroksietil beberapa penurunan tingkat turnover terhadap MpNPT (Gambar. 4 Sebuah).
dimakamkan di saku substrat (Gambar. 2 b). kelompok nitro dapat mengikat lemah Selanjutnya, R411A dan R411Q mutasi hampir sepenuhnya menghapuskan
ketika sebagian dibebankan sebagai struktur resonansi dengan fenolat atau konversi substrat alami MHET (Gambar. 4 b). Jika hidrogen bon- d substrat
kelompok thiophenolate. bermuatan negatif kelompok tetrahedral (sp 3) seperti karboksilat untuk S416 atau S419 juga dihapuskan pada mutan ganda, K m kenaikan
dalam asam sulfonat dan arsenik dapat mengikat MHETase tetapi jelas lebih lanjut sampai sekitar 1000 kali lipat selama tingkat tipe liar (Gambar. 4 Sebuah).
mengungguli oleh planar (sp 2) kelompok karboksilat (Gambar. 3 ). Akibatnya, Dengan demikian, pengakuan substrat sangat bergantung pada cincin
hilangnya muatan positif di MHETase R411Q dan R411A varian mengarah ke aromatik serta fungsi karboksilat dari MHET baik membimbing posisi untuk
sangat berkurang substrat mengikat dan penurunan penghambatan oleh benzoat hidrolisis. percobaan inhibitor dengan derivatif benzoat dan R411 dan S416
di mono-4-nitrophenyl terephthalate (MpNPT) hidrolisis (Tambahan Gambar 8, mutan juga menunjukkan pentingnya interaksi antara bagian karboksilat ligan
Tambahan Tabel 2). dan R411 bersama-sama dengan ikatan hidrogen untuk ketat mengikat
(Tambahan Tabel 2).

Pengaruh mutan MHETase dan generasi aktivitas BHETase. Peran sentral Tinggi af fi nity untuk senyawa dengan substruktur benzoate diperkirakan menyebabkan
R411 dalam mengkoordinasikan karboksilat yang penghambatan produk dengan membentuk TPA saat

KOMUNIKASI ALAM | (2019) 10: 1717 | https://doi.org/10.1038/s41467-019-09326-3 | www.nature.com/naturecommunications 5

ARTIKEL KOMUNIKASI NATURE | https://doi.org/10.1038/s41467-019-09326-3

Sebuah

18

tingkat perputaran MpNPT (s -1)

K m dari MpNPT ( μ M)
16

14
1000
12

10
10 100
68

R411A_S416G_S419G

R411A_S416G_F424N

R411A_S419G_F424N
24
nd
nd 0.1 1
0

R411Q_S416G
R411A_S416G

R411A_S419G

R411Q_S416A
H528A W397A

S416A_S419G

S419G_F424N

F424N_H467N
R411A_S416A
R411A R411Q

F415H_F424N

S416A_F424N
L254N_F424N
S416A S416G
S225A D492A

S419G F424A

F424N H488A
F424S F424Q
wt

F415A F415H

F495A

b c 0,14
25

0,12
20
tingkat perputaran BHET (s -1)
tingkat perputaran MHET (s -1)

0.10

15 0,08

0,06
10

0,04
5
0.02

0 0.00
wt

wt
H488A
W397A

R411Q
R411Q

S416G
S419G
S416G
S419G

F424S
F495A

R411A

F424Q
D492A
H528A

R411A

F424Q

S225A

S416A

F424N
S225A

F415H
S416A

F424N

F424A
F415A

R411A_S416G

R411Q_S416G
R411A_S419G
R411Q_S416A

R411A_S416G
R411A_S419G
R411Q_S416A
R411Q_S416G

F424N_L254N
S416A_S419G

S419G_F424N

F424N_H467N
R411A_S416A

R411A_S416A

S416A_F424N

F415H_F424N

R411A_S416G_S419G

R411A_S419G_F424N
R411A_S416G_F424N
Gambar. 4 sifat katalitik dari MHETase aktif-situs mutan. Sebuah Kinetika konversi MpNPT. Omset tingkat (ungu y axis dan bar) dan K m
(hitam y axis dan bar) ditentukan dengan pengukuran aktivitas di berbagai konsentrasi substrat pada 25 ° C dengan mutan aktif-situs yang berbeda ( x- sumbu). Lihat metode untuk fi Prosedur tting. b Omset
MHET. c Omset BHET dengan mutan yang dipilih. Tingkat turnover di b dan c ditentukan oleh quanti fi kation produk hidrolisis melalui analisis HPLC dan mewakili nilai rata-rata. Kesalahan bar
menunjukkan standar deviasi dari tiga ulangan dalam pengukuran tersebut. nd: K m untuk ini aktif-situs mutan tidak dapat ditentukan

konsentrasi yang lebih tinggi dari MHET yang dihidrolisis in vitro. Hal ini Sementara mutasi ini bisa menjadi kerugian bagi bakteri dalam lingkungan
ditunjukkan oleh tingkat penurunan reaksi untuk MHET hidrolisis dari waktu ke alam di mana konsentrasi substrat rendah diharapkan, hal ini menguntungkan
waktu (Tambahan Gambar 9a). Efek inhibisi produk kemungkinan kurang untuk aplikasi bioteknologi berjalan pada konsentrasi substrat sekitar 10 5- kali lipat
menonjol di lingkungan alam di mana terbentuk TPA dimetabolisme oleh lebih tinggi dibandingkan
bakteri. Seperti MHETase sebelumnya tidak biokimia dicirikan detail, suhu K m - yang di kisaran 100 mM.
dan pH pro fi les juga dicatat (Tambahan Gambar 9b-c). Dengan kegiatan yang Alasan struktural untuk aktivitas MHETase tinggi terhadap MHET ( k kucing 11,1 ± 1,4 s - 1)
tinggi dari pH 6,0-9,5, enzim berlaku pada rentang pH yang luas. Kegiatan dan aktivitas yang sangat rendah terhadap BHET ( k kucing 0,0011 ± 0,0002 s - 1) belum
meningkat dengan meningkatnya suhu hingga 44 ° C setelah enzim yang dijelaskan sebelumnya (Gambar. 4 b,
cepat tidak aktif. c) 10 . Dalam cahaya data struktural kami, kami mengantisipasi modi yang fi kation
di bagian distal dari saku mengikat yang memediasi interaksi elektrostatik
dengan karboksilat MHET mungkin memberikan aktivitas terhadap BHET.
Sementara residu dari catalytic triad yang veri fi ed dengan tes aktivitas Mencolok, S416A dan S419G mutan mempertahankan aktivitas MHETase dan
dengan mutan alanin masing, omset tinggi tidak berubah dari H488A aturan mengizinkan konversi BHET ke TPA yang dapat dijelaskan oleh peningkatan fl fleksibilitas
keluar kehadiran tetrad katalitik di MHETase (Gambar. 2 b, 4 a, b) 24 . Pentingnya dari R411 di mutan memungkinkan BHET mengikat (Gambar. 4 c). Juga,
F495 untuk substrat mengikat digarisbawahi oleh signi fi tidak bisa menurunkan memberikan lebih banyak ruang di situs aktif dalam dan pengenalan mitra ikatan
tingkat turnover dari substrat alami MHET dan substrat MpNPT kromogenik hidrogen potensial yang diberikan oleh F424Q varian dan F424N signi fi cantly
dengan mutan alanin masing (Gambar. 4 a, b). Kegiatan pada konsentrasi meningkatkan omset BHET oleh MHETase (Gambar. 2 b, 4 c). Penghapusan
substrat tinggi meningkat dengan varian W397A dengan mengorbankan muatan positif di R411A varian dan R411Q juga memungkinkan signi fi cantly
sebuah af substrat yang lebih rendah fi nity (Gambar. 4 a, b). omset yang lebih tinggi dari BHET. ketika ini

6 KOMUNIKASI ALAM | (2019) 10: 1717 | https://doi.org/10.1038/s41467-019-09326-3 | www.nature.com/naturecommunications

KOMUNIKASI NATURE | https://doi.org/10.1038/s41467-019-09326-3
mutasi selanjutnya dikombinasikan dengan mutasi pada S416 dan S419, omset BHET
dapat ditingkatkan 120 kali lipat dibandingkan dengan tipe liar (Gambar. 4 c).
Terakhir, tipe liar MHETase dan varian S416A F424N dan R411A S419G
F424N, yang memiliki aktivitas BHETase, juga diperiksa untuk kegiatan terhadap
coumaric acid methyl ester, caffeic acid methyl ester, asam klorogenat dan p- hidroksi bangunan polimer dengan kimia hijau.
benzoat asam metil ester, substrat untuk feruloyl dan chlorogenate esterase. Tidak
ada aktivitas di atas latar belakang (tidak ada enzim) dapat dideteksi.
Diskusi
Mikroba degradasi dan metabolization dari PET - dan degradasi MHET
intermediate - sebagai sumber karbon dan energi hanya datang baru-baru ini di
lingkungan. Untuk memahami karena asal usul evolusi MHETase sangat relevan
untuk enzimatik degradasi plastik pada umumnya 10 . 18 . kelompok analisis
filogenetik MHETase dalam keluarga tanase dari α / β- enzim hidrolase kali lipat
(Tambahan Gambar 4). Kerabat terdekatnya bertindak pada substrat ferulate
lebih besar sedangkan gallate lebih mirip adalah substrat tannases lebih jauh
terkait. Apakah MHETase berasal dari esterase feruloyl atau tanase leluhur tidak
dapat dijawab belum. substrat tanase khas seperti cinnamoates hidroksi benzoat
dan hidroksi yang tidak dikonversi oleh MHETase (seperti yang ditunjukkan
sudah 10 ) atau oleh MHETase varian dengan aktivitas BHETase yang kita
direkayasa dan disajikan di sini.
Hasil struktural kami di MHETase identifikasi fi ed domain tutup sebagai
perbedaan besar bagi tanase dan feruloyl esterases terkait erat (Gambar. 1 b - e).
Menariknya, itu sudah menunjukkan bahwa switch utama dalam fungsi enzim
mungkin terjadi selama evolusi alam melalui lingkaran penyisipan, penghapusan
atau rekombinasi 26 . Untuk tujuan ini, hasil kami menunjukkan bahwa MHETase
mungkin berasal memang dari modi lingkaran fi kation dalam domain tutup
mengarah ke aktivitas yang dilaporkan terhadap MHET hidrolisis meskipun tidak
ada tanase homolog atau feruloyl urut esterase bisa diidentifikasi fi ed di I.
sakaiensis genom. Khususnya, loop ini menganugerahkan tertentu penting fi kota
untuk para- gugus karboksi dari substrat (Gambar. 3 ). Spesialisasi ini untuk
MHET substrat alami juga menjelaskan aktivitas yang sangat rendah MHETase
terhadap BHET antara dalam enzim tipe liar. Dalam lingkungan alam, aktivitas
yang hilang terhadap BHET tidak penting sebagai enzim hulu, PETase, sudah
menghidrolisis BHET ke MHET 10 .
Struktur MHETase merupakan langkah kunci dalam memahami proses
mikroba degradasi PET di
I. sakaiensis. analisis struktural dan mutasi kami menjelaskan pengakuan
substrat menggunakan induced- fi Mekanisme t dan diaktifkan fi pertama
perubahan struktur-dipandu substrat speci-
fi Kota MHETase. Kami dengan demikian berhasil dalam menghasilkan varian
MHETase, yang menghidrolisis produk PETase MHET dan BHET ke blok
bangunan yang sangat, yang dibutuhkan untuk re-sintesis berkelanjutan dari
polimer polyethylene terephthalate. kontras konsensus α / β- hidrolase, arsitektur
bipartit dari MHETase bagian katalisis dari pengakuan substrat - sebuah skenario
di mana kita membayangkan domain tutup sebagai platform merdu untuk
meningkatkan sifat katalitik (misalnya mengurangi substrat rilis) atau mengubah
substrat spesifik fi kota (seperti yang ditunjukkan pada awalnya untuk S416A,
R411Q atau mutan F424N dilaporkan di sini).
Dengan struktur MHETase tersedia, wawasan rinci kami ke mekanisme dan
khususnya generasi dari BHETase dengan diubah substrat tertentu fi kota,
sekarang akan mungkin untuk secara rasional menciptakan lebih banyak ef fi sien
MHETase varian membelah produk degradasi parsial lainnya dari polimer terkait.
Mengganti TPA di PET oleh thiophen-, asam furan- atau piridin-dikarboksilat telah
lama digambarkan 27 . Bertukar ester karboksilat dengan ester sulfonat pada polimer
ini juga memungkinkan 28 . Poliester dari 2,5-
KOMUNIKASI ALAM | (2019) 10: 1717 | https://doi.org/10.1038/s41467-019-09326-3 | www.nature.com/naturecommunications
ARTIKEL
furandicarboxylate dengan etilena glikol (PEF) atau alkohol lainnya yang cocok untuk
menggantikan PET dalam botol 29 . PEF plastik baru ini dapat terdegradasi oleh PETase 19
. Produk hidroksietil-2,5-furandicarboxylate cukup mirip dengan MHET untuk
membayangkan mutagenesis structureguided dari MHETase berkembang suatu “ MHEFase
” untuk siklus penuh dari karbohidrat terbarukan untuk PEF dan kembali ke blok
Potensi penggunaan MHETase di daur ulang tersebut poliester alternatif
menggarisbawahi kebutuhan untuk memahami dan menyesuaikan mengikat substrat
yang berbeda. Dengan demikian kita mengantisipasi bahwa karakterisasi struktural
yang luas dan awal tion modulasi rasional MHETase substrat spesifik fi kota
menyediakan titik awal yang sangat baik untuk pengembangan tailor-made, sistem
degradasi PET enzimatik berdasarkan perancah MHETase dan dalam kombinasi
dengan PETase.
metode
Reagen. PET diperoleh dari botol komersial. Semua bahan kimia lainnya dibeli di kemurnian
tertinggi dari Sigma-Aldrich, Carl Roth, Alfa Aesar atau Acros jika tidak dinyatakan lain.
Sintesis ligan dan substrat. Identitas dan kemurnian semua senyawa disintesis adalah veri fi ed oleh
NMR. 1 Spektrum H diukur dalam DMSO-d 6 pada Bruker Avance II 300 dilengkapi dengan 5 mm
PABBO BB-1H / D Z-GRD Z104275 / 0398 probehead pada 25 - 28 ° C (Gambar. S7a-f). Untuk
kalibrasi pengukuran tetrametilsilan digunakan.
Bishydroxyethyl terephthalate (BHET): BHET disintesis dari botol PET dengan alkoholisis dengan
etilena glikol. Dua puluh gram PET dan 0,2 g anhidrat natrium asetat re fl uxed di 120 mL etilena glikol
selama 8 jam dan setelah itu didinginkan semalam. 120 mL H 2 O ditambahkan dan fi filtrasi dilakukan
pada 4 ° C. Produk dicuci dengan 20 mL dingin H 2 O dan diekstraksi beberapa kali dengan hot H 2 O.
BHET muncul sebagai jarum putih (18 g (68%), Mp 210 - 212 ° C).
Bishydroxyethyl amida asam tereftalat (BHETA): BHETA disintesis dari PET oleh aminolysis
dengan etanol 2-amino. Dua puluh gram PET dan 0,2 g anhidrat natrium asetat re fl uxed di 120 mL
etanolamin selama 8 jam dan setelah itu didinginkan semalam. 120 mL H 2 O ditambahkan dan fi filtrasi
dilakukan pada 4 ° C. Produk dicuci dengan 20 mL dingin H 2 O dan direkristalisasi dua kali dengan 100
ml air panas H 2 O. BHETA muncul sebagai ringan naik jarum (20 g (76%), Mp 240 - 243 ° C).
Dimetil tereftalat (DMT): DMT disintesis oleh Esteri fi kasi tereftaloil klorida dengan metanol. 25
mmol tereftaloil klorida direaksikan dengan 30 mL methanol di RT dan kemudian kembali fl uxed selama
3 jam. Setelah penyulingan metanol dan pengeringan pada suhu 60 ° C, 4,08 g diperoleh (Mp 144 - 148
° C). Mencuci dengan 0,5 M KOH dan air tidak mengubah titik leleh.
Monohydroxyethyl terephthalate (MHET): MHET disintesis dari BHET oleh hidrolisis parsial dengan KOH.
8,7 mmol BHET direaksikan dengan 8,4 mmol KOH di 18 mL MgSO 4- dikeringkan ethylene glycol pada 110 - 130
° C selama 2,5 jam. Tiga puluh mililiter H 2 O ditambahkan dan campuran diekstraksi tiga kali dengan 5 mL
CHCl 3. Fase berair disesuaikan dengan pH 3 dengan 25% HCl dan fi disaring pada suhu 4 ° C. Setelah dua
langkah ekstraksi dengan 30 mL panas H 2 O dan fi filtrasi pada 4 ° C, endapan dikeringkan pada 60 ° C (0.56 g
(30%), Mp 185 - 190 ° C).
Monohydroxyethyl amida asam tereftalat (MHETA): MHETA disintesis oleh amidasi parsial
tereftaloil klorida dengan etanolamin. 150 mmol NaOH dan 50 mmol etanolamin di 50 mL H 2 O
ditambahkan tetes demi tetes dalam 1 jam sampai 50 mmol tereftaloil klorida dalam 50 mL H 2 O pada
0 ° C. Reaksi dilakukan selama 2 jam pada 0 ° C dan 2 jam di bawah re fl ux, diikuti oleh panas
fi filtrasi. pH diatur untuk 3 dengan 25% HCl. Suspensi yang diperoleh adalah
fi disaring dingin dan fi menyusup dicuci dengan 20 mL air dingin. Produk direkristalisasi dari 100 mL panas
H 2 O untuk menghasilkan kristal mengkilap (2,4 g (23%), Mp 209 - 212 ° C).
Mono-4-nitrophenyl terephthalate (MpNPT): MpNPT disintesis oleh Esteri fi kasi tereftaloil klorida
dengan 4-nitrophenolate. 50 mmol tereftaloil klorida dan 50 mmol natrium 4-nitrophenolate dihentikan
pada 50 mL dietileter dan bereaksi selama 2 jam pada 0 ° C, kemudian di RT semalam. 2,5 g Na 2 BERSAMA
3
dan 4,5 g NaHCO 3 di 50 mL H 2 O ditambahkan dan bereaksi pada RT selama 10 jam. pH diatur 8,5
dengan NaOH. Fraksi larut selanjutnya diekstraksi dengan total 2,5 g Na 2 BERSAMA 3 dan 2,5 g NaHCO 3 dalam
100 mL H 2 O dan kemudian dicuci sampai pH netral. MpNPT diendapkan dengan HCl pada pH 3 dan
dicuci dua kali dengan 50 mL 0,1 M HCl dan kemudian sampai pH netral. MpNPT dipisahkan
mengkontaminasi tereftalat bis-4-nitrophenyl dengan ekstraksi dengan 100 mM Napi pH 7,4 dan curah
hujan asam. Bubur kuning sangat samar dikeringkan pada 60 ° C (Mp 202 ° C).
Puri fi kation serta kristalisasi dan solusi struktur. I. sakaiensis
PETase (asam amino residu 28 - 290) diperintahkan dari Genscript (Piscataway,
7
ARTIKEL
USA) sebagai gen sintetis kodon-dioptimalkan mengandung C-terminal-Nya 6- tag subkloning ke pET-21b.
Sebuah fragmen DNA encoding kodon-dioptimalkan I. sakaiensis
MHETase (asam amino residu 20 - 603) kloning dalam vektor pUC19 diperintahkan dari Genscript dan
kemudian subkloning menjadi ekspresi plasmid pColdII dengan N-terminal-Nya 6- tag (TAKARA BIO, Inc.,
Otsu, Shiga, Jepang) dengan FastCloning (Tambahan Gambar 11) 30 .
Untuk ekspresi protein, E. coli SHUF fl e T7 mengungkapkan sel (New England Biolabs, Frankfurt,
Jerman) ditransformasikan dengan plasmid dan dipilih pada lysogeny kaldu (LB) pelat agar yang
mengandung 100 μgmL - 1 ampisilin. Setelah semalam pertumbuhan pada 30 ° C, budaya semalam
diinokulasi. Untuk berlebih, 1 L BAF fl ed Erlenmeyer fl meminta mengandung media 200 mL LB dilengkapi
dengan 100 mg mL - 1
ampisilin yang digunakan. Sel-sel tumbuh pada 33 ° C dan 160 rpm gemetar kecepatan untuk densitas
optik pada 600 nm (OD 600) dari 1 sebelum 1 mM isopropil β- D- 1thiogalactopyranoside (IPTG) ditambahkan.
Pada OD 600 2,5, suhu diturunkan menjadi 16 ° C dan berlebih terus semalam. Sel-sel dipanen dengan
sentrifugasi pada suhu 4 ° C, 10.000 × g selama 20 menit dan disimpan pada - 20 ° C sampai digunakan
lebih lanjut.
Sel terganggu oleh sonikasi di 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol dan 1 mM
Dithiothreitol (DTT) (penyangga R). puing-puing sel dibersihkan dengan sentrifugasi. Ekstrak sel dimuat
pada gravitasi fl ow kolom dengan Ni-NTA sepharosa, dicuci dengan penyangga R dilengkapi dengan 20
mM imidazol dan dielusi dengan penyangga R dilengkapi dengan 200 mM imidazol (300 mM imidazol
dalam kasus PETase). fraksi protein yang puri fi ed pada Superdex75 10/300 kolom (GE Healthcare,
Solingen, Jerman) dengan 20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, terkonsentrasi untuk ~ 10 mg mL - 1, fl ash-beku
dalam cairan N 2 dan disimpan pada - 80 ° C. Konsentrasi protein ditentukan secara spektrofotometri
menggunakan ε 280 = 102 955M - 1 cm - 1 ( ε 280 = 97,455M - 1 cm - 1 untuk W397A mutan). Kemurnian sampel
diperkirakan menggunakan software GelAnalyzer (Versi 2010a).
PETase dikristalisasi pada 10 mg mL - 1 konsentrasi dengan duduk difusi uap drop (protein 1 uL
ditambah 1 uL waduk) pada 20 ° C. kristal PETase khas tumbuh pada 20 ° C dengan larutan reservoir
yang mengandung 0,1 M natrium sitrat atau natrium asetat pH 5.0, 15% (v / v) PEG8000 dan 0,5 M lithium
sulfat. MHETase mengkristal pada konsentrasi 10 mg mL - 1 dengan duduk difusi uap drop (protein 1 uL
ditambah 1 uL waduk) pada 20 ° C dengan reservoir yang mengandung 0,1 M HEPES, pH 7,5, 30% (v / v)
2,4-MPD dan 0.12M amonium sulfat (ruang grup P2 1 2 1 2 1)
atau 0,1 M MES, pH 6,5, 10% (v / v) PEG8000 dan 0,1 M seng asetat (ruang grup P1). kristal MHETase
tumbuh dengan MPD adalah cryo-didinginkan dalam larutan waduk mereka. The PETase kristal adalah
cryo-dilindungi dengan 0,1 M natrium asetat, pH 5.0, 10% (v / v) PEG8000, 15% (v / v) PEG400 dan 0,5
M lithium sulfat. P1 MHETase kristal cryo-dilindungi dengan 0,1 M Tris, pH 8,5, 5% (v / v) PEG8000,
20% (v / v) PEG400 dan 0,5 M lithium sulfat. Untuk percobaan derivatisasi, kristal diinkubasi selama 24
jam dalam larutan cryo-pelindung masing-masing jenuh dengan ligan dan fl ash-beku dalam nitrogen cair.
Data difraksi MHETase dikumpulkan pada 100 K di beamlines 14.1 dan 14.2 dari cincin penyimpanan
Bessy II, Berlin, Jerman 31 . Data difraksi PETase dikumpulkan pada beamline P13, PETRAIII, Hamburg 32 . Semua
data difraksi diproses dengan XDS 33 . 34 .
Struktur PETase diselesaikan dengan penggantian molekul menggunakan koordinat struktural T.
fusca cutinase TfCut2 (entry 4CG1 PDB 11 . 23 ). Struktur MHETase dikomplekskan untuk MHETA
diselesaikan dengan penggantian molekul menggunakan pipa MR MoRDa 35 . yang menempatkan enam
salinan model homolog berdasarkan PDB masuk 6G21 (yang tidak dipublikasikan A. oryzae feruloyl
esterase, AoFaeB-2; 26% identitas untuk MHETase dengan cakupan permintaan dari 87%). Struktur
yang dilengkapi selama beberapa putaran re fi nement dengan PHENIX. SARING atau Refmac dalam
kasus PETase 35 . 36 intermitted oleh pengguna Model bangunan dengan Coot yang luas untuk MHETase 37
. Struktur MHETase dikomplekskan ke BA diselesaikan dengan penggantian molekul menggunakan
seluruh unit asimetris dari MHETA co-struktur sebagai model pencarian dan selesai, masing-masing.
The MHETA dan BA ligan ditempatkan ke dalam kepadatan masing-jelas di fi tahap nal re fi nement.
Struktur MHETase P1 ligan bebas diselesaikan dengan struktur menggunakan penggantian molekul
koordinat dari fi nalized MHETase-MHETA co-struktur menghilangkan ligan. Sepuluh salinan MHETase
di unit asimetris dibangun secara manual atau dengan PHENIX.AUTOBUILD dan re fi ned dengan
PHENIX.REFINE 36 .
Generasi mutan MHETase oleh mutagenesis situs-diarahkan. Untuk penciptaan mutan tunggal-situs,
baik Q5 situs-diarahkan mutagenesis kit (New England Biolabs) atau QuikChange ® Metode yang
digunakan. Dalam fi Kasus pertama, kit itu digunakan sesuai dengan produsen ' s petunjuk. Dalam
kasus QuikChange ®
Metode, campuran PCR standar (25 uL) yang terdiri dari 2,5 uL 10 × PFU penyangga (Roboklon GmbH,
Berlin, Jerman), 0,5 uL campuran deoxynucleoside trifosfat (0,25 mM masing-masing), plasmid DNA (~ 40
ng), 1,25 uL maju dan membalikkan primer (10 pM; Tambahan Tabel 4), 1 uL PfuPlus! polimerase
(Roboklon GmbH) dan 18,1 uL air ultra murni yang digunakan. Untuk denaturasi, suhu diadakan pada 95 ° C
selama 30 s. Setelah itu 20 siklus 30 s denaturasi pada 95 ° C, anil selama 30 s pada 63 ° C dan
perpanjangan selama 6 menit pada 72 ° C dilakukan. Dalam langkah terakhir
fi elongasi nal dicapai pada 72 ° C selama 10 menit. Setelah PCR, DNA template yang telah dicerna dengan Dpn Aku
(New England BioLabs) selama 2 jam pada suhu 37 ° C sebelum enzim tersebut tidak aktif pada 80 ° C selama 10
menit. E. coli Sel-sel TOP10 diubah dengan produk PCR yang diperoleh dan berlapis di LB piring agar yang
mengandung 100 mg mL
8 KOMUNIKASI ALAM | (2019) 10: 1717 | https://doi.org/10.1038/s41467-019-09326-3 | www.nature.com/naturecommunications
KOMUNIKASI NATURE | https://doi.org/10.1038/s41467-019-09326-3
- 1 ampisilin dan tumbuh semalam pada 37 ° C. Urutan nukleotida adalah con-
fi rmed oleh sequencing di Euro fi ns (Ebersberg, Jerman).
Autohydrolysis dari MpNPT. Hidrolisis diikuti spektrofotometri pada 400 nm pada 30 ° C. Pada pH
yang lebih tinggi, di mana hidrolisis pergi ke dekat selesai, peluruhan eksponensial adalah fi tted.
Pada pH rendah konstanta peluruhan dihitung dari tarif awal memperhitungkan kemurnian dan
deprotonasi parsial 4-nitrofenol (nilai yang diharapkan pada pH 7,5 adalah 12,420M - 1 cm - 1 dihitung
dengan
ε 405 nm = 18.000 - 1 cm - 1 dan pK a = 7.15 untuk 4-nitrofenol) 38 . Perbedaan penyerapan 4-nitrofenol pada 400
dan 405 nm kurang dari 0,5%. Autohydrolysis diukur dari pH 7,5-12,5 di 100 mM fosfat atau borat
buffer dan solusi NaOH dengan konstan tingkat k 2 = 9.2 M - 1 s - 1 untuk d [MpNPT] / dt = k 2 [ OH -]
[MpNPT], yaitu k 1 = 2,9 × 10 - 6 s - 1 ( Tambahan Gambar 12). Dalam 100 mM Tris pH 7,5, juga digunakan
untuk kinetika enzim, k 1 = 46 × 10 - 6 s - 1 untuk d [MpNPT] / dt = k 1
[MpNPT] ditentukan. sehingga TRIS meningkatkan tingkat hidrolisis ~ 10 kali lipat dibandingkan dengan laju
reaksi yang diharapkan dengan hidroksida pada pH 7,5.
tes aktivitas. Aktivitas diukur untuk substrat MHET dan BHET oleh HPLC dan untuk MpNPT dengan
spektrofotometri. Untuk pengukuran HPLC, reaksi (100 uL) dihentikan dengan penambahan volume yang
sama dari 160 mM Napi (natrium fosfat buffer) pH 2,5 dengan 20% (v / v) dimethyl sulfoxide (DMSO) dan
pemanasan sampai 80 ° C untuk 10 menit. TPA, MHET dan BHET dipisahkan pada Kinetex 5 pM EVO
C18 100 Å, 150 × 4,6 mm (Phenomenex, Aschaffenburg, Jerman) dengan gradien asetonitril dan 0,1% (v
/ v) asam format dalam air pada 30 ° C setelah suntikan 10 uL sampel. Asetonitril itu meningkat dari 5
menjadi 44% sampai menit 12 dan kemudian ke 70% pada menit 15 di mana rasio tetap konstan selama
3 menit. TPA, MHET dan BHET terdeteksi pada 240 nm dan quanti fi kation diwujudkan dengan
menggunakan kurva kalibrasi.
Untuk mengukur tingkat omset MHET dan BHET, reaksi (100 uL) dengan 1 mM substrat di 40 mM
Napi pH 7,5 dengan 80 mM NaCl dan 20% (v / v) DMSO diinkubasi pada 30 ° C sebelum mereka
dihentikan dan dianalisis seperti dijelaskan di atas. MHETase digunakan pada 6 nM selama 30 menit
dalam kasus MHET. Untuk BHET, sebuah penyaringan dengan 6 nM atau 12 varian nM MHETase
digunakan untuk mengidentifikasi enzim berpotensi aktif yang kemudian dianalisis pada konsentrasi yang
lebih tinggi. Sekitar 100 nM dari varian digunakan untuk 19,25 jam dan 3 nM tipe liar MHETase telah
ditambahkan ke reaksi ini untuk konversi penuh dari MHET dibentuk untuk TPA yang quanti fi ed melalui
HPLC. Percobaan diulang tiga kali.
larutan stok MpNPT disiapkan dalam DMSO pada konsentrasi 10, 1 dan
0,1 mM. konsentrasi substrat yang 0,1 - 1200 pM di 100 mM Tris pH 7,5 atau 100 mM Napi pH 7,5.
parameter kinetik yang sama di kedua buffer. Reaksi dalam kuvet 400 uL dimulai pada 25 ° C
dengan penambahan enzim ke
fi Konsentrasi nal dari ca. 1 nM (varian aktif) hingga 500 nM (varian tidak aktif). Perubahan penyerapan
diikuti pada spektrofotometer Cary50 (Varian) pada 400 nm. perubahan penyerapan dikoreksi untuk
hidrolisis nonenzimatik (lihat paragraf sebelumnya). tingkat awal (rata-rata sepuluh kombinasi yang
berbeda dari enzim dan substrat konsentrasi untuk setiap varian) digunakan untuk fi tting K m dan v max
menurut kinetika Michaelis Menten. K saya untuk inhibitor kompetitif diukur pada 30 ° C dan
dihitung dengan Persamaan. ( 1 )
½?
v ¼ v max ½ S = S ½? þ K M 1 þ saya ð1Þ
K saya
menggunakan 4 - 8 substrat yang berbeda (yaitu MpNPT) konsentrasi. tipe liar dan varian S225A,
488A, W397A, F495A, F415A, S416A dan R411Q juga diukur pada 30 ° C. Parameter kinetik
dinormalisasi pada kegiatan-tipe liar pada 25 ° C.
Untuk pengukuran feruloyl dan chlorogenate esterase aktivitas empat substrat yang diuji:
coumaric acid methyl ester (Coum-ME), caffeic acid methyl ester (Caff-ME), asam klorogenat
(Chlorogen) dan p- hidroksi-hidroksi benzoat asam metil ester (PHB-ME). UV - Vis spektrum
menggunakan 10 μ M dari ester dan asam bebas diukur dan Δ ε dihitung (Tambahan Gambar. 10).
Hidrolisis diukur sebagai untuk MpNPT, tapi dengan 10 - 35 enzim nM, 100 pM substrat dan pada 335
nm (Coum-ME, Δ ε = - 6100M - 1 cm - 1), 350 nm (Caff-ME,
Δ ε = - 5700M - 1 cm - 1), 350 nm (Chlorogen, Δ ε = - 7400M - 1 cm - 1) dan 280 nm (PHB-ME, Δ ε = - 3900M - 1 cm - 1).
scanning diferensial fl uorimetry. Untuk analisis ligan mengikat MHETase, DSF digunakan. Percobaan
dilakukan dengan Prometheus NT.48 (NanoTemper, Munich, Jerman). Perangkat ini memiliki fi yang tetap
eksitasi panjang gelombang 285 nm dan emisi panjang gelombang 330 dan 350 nm. MHETase (wt)
selalu digunakan pada 100 μgmL - 1 dalam fi solusi nal. konsentrasi penyangga akhir 100 mM Tris pH 7,5,
150 mM NaCl dengan atau tanpa 20% DMSO. sensitivitas kapiler yang tinggi seperti yang disediakan
oleh NanoTemper digunakan. Suhu berkisar 20 sampai ≥ 80 ° C-scan pada 0,5 K per menit. Ligan
disiapkan dalam solusi saham 21,7 mM dan diencerkan sampai 10 mM fi konsentrasi nal. Solusinya jenuh
(dengan 0 atau 42,5% DMSO) digunakan sebagai stok, jika senyawa tidak sepenuhnya larut. Untuk
senyawa menghambat pengukuran diandalkan oleh penyerapan (4-nitrofenol, 4-nitrothiophenol, asam
2-hidroksibenzoat) atau fl uorescence (BHET) 1 mM fi Konsentrasi nal juga diuji. nilai-nilai tm dilaporkan
sebagai disediakan oleh perangkat lunak Prometheus
KOMUNIKASI NATURE | https://doi.org/10.1038/s41467-019-09326-3
(Maksimum kemiringan untuk saya 330 nm / saya 350 nm perbandingan). Percobaan dilakukan sebagai
pengukuran tunggal.
Urutan keselarasan dan pohon filogenetik. pencarian protein homolog protein MHETase-seperti dilakukan
21. Han, X. et al. wawasan struktural ke dalam mekanisme katalitik dari PET hidrolase.
dengan alat NCBI dasar lokal pencarian keselarasan (BLAST) dalam database ESTHER ( http://bioweb.ensam.inra.fr/
ESTHER / umum? apa = ledakan ) Menggunakan database Block_X.pep 22 . 39 . Beberapa keselarasan urut
dilakukan dengan keselarasan Otot menggunakan MEGA7 40 . Sejarah evolusi itu disimpulkan dengan
menggunakan metode Maximum Likelihood berdasarkan model berbasis matriks JTT 41 . Pohon dengan log
kemungkinan tertinggi ( - 19,562.87) ditampilkan. Pohon awal (s) untuk pencarian heuristik diperoleh secara
otomatis dengan menerapkan Tetangga-Gabung dan BioNJ algoritma untuk matriks jarak berpasangan
diestimasi dengan menggunakan model JTT, dan kemudian memilih topologi dengan unggul nilai log
kemungkinan. Analisis ini melibatkan 32 sekuens asam amino. Semua posisi yang mengandung
kesenjangan dan data yang hilang tersingkir. Ada total 376 posisi di fi dataset nal. analisis evolusioner
dilakukan di MEGA7 40 .
ketersediaan data
koordinat struktur dan data difraksi diendapkan dengan Protein Data Bank ( http://www.pdb.org ) Di bawah kode
aksesi 6QG9 (MHETase), 6QGA (MHETase MHETA), 6QGB (MHETase BA), 6QGC (PETase). Sumber data yang
mendasari Gambar. 3 .
4 ac, dan Angka Tambahan 2a-b, 4, 8, 9a-c dan 10 disediakan sebagai Sumber Data fi le. Data lain yang tersedia dari
penulis yang sesuai atas permintaan yang wajar.
Menerima: 4 Desember 2018 Diterima: 5 Maret 2019
Referensi
1. Kayu, L. Penelitian dan pasar. http://www.businesswire.com/news/home/
20151210005465 / en / Penelitian-Pasar-Global-Polyethylene-TerephtalateMarket-PET (Diakses
16 September 2015)
2. Geyer, R., Jambeck, JR & Hukum, Produksi KL, penggunaan, dan nasib semua plastik yang pernah dibuat. Sci.
Adv. 3, e1700782 (2017).
3. Thompson, RC, Moore, CJ, vom Saal, FS & Swan, SH Plastik, lingkungan dan kesehatan
manusia: konsensus saat ini dan tren masa depan. Philos. Trans. R. Soc. B Biol. Sci. 364, 2153 - 2166
(2009).
4. Hopewell, J., Dvorak, R. & Kosior, E. Plastik daur ulang: peluang tantangan dan. Philos.
Trans. R. Soc. B Biol. Sci. 364, 2115 - 2126 (2009).
5. Eriksen, M. et al. polusi plastik di dunia ' s lautan: lebih dari 5 triliun lembar plastik dengan berat
lebih dari 250.000 ton fl oat di laut. PLoS ONE 9, e111913 (2014).
6. Thompson, RC et al. Hilang di laut: di mana semua plastik? Ilmu 304, 838
(2004).
7. Rochman, CM et al. Kebijakan: mengklasifikasikan sampah plastik sebagai berbahaya. Alam 494,
169 - 170 (2013).
8. Müller, RJ, Schrader, H., Profe, J., Dresler, K. & Deckwer, WD enzimatik degradasi poli (etilena
tereftalat): menghidrolisis cepat menggunakan hidrolase dari T. fusca. Macromol. Cepat
Commun. 26, 1400 - 1405 (2005).
9. Silva, CM et al. Cutinase - alat baru untuk biomodi fi kasi sintetis fi bers.
J. polym. Sci. Bagian A polym. Chem. 43, 2448 - 2450 (2005).
10. Yoshida, S. et al. Sebuah bakteri yang mendegradasi dan asimilasi poli (etilena tereftalat). Ilmu
351, 1196 - 1199 (2016).
11. Roth, C. et al. Studi struktural dan fungsional pada termostabil polyethylene terephthalate
merendahkan hidrolase dari Thermobi fi da fusca.
Appl. Microbiol. Biotechnol. 98, 7815 - 7823 (2014).
12. Ronkvist, Å. M., Xie, W., Lu, W. & Gross, RA Cutinase-katalis hidrolisis poli (etilena
tereftalat). makromolekul 42, 5128 - 5138 (2009).
13. Silva, C. et al. direkayasa Thermobi fi da fusca cutinase dengan peningkatan aktivitas
pada substrat polyester. Biotechnol. J. 6, 1230 - 1239 (2011).
14. Araújo, R. et al. Menjahit aktivitas cutinase terhadap polyethylene terephthalate dan poliamida 6,6 fi bers.
J. Biotechnol. 128, 849 - 857 (2007).
15. Wei, R. et al. Direkayasa hidrolase poliester bakteri ef fi sien menurunkan
polyethylene terephthalate karena penghambatan produk lega. Biotechnol. Bioeng. 113, 1658 - 1665
(2016).
16. Liu, B. et al. Kristalografi protein dan analisis mutagenesis situs-langsung dari poli (etilena
tereftalat) hidrolase PETase dari Ideonella sakaiensis. ChemBioChem 19, 1471 - 1475 (2018).
17. Austin, HP et al. Karakterisasi dan rekayasa dari polyesterase aromatik plasticdegrading. Proc. Natl.
Acad. Sci. Amerika Serikat 115, E4350 - E4357 (2018).
18. Bornscheuer, UT Feeding pada plastik. Ilmu 351, 1154 - 1155 (2016).
KOMUNIKASI ALAM | (2019) 10: 1717 | https://doi.org/10.1038/s41467-019-09326-3 | www.nature.com/naturecommunications
ARTIKEL
19. Fecker, T. et al. Situs aktif fl fleksibilitas sebagai ciri khas untuk ef fi sien PET
degradasi oleh I. sakaiensis PETase. Biophys. J. 114, 1302 - 1312 (2018).
20. Joo, S. et al. wawasan struktural dalam mekanisme molekuler dari poli (etilena tereftalat)
degradasi. Nat. Commun. 9, 382 (2018).
Nat. Commun. 8, 2106 (2017).
22. Lenfant, N. et al. ESTHER, database dari α / β- hidrolase lipat superfamili
protein: alat untuk mengeksplorasi keragaman fungsi. Asam Nukleat Res. 41,
D423 - D429 (2012).
23. Zwart, PH et al. solusi struktur otomatis dengan PHENIX Suite.
Metode Mol. Biol. 426, 419 - 435 (2008).
24. Suzuki, K. et al. Struktur kristal dari esterase feruloyl milik keluarga tanase: a disul fi de obligasi
dekat catalytic triad. Protein Struct. Funct. Bioinforma. 82, 2857 - 2867 (2014).
25. Ren, B. et al. Struktur kristal tanase dari Lactobacillus plantarum. J. Mol. Biol. 425, 2737 - 2751
(2013).
26. Taw fi k, DS loop okulasi dan asal-usul spesies enzim. Ilmu 311,
475 - 476 (2006).
27. Drewitt JGN & Lincoln, J. Poliester dari komponen heterosiklik. paten AS 2551731 (1951).
28. Raja, JF et al. ω- klorida hidroksi-1-alkanesulfonyl. Sulfur fosfor
Relat. Elem. 31, 161 - 175 (1987).
29. Hong, S., Min, K.-D., Nam, B.-U. & Park, OO berat molekul tinggi bio berbasis furan co-poliester
untuk aplikasi kemasan makanan: sintesis, karakterisasi dan polimerisasi solid-state. Hijau
Chem. 18, 5142 - 5150 (2016).
30. Li, C. et al. FastCloning: a sangat menyederhanakan fi ed, puri fi kation bebas, sequence-
dan PCR metode kloning ligasi-independen. BMC Biotechnol. 11, 92 (2011).
31. Mueller, U. et al. Fasilitas untuk kristalografi makromolekul di Helmholtz-Zentrum Berlin. J.
Synchrotron Radiat. 19, 442 - 449 (2012).
32. Cianci, M. et al. P13, yang EMBL makromolekul kristalografi beamline di rendah-daya pancar
PETRA III cincin untuk tinggi dan rendah-energi pentahapan dengan variabel balok fokus. J.
Synchrotron Radiat. 24, 323 - 332 (2017).
33. Krug, M., Weiss, MS, Heinemann, U. & Mueller, U. XDSAPP: antarmuka pengguna grafis untuk
pengolahan nyaman data difraksi menggunakan XDS.
J. Appl. Crystallogr. 45, 568 - 572 (2012).
34. Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66, 125 - 132 (2010).
35. Winn, MD et al. Tinjauan tentang CCP4 suite dan perkembangan saat ini.
Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 67, 235 - 242 (2011).
36. Afonine, PV et al. Menuju otomatis struktur re kristalografi fi nement
dengan phenix.re fi ne. Acta Crystallogr. Sekte. D Biol. Crystallogr. 68, 352 - 367 (2012).
37. Emsley, P., Lohkamp, ​B., Scott, WG & Cowtan, Fitur K. dan pengembangan Coot. Acta
Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 486 - 501 (2010).
38. Zhang, ZY & VanEtten, RL Pra-kondisi mapan dan mantap-negara analisis kinetik dari
molekul rendah phosphotyrosyl berat badan protein fosfatase dari hati sapi. J. Biol. Chem. 266,
1516 - 1525 (1991).
39. Altschul, SF, Gish, W., Miller, W., Myers, EW & Lipman, DJ Basic alat pencarian keselarasan
lokal. J. Mol. Biol. 215, 403 - 410 (1990).
40. Kumar, S., Stecher, G. & Tamura, K. MEGA7: Molecular evolusi analisis genetika versi 7.0 untuk
dataset yang lebih besar. Mol. Biol. Evol. 33, 1870 - 1874 (2016).
41. Jones, DT, Taylor, WR & Thornton, JM Generasi cepat matriks data yang mutasi dari
urutan protein. Comput. Appl. Biosci. 8,
275 - 282 (1992).
Ucapan Terima Kasih
Kami berterima kasih kepada Leonie Graf bantuan eksperimental yang sangat baik. Kami mengakui akses ke
beamlines BL14.1 / 2/3 dari cincin penyimpanan Bessy II (Berlin, Jerman) melalui Joint Berlin MX-Laboratorium
disponsori oleh Helmholtz Zentrum Berlin für Materialien und Energie, Freie Universität Berlin,
Humboldt-Universität zu Berlin, Max-Delbrück Centrum, dan Leibniz-Institut für Molekulare Pharmakologie. Data
PETase dikumpulkan pada beamline P13 dioperasikan oleh EMBL Hamburg pada cincin penyimpanan PETRA III
(DESY, Hamburg, Jerman). Kami ingin mengucapkan terima kasih Isabel Bento, Gleb Bourenkov, dan Thomas
Schneider untuk bantuan mereka dalam menggunakan beamline tersebut.
Author kontribusi
UTB dan GW memulai penelitian dan diarahkan proyek. MCW, LB, LR, EAPM dan HM kloning, menyatakan dan puri fi
ed PETase, MHETase dan mutan, melakukan studi dan aktivitas tes mengikat di bawah pengawasan DB dan
GJPEAPM dan
GJP disintesis MHET analog. EAPM, GJP, MSW dan GW dilakukan analisis kristalografi dan komputasi. GJP, MSW,
UTB dan GW menyiapkan naskah, yang direvisi dan disetujui oleh semua penulis. Karya ini didukung oleh hibah
dana startup dari University of Greifswald ke GW
9
ARTIKEL
Informasi tambahan
Informasi tambahan menyertai tulisan ini di https://doi.org/10.1038/s41467019-09326-3 .
Bersaing kepentingan: Para penulis menyatakan tidak ada kepentingan bersaing.
Cetak ulang dan izin informasi yang tersedia secara online di http://npg.nature.com/ reprintsandpermissions /
Jurnal informasi peer review: Nature Communications terima kasih pengulas anonim untuk kontribusi mereka
terhadap peer review dari pekerjaan ini. laporan peer reviewer yang tersedia.
Penerbit ' s note: Springer Nature tetap netral berkaitan dengan klaim yurisdiksi di peta yang diterbitkan dan af
kelembagaan fi liations.
10 KOMUNIKASI ALAM | (2019) 10: 1717 | https://doi.org/10.1038/s41467-019-09326-3 | www.nature.com/naturecommunications
KOMUNIKASI NATURE | https://doi.org/10.1038/s41467-019-09326-3
Akses terbuka Artikel ini berlisensi di bawah Creative Commons Attribution 4.0 License
International, yang memungkinkan penggunaan, berbagi,
adaptasi, distribusi dan reproduksi di media atau format, selama Anda memberikan kredit sesuai dengan penulis asli
(s) dan sumber, menyediakan link ke lisensi Creative Commons, dan menunjukkan jika perubahan yang dilakukan.
Gambar atau materi pihak ketiga lainnya dalam artikel ini termasuk dalam artikel ' lisensi s Creative Commons, kecuali
dinyatakan lain dalam batas kredit untuk materi. Jika bahan tidak termasuk dalam artikel ' s lisensi Creative Commons
dan tujuan penggunaan Anda tidak diizinkan oleh peraturan perundang-undangan atau melebihi penggunaan yang
diizinkan, Anda akan perlu untuk mendapatkan izin langsung dari pemegang hak cipta. Untuk melihat salinan lisensi
ini, kunjungi http://creativecommons.org/ lisensi / oleh / 4.0 / .
© The Author (s) 2019