LC-MS dipandu isolasi produk alami dilakukan untuk deteksi dan target pemisahan tiga produk

alami, yaitu. magnoflorine (1), chrysin (9) dan dibenzylideneacetone (10) untuk pertama kalinya
dari ekstrak metanol Epimedium elatum. Fraksinasi ekstrak metanol menghasilkan enam fraksi:
EF-1, EF-2, EF-3, EF-4, EF-5 dan EF-6. Keenam fraksi tersebut tunduk pada analisis LC-MS
sebelum pemurnian untuk isolasi LC-MS yang dipandu produk alami target. LC-MS profiling
fraksi mengarah pada identifikasi tiga fraksi, EF-2, EF-3 dan EF-5, yang mengandung konstituen
yang diinginkan yang tidak dilaporkan sebelumnya dari Epimedium elatum. Dalam mode
ESI-MSn EF-5 (Gbr. 3a) mengungkapkan adanya 1 dengan puncak ion molekul pada 342 m / z.
Fragmen utama pada m / z 297 dalam MS2 menunjukkan hilangnya –N (CH3) 2 dan fragmen
stabil lainnya pada m / z 265 (Tabel 1) menunjukkan hilangnya –OCH3. Berdasarkan massa
molekul dan pola fragmentasi 1 secara tentatif diidentifikasi sebagai magnoflorine [29]. Karena
magnoflorine sebelumnya tidak dilaporkan dari Epimedium elatum, isolasi dilakukan dengan
menggunakan kromatografi kolom dengan CHCl3 dan MeOH sebagai elemen untuk menghasilkan
kristal kecoklatan dari 1. Analisis gabungan 1D, 2D NMR dan massa dalam terang literatur
mengkonfirmasi struktur 1 sebagai magnoflorine [30]. Ini adalah satu-satunya alkaloid yang
dilaporkan dari genus Epimedium hingga saat ini. Demikian pula skrining LC-MS dari fraksi EF-2
menggambarkan puncak yang diinginkan 3 dan 9. Puncak 9 menghasilkan puncak ion molekul
pada m / z 255 (M + H) + dalam mode ESI positif. Pola MS2

3 menunjukkan dua puncak 2 dan 10. Senyawa 2 dilengkapi (M + H) + ion pada m / z 840 dalam
mode ESI positif (Tabel 1). Fragmen utama dalam MS2 pada m / z 531 menunjukkan hilangnya
netral bagian glukosa-rhamno yang melekat pada kerangka flavonoid. Selanjutnya puncak yang
intens pada m / z 222 menunjukkan hilangnya fragmen glukosa yang netral. Senyawa 10
menunjukkan puncak ion molekul pada m / z 235 (M + H) + dalam mode ESI positif (Tabel 1).
Pola fragmentasi menunjukkan puncak yang kuat dalam spektrum MS2 pada m / z 178 yang
dapat dikaitkan dengan pembentukan dimer benzena. Namun, struktur senyawa 2 dan 10 tidak
dikonfirmasi dari data MS, oleh karena itu 2 dan 10 diisolasi menggunakan gel silika.
Perbandingan NMR dan data spektral massa 2 dan 10 dengan laporan literatur secara jelas
mengidentifikasi mereka sebagai ikarisoside C dan dibenzylideneacetone, masing-masing [34,35].
Profil LC-MS dari fraksi EF-4 (Gbr. 3b) menampilkan puncak 4 dan 8. Puncak (M + H) + ion 4 pada
m / z 664 menghasilkan ion fragmen pada m / z 356 (Tabel 1) yang sesuai dengan hilangnya
moieties rhamnose dan glukosa yang melekat pada nukleus induk. Senyawa 8 mengungkapkan
puncak ion pseudo-molekul (M + H) + pada m / z 678 yang pada fragmentasi memberikan
fragmen utama pada m / z 369 dalam spektrum MS2 karena hilangnya gugus rhamnose dan
glukosa (Tabel 1). Senyawa 5-7 memberikan puncak ion molekul pada m / z 840 [M + H] +, 810
[M + H] + dan 824 [M + H] +, masing-masing. Ketiga puncak konstituen 5, 6 dan 7 menunjukkan
pola fragmentasi yang serupa dalam spektrum MS2 menghasilkan ion anak yang sama pada m / z
531 yang menunjukkan hilangnya rhamno-glukosa (5); rhamno-xylose (6) dan
rhamno-rhamnose (7) moieties. Kehilangan glukosa lebih lanjut diindikasikan oleh puncak yang
berlimpah pada m / z 369 (5-7) (Tabel 1). Spektrum massa dan pola fragmentasi bersama
dengan waktu retensi 5-7 konstituen dibandingkan dengan sampel otentik yang dibeli secara
komersial dan berdasarkan pada parameter analitik (waktu retensi dan spektrum UV) puncak 5-7
diidentifikasi sebagai epimedin A, epimedin B dan epimedin C, masing-masing (untuk data MS,
MS / MS lihat informasi tambahan SS-1). Sebelumnya kami telah mengisolasi dan menandai 4-8
konstituen masing-masing sebagai epimedoside A, epimedin A, epimedin B, epimedin C dan
icariin, masing-masing [27].

Kromatogram HPLC yang dilaporkan menunjukkan puncak yang belum terselesaikan yang
ditunjuk 1-3 dan 9 (Gbr. 2a). Untuk mendapatkan kromatogram yang terselesaikan dengan baik
sehingga secara bersamaan mengukur semua konstituen yang ada dalam E. elatum kami
memodifikasi metode HPLC sebelumnya (Gbr. 2b). Awalnya sejumlah sistem pelarut dicoba
untuk mengembangkan metode pemisahan untuk isolat dari larutan ekstrak E. elatum
menggunakan beragam komposisi CH3 OH dan H2 O. Akhirnya ACN: H2 O (25:75) digunakan
untuk mendapatkan penyelesaian yang sangat tinggi. kromatogram pada panjang gelombang
270 nm. Di bawah kondisi operasi dari metode optimal yang dikembangkan resolusi, pemisahan
garis dasar yang jelas dengan waktu retensi yang wajar dan tidak ada tailing dan fronting puncak
analit diamati. Senyawa 9, 1, 2, 4, 5, 3, 6, 7 dan 8 ditemukan terelusi pada 5,45, 6,72, 10,51,
13,17, 27,12, 31,71, 35,37, 40,20 dan 43,54 menit, masing-masing dengan puncak yang sangat
simetris dan terselesaikan dengan baik . Metode yang dikembangkan menggambarkan cukup
banyak spesifisitas. Perbandingan antara puncak spektrum dan waktu retensi memastikan
kekhususan metode yang dikembangkan. Penilaian puncak spektral di tiga posisi, yaitu. mulai,
puncak dan akhir diamati dengan tingkat simetri yang tinggi dengan chogramogram yang
diselesaikan dengan baik seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4. Seperti yang dapat dilihat,
tidak ada gangguan puncak yang diamati dalam kromatogram HPLC yang menetapkan sensitivitas
tinggi dari metode yang dikembangkan.

Jumlah konstituen terisolasi hadir dalam akar E. elatum ditemukan menjadi 1,92% (magnoflorin),
2,84% (ikarisoside C), 2,04% (epimedoside A), 0,62% (epimedin A), 0,06% (baohuoside II), 0,52 %
(epimedin B), 0,37% (epimedin C), 2,79% (chrysin) dan 0,5% (icariin) berdasarkan berat kering.
Dalam hal bagian udara, komposisi prosentase bervariasi sebagai epimedosida A (0,43%),
epimedin A (3,24%), epimedan C (6,27%) dan epimedat B (0,18%). Epimedin C hadir dalam
jumlah tertinggi (6,27%) di bagian udara dan baohuoside dalam jumlah paling sedikit (0,06%) di
bagian akar. Karena tingginya kandungan glikosida flavonoid yang diprenilasi terutama epimidin
A, epimidin B, epimidin C dan icariin yang memiliki permintaan besar karena atribut-atribut
farmakologisnya yang beragam, E. elatum cocok dengan standar kontrol kualitas yang digunakan
sebagai yinyanghuo menurut farmakope Cina.

Sifat antioksidan flavonoid sudah dikenal luas. Aktivitas pembilasan radikal bebas mereka
bervariasi dengan posisi dan jumlah gugus hidroksil. Secara umum aktivitas pembersihan
radikal bebas meningkat dengan bertambahnya jumlah kelompok – OH. Namun, posisi
kelompok-kelompok ini, dalam sebuah molekul, memiliki dampak yang lebih besar pada aktivitas
yang diberikan. Flavonoid yang menghasilkan radikal antioksidan yang relatif stabil dapat
dengan cepat menghentikan reaksi berantai radikal, dan dapat dianggap sebagai antioksidan yang
efektif. Studi antioksidan SAR flavonoid telah menjadi subjek dari sejumlah proposal penelitian
[36]. Gugus hidroksil bebas pada posisi C-3 dan C-4 bond, ikatan rangkap C2 C3, C-3 ′ ′ dan
C-4 ′ ′ kelompok dihidroksi adalah persyaratan struktural yang diperlukan untuk aktivitas
antioksidan yang lebih baik dari flavonoid [36]. Selain itu, dalam kasus flavonoid prenilasi, posisi
kelompok prenyl pada kerangka flavonoid memainkan peran penting dalam menanamkan
aktivitas antioksidan [37]. Senyawa ini mampu memberikan H + dan mencegah reaksi berantai
radikal bebas. Dari 10 produk alami yang diisolasi dari E. elatum delapan adalah flavonoid dan
diharapkan memiliki aktivitas antioksidan. Jadi semua konstituen yang terisolasi menjadi
sasaran evaluasi antioksidan menggunakan sistem uji DPPH yang banyak digunakan (Tabel 4).
Dalam sistem uji DPPH, antioksidan mengurangi solusi radikal DPPH berwarna ungu untuk
diphenylpicryl hydrazine berwarna kuning. DPPH memiliki penyerapan karakteristik pada 517
nm yang berkurang secara signifikan pada paparan pemulung radikal (antioksidan) dengan
menyediakan sumbangan atom hidrogen atau elektron. Absorbansi rendah pada 517 nm
menunjukkan aktivitas pemulungan radikal yang lebih tinggi dari sampel yang diteliti. Isolat
menunjukkan efek pemulungan tergantung konsentrasi. Isolat yang paling kuat
dibenzylideneacetone menampilkan IC50 sebesar 4,32 followedM diikuti oleh magnoflorine
dengan IC50 dari (4,91 􏰁M). Di antara flavonoid prarisilasi ikarisoside C (IC50 5.13). Aktivitas
baohuoside II yang sedikit lebih baik dapat dikaitkan dengan adanya gugus hidroksil tambahan
pada posisi C-7. Demikian pula, ikarisoside C menunjukkan aktivitas yang lebih baik daripada
epimedin A yang dapat dikaitkan dengan tidak adanya C-4 ′ ′ metoksil dalam ikarisoside C.

Aktivitas antioksidan yang tinggi pada 10 disebabkan oleh stabilisasi resonansi yang ditingkatkan
oleh konjugasi antara 􏰁 elektron dari cincin dan 􏰁 ikatan rantai samping yang dalam integritas
kuat dengan turunan asam sinamat yang dilaporkan dalam literatur. di sisi lain aktivitas
antioksidan dari magnoflorine mungkin disebabkan oleh adanya gugus hidroksil yang
menyumbangkan elektron untuk mengurangi radikal DPPH yang sekali lagi sesuai dengan
pengamatan Rackova.