Spons laut adalah salah satu yang paling produktif dan sumber terbesar senyawa bioaktif baru

di antara organisme laut, dengan lebih dari 200 senyawa baru dilaporkan setiap tahun. Selama
dekade terakhir dari 2001 hingga 2010, sekitar 2400 produk alami baru telah ditemukan dari
671 spesies spons, menyumbang 29% dari produk alami laut yang dilaporkan dalam periode
tersebut. Studi ekologi melaporkan bahwa spons menghasilkan beragam metabolit sekunder
untuk tujuan defensif untuk melindungi mereka dari ancaman pesaing, predator, dan patogen.
Selanjutnya, spons sering menjadi inang bagi simbion mikroba, yang dianggap sebagai salah
satu sumber molekul bioaktif yang paling penting.

Kajian tentang spons laut Indonesia menarik karena Indonesia merupakan negara kepulauan
terbesar di dunia, dengan luas ekosistem terumbu karang sekitar 86.700 kilometer persegi,
yang penting bagi spons sebagai bentik yang paling dominan mendiami terumbu karang.
Terumbu karang Indonesia terletak di kawasan segitiga karang yang merupakan pusat
keanekaragaman hayati laut dunia dan diakui sebagai kawasan terkaya di dunia. Oleh karena
itu, spons dari ekosistem karang menghasilkan metabolit dengan berbagai sifat biologis dan
menjadi target untuk terus mencari senyawa bioaktif baru. Kami baru-baru ini menyelidiki
aktivitas biologis ekstrak dari organisme laut Indonesia, termasuk enam spesies spons, dan
menemukan bahwa ekstrak spons C.

Genus ini telah diakui sebagai produsen yang sangat baik dari metabolit sekunder baru yang
menunjukkan struktur kimia yang beragam termasuk alkaloid, karotenoid, peptida, gula,
terpenoid, dan sterol. Untuk alasan di atas serta populasi yang melimpah dari botox
Clathriabulox di Pulau Samalona, Laut Sulawesi Selatan, kami tertarik untuk menyelidiki
senyawa bioaktif dari spons ini, yang mengarah pada isolasi tiga alkaloid guanidin tipe
crambescidin baru 1–3 serta tiga produk terkait yang diketahui 4–6. Di sini, kami menyajikan
isolasi, penjelasan struktur, dan karakterisasi biologis dari alkaloid guanidin ini. Dua proton
tambahan diamati pada H 10,20 dan 10,28 dalam CDCl3, mendukung adanya karakteristik
gugus guanidin yang disebutkan di atas dari alkaloid crambescidin.
Berdasarkan analisis ini, crambescidin 345 disimpulkan sebagai analog crambescidin baru,
tidak memiliki gugus alkil pada C-19, yang merupakan contoh kedua di antara crambescidin
yang dilaporkan sebelumnya . Konfigurasi relatif untuk 1 ditetapkan oleh eksperimen
spektroskopi efek Overhauser nuklir NOESY. Korelasi NOESY dari H 4.35 /2.27 , H 1.97
/1.45 , dan H 2.42 /2.59 menunjukkan konfigurasi relatif antara C-3 dan C-8. Stereokimia
relatif antara C-10 dan C-13 dikonfirmasi oleh korelasi NOESY dari H-9a/H 1.75 , H 1.75
/1.53 , H-9b/H 4.03 , H-10/H 3.96 , dan H-13/H 2.33 .

Korelasi NOESY tambahan dari H 1,77 /H-14a menentukan konfigurasi relatif antara C-15
dan posisi lainnya. Selanjutnya, konstanta kopling yang besar dari H-9a/H-10 dan H-14a/H-
13 menegaskan orientasi 1,2-diaksial dari pasangan hidrogen ini, menyimpulkan stereokimia
relatif dari 1, seperti yang dijelaskan pada Gambar 2b. Nilai rotasi spesifik 1 menunjukkan
kemiripan yang dekat dengan analog 4 yang serupa secara struktural, menunjukkan bahwa 1
memiliki konfigurasi absolut yang sama dengan 4 . Meskipun data ini merupakan
karakteristik dari alkaloid crambescidin, mereka menunjukkan tidak adanya fungsi olefin
yang ditemukan di sebagian besar alkaloid tipe crambescidin yang dilaporkan.
Berdasarkan analisis ini, crambescidin 361 disimpulkan sebagai analog crambescidin baru
dengan dua cincin tetrahydropyrane, bukan kombinasi dari cincin beranggota tujuh tak jenuh
sisi kiri dan cincin tetrahydropyrane sisi kanan seperti yang ditemukan pada 1 dan sebagian
besar analog crambescidin. Fitur struktural lain dari2 adalah adanya substituen propil
grupasanalkil, yang cukup langka dalam alkaloid tipe crambescidin. Konfigurasi relatif dari 2
diperiksa dengan interpretasi korelasi NOESY. Konformasi kursi dari kedua cincin
tetrahidropiran ditentukan oleh korelasi 1,3-diaksial dari H 3,63 /1,85 dan H 3,74 /1,85.
Korelasi NOESY dari H 10,16 /H-4, NHb/H-6b, H 10,13 /H-19, dan NHa/H-17b
menunjukkan bahwa kedua NH guanidin juga dalam orientasi aksial tentang cincin
tetrahidropiran. Korelasi NOESY tambahan dari H 1.74 /1.57 , H-7/2.19 , H-9b/H 4.00 , H
4.00 /2.21 , H 1.59 /1.74 , dan H14b/H-16 menunjukkan konfigurasi relatif antara C-8 dan C-
10 dan antara C-13 dan C-15.

Temuan ini mendukung stereokimia relatif dari 2, seperti yang ditunjukkan pada Gambar
3b. Karena sulit untuk menentukan posisi dua gugus alkil karena sifat 2 yang sangat simetris,
kami secara tentatif menetapkan posisi alkil seperti yang ditunjukkan karena sebagian besar
alkaloid guanidin terkait memiliki cincin tetrahidropiran termetilasi di sisi kanan molekul.
Crambescidin 373 memiliki rumus molekul C22H35N3O2 sebagaimana ditentukan oleh ion
pseudo-molekul pada m/z 374,2786 + dalam HR-ESIMS. Data NMR ditemukan serupa
dengan data untuk 1 dan 4, menunjukkan bahwa 3 adalah analog crambescidin lain dengan
gugus etil yang didukung oleh sinyal pada H 1,42/C 30.0 dan H 0.85/C 10.2. Gugus etil ini
ditemukan terhubung ke C-19 melalui percobaan DQF-COSY. Proton 3 yang dapat ditukar
diamati pada H 10,49 dan 10,06 dalam CDCl3, mengungkapkan bahwa 3 adalah homolog 19-
etil dari 1.

Senyawa guanidine sebagian besar dilaporkan dari organisme laut. Sejak pertama pentasiklik
guanidin alkaloid ptilomycalin A diisolasi dari spons Karibia Ptilocaulis spiculifer dan spons
Laut Merah Hemimycale sp. pada tahun 1989, berbagai alkaloid guanidine siklik telah
dilaporkan hingga saat ini, termasuk ptilomycalins, crambescidins, monanchocidins, dan
monanchomycalins. Crambescidin 345 adalah analog pertama dengan cincin
tetrahydropyrane non-alkilasi.

Crambescidin 361 memiliki substituen propil yang langka serta dua cincin tetrahydropyrane,
bukan kombinasi dari satu oxepane tak jenuh dan satu cincin tetrahydropyrane, yang
ditemukan di sebagian besar alkaloid tipe crambescidin. Crambescidin 373 adalah analog
pertama dengan gugus etil pada cincin tetrahidropiran sisi kanan, yang memiliki gugus metil
di sebagian besar alkaloid tipe crambescidin yang dilaporkan. Aktivitas Biologis Aktivitas
biologis dari crambescidins 1-6 yang diisolasi masing-masing dievaluasi sebagai agen
sitotoksik dan anti-oomycete terhadap garis sel karsinoma epidermoid manusia A431 dan
patogen tanaman oomycete Phytophthora capsici. Sitotoksisitas terkuat diamati untuk
crambescidins 5 dan 6 bantalan rantai sisi panjang dengan IC50 masing-masing 12 dan 48
nM.

Sementara itu, crambescidin lain tanpa bagian rantai samping yang panjang menunjukkan
sitotoksisitas sedang dengan IC50 masing-masing sebesar 7,0, 2,5, 0,94, dan 3,1
M. Sebaliknya, semua crambescidins 1-3 baru dan analog 4 yang diketahui menunjukkan
aktivitas anti-oomycete yang lebih tinggi daripada 5 dan 6 . Sangat menarik untuk dicatat
bahwa crambescidins yang sangat sitotoksik dengan rantai samping yang panjang
menunjukkan aktivitas anti-oomycete yang lebih rendah daripada yang lain. Terutama,
senyawa 5 yang paling sitotoksik tidak menunjukkan aktivitas anti-oomycete bahkan pada
500 g/disk.

Rantai samping alifatik yang panjang dapat mempengaruhi permeabilitas alkaloid guanidin
ke dalam sel hewan. Sebaliknya, itu tidak mempengaruhi atau lebih tepatnya mengurangi
aktivitas anti-oomycete, yang mungkin disebabkan oleh permeabilitas yang rendah melalui
dinding sel mikroba atau/dan ke dalam media agar hidrofilik yang digunakan dalam
pengujian.
Gambar 5. Aktivitas biologis 1–6. ( a ) Sitotoksisitas terhadap sel karsinoma epidermoid
manusia A431. Kurva dihasilkan oleh pemasangan sigmoid; (b) Aktivitas anti-oomycete
terhadap patogen tanaman P. capsici. Warna yang sama digunakan seperti pada Gambar 5a;
(c) Hubungan terbalik antara aktivitas sitotoksisitas dan anti-oomycete dari 1–6. Data
aktivitas anti-oomycete diamati pada dosis 100 g/disk.

Kromatografi lapis tipis (KLT) dilakukan dengan menggunakan pelat silika gel 600 F254
pralapis (Pasal 5715, Merck, Darmstadt, Jerman) atau pelat C18 F254 fase balik (Pasal
15389, Merck, Darmstadt, Jerman). Kromatografi kolom kilat dilakukan pada silika gel
dengan sistem gradien tekanan sedang yang dilengkapi dengan Modul Pompa C-605 dan
Manajer Pompa C-615 (BÜCHI, Flawil, Swiss). ESIMS resolusi tinggi direkam pada Stasiun
Kerja Biospektrometri Mariner (Biosistem Terapan dari Thermo Fisher Scientific, Waltham,
MA, USA) yang dilengkapi dengan sumber ion penyemprot listrik dalam mode positif.
Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) dilakukan pada sistem gradien tekanan tinggi yang
terdiri dari pompa PU-2087, degasser DG-2080-53, mixer MX-2080-32, dan detektor UV-
2075 (JASCO, Tokyo , Jepang). Spektrum FT-IR direkam pada instrumen spektrometer
FT/IR-400 (JASCO). Rotasi spesifik diamati pada polarimeter DIP-370 (JASCO). Spektrum
NMR diselidiki pada Avance ARX400 (400 MHz untuk 1H) atau Avance III HD 600 MHz
Cryo-probe spektrometer (600 MHz untuk 1H) (Bruker Bio Spin, Yokohama, Jepang).
Pergeseran kimia (ppm) mengacu pada puncak residu pelarut pada H 7,26 ppm (CDCl3), H
3,30/δC 49,0 ppm (CD3OD), atau H 2,06/δC 29,9 ppm (aseton-d6).
Isolasi Senyawa Bioaktif
Spons Indonesia berwarna kemerahan dikumpulkan dengan tangan menggunakan alat
snorkeling pada kedalaman antara 0,5 dan 3 m di Pulau Samalona (5°8′16.4″ LS–
119°23′22.60″ BT), Laut Sulawesi Selatan, pada Agustus 2015. spesies tersebut diidentifikasi
sebagai Clathria bulbotoxa berdasarkan pengamatan morfologi dan elemen spikulanya di
bawah mikroskop. Spons memiliki spikula toxa bulat yang menonjol ke tengah yang
membedakannya dari spesies lain [54]. Organisme (750 g, berat basah) diliofilisasi,
dihomogenisasi dalam MeOH (1,5 L) dan didiamkan pada suhu kamar selama 3 hari.
Campuran disaring dan filtrat dipekatkan untuk memberikan residu berair, yang diekstraksi
tiga kali dengan EtOAc (225 mL). Gabungan lapisan organik dipekatkan untuk menghasilkan
ekstrak EtOAc (6,4 g). Ekstrak ini dilarutkan dalam 90% MeOH (75 mL) dan diekstraksi dua
kali dengan heksana (150 mL). Kedua lapisan dipekatkan untuk mendapatkan 90% fraksi
MeOH (3,1 g) dan heksana (2,5 g).
Fraksi MeOH 90% yang menunjukkan sitotoksisitas (IC50 = 0,046 g/mL), dipisahkan dengan
kromatografi kolom terbuka (silika gel, 100 g) dielusi dengan 2, 5, 10, 100% MeOH dalam
CHCl3 (masing-masing 600 mL ). Fraksi dikumpulkan oleh setiap 100 mL, dan digabungkan
dengan tepat untuk menghasilkan enam fraksi (fr.1–fr.6), di mana fr.3 (222 mg) dielusi
dengan 2–5% MeOH dan fr.6 (2,1 g) dielusi dengan 100% MeOH menunjukkan aktivitas
sitotoksik yang signifikan dari IC50 = 0,013 dan 0,092 g/mL, masing-masing. Fr.3
selanjutnya dikromatografi pada silika gel (HI-FLASHTM Ukuran L, 30 g, Yamazen Co.,
Osaka, Jepang) dengan gradien linier 10–80% CHCl3-MeOH-H2O (90:9:1) dalam EtOAc
( 40 menit) pada laju alir 10 mL/menit untuk menghasilkan delapan fraksi (fr.3-1–fr.3-8).
Sitotoksik fr.3-5 (33,1 mg, IC50 = 0,8 ng/mL) dimurnikan dengan HPLC [Develosil ODS-
HG-5 (20 × 250 mm, Nomura Chemical Co., Ltd., Seto, Aichi, Jepang), 80–100% MeOH-20
mM NH4CH3COO (40 menit), 6 mL/menit, terdeteksi pada 215 nm] untuk memberikan
crambescidin 657 (5, 16,2 mg, tR = 48,0 menit). Tiga fraksi, fr.3-6–fr.3-8 (total 110 mg, IC50
= 0,081 g/mL) digabungkan dan dikenai HPLC [Develosil ODS-HG-5 (20 × 250 mm), 50–
80% MeOH-0,1% asam trifluoroasetat (TFA) (60 menit), laju aliran 6 mL/menit, dipantau
pada 205 nm] untuk mendapatkan fraksi yang mengandung 1 (1,5 mg, tR = 40,8 menit),
crambescidin 359 (4, 26,0 mg, tR = 45,6 menit), crambescidin 361 (2, 2,4 mg, tR = 55,4
menit), dan crambescidin 373 (3, 1,1 mg, tR = 62,0 menit). Fraksi yang mengandung 1
selanjutnya dimurnikan dengan HPLC [Develosil ODS-UG-5 (10 × 250 mm), 60% MeOH-
0,1% TFA, 2 mL/menit, terdeteksi pada 215 nm] untuk mendapatkan crambescidin 345
murni (1, 0,6 mg, tR = 19,7 menit). fr.6 (2,1 g, IC50 = 0,092 g/mL) difraksinasi melalui
kolom terbuka silika gel (50 g), dielusi dengan 10, 20, 40, 60, 100% MeOH-H2O (90:10)
dalam CHCl3 untuk membeli empat pecahan (fr.6-1–fr.6-4). Fr.6-3 aktif (500 mg, IC50 =
0,017 g/mL) dielusi dengan 40% MeOH-H2O (90:10) dalam CHCl3 kemudian
dikromatografi pada silika gel (HI-FLASHTM, Ukuran L, 30 g) dengan elusi gradien 10-
100% MeOH dalam CHCl3 selama 40 menit pada laju aliran 10 mL/menit untuk
menghasilkan empat fraksi (fr.6-3-1-fr.6-3-4). fr aktif. 6-3-3 (180 mg, IC50 = 0,019 g/mL)
dielusi dengan MeOH 54–86% menjadi sasaran HPLC [Develosil ODS-HG-5 (20 × 250
mm), 40-60% MeCN-0,1% TFA (60 menit), 8 mL/menit, terdeteksi pada 230 nm] untuk
mendapatkan crambescidin 800 (6, 21,7 mg, tR = 36,3 menit).

Uji Anti-oomycetete

Pengujian dilakukan dengan metode difusi cakram kertas [56]. Secara singkat, sepotong
miselia dari patogen tanaman Phytophthora capsici NBRC 30696 telah dikultur sebelumnya
pada media kentang-glukosa-agar dalam cawan 9 cm pada 25 ° C dan kelembaban 60%
selama tujuh hari dalam gelap. Sepotong (5 × 5 mm) koloni kemudian diinokulasi di tengah
media 5% V8 jus-1,5%-agar dalam cawan 9 cm dan diinkubasi selama 48 jam pada 25 ° C
dan kelembaban 60%. Disk kertas (diameter 8 mm) yang berisi sampel dengan dosis yang
sesuai (tidak ada, 25, 50, dan 100 g/cakram) ditempatkan pada jarak 1 cm dari bagian depan
koloni. Setelah inkubasi selama 22-24 jam, zona hambat yang terbentuk di sekitar sampel
disk diukur. Aktivitas diwakili oleh dosis minimum yang menyatakan zona hambat yang jelas
(biasanya 0,5 mm atau lebih lebar).

Uji Sitotoksisitas

Sel karsinoma epidermoid turunan vulva manusia A431 digunakan untuk mengevaluasi
sitotoksisitas senyawa dalam kondisi yang dilaporkan sebelumnya [57]. Secara singkat, sel-
sel dengan kepadatan 1,0 × 104 sel/sumur dikultur dalam pelat 24-sumur (BD Falco) dalam
media DF6F dengan berbagai konsentrasi senyawa (tidak ada, 1, 3, 10 M untuk 1-4; tidak
ada, 0,001, 0,01, 0,1, dan 1,0 M untuk 5 dan 6) pada 37 °C dalam kondisi 95% udara/5%
CO2 yang dilembabkan dalam inkubator CO2 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,
USA), diikuti dengan penghitungan sel dengan a Coulter Counter (Coulter Electronics Inc.,
Hialeah, FL, USA) pada hari ke 5. Media DF6F terdiri dari rasio 1:1 media DMEM dan Ham
F-12 (DF), dilengkapi dengan enam faktor, yaitu insulin (10 g/mL), transferrin (5 g/mL), 2-
aminoetanol (10 M), natrium selenit (10 nM), 2-merkaptoetanol (10 M), dan asam oleat
terkonjugasi dengan albumin serum sapi bebas asam lemak (9,4 g/mL) (semua bahan kimia
berasal dari Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Nilai IC50 ditunjukkan dengan dua (untuk
1-4 dan 6) atau tiga (5) ulangan.
Kesimpulan
Dalam penelitian ini, kami menemukan tiga alkaloid guanidin baru, crambescidins 345 (1),
361 (2), dan 373 (3), bersama dengan tiga crambescidin 4–6 yang diketahui dari spons
Indonesia Clathria bulbotoxa. Struktur 1-3 dengan stereokimia absolut ditentukan dengan
analisis spektroskopi, termasuk NMR dua dimensi dan rotasi spesifik. Meskipun inti guanidin
pentasiklik telah ditemukan di sejumlah crambescidin dan senyawa alami terkait, keragaman
yang tinggi dalam substituen alkil (metil, etil, propil) pada cincin eter siklik senyawa kami
diamati untuk pertama kalinya, sedangkan sebagian besar produk terkait memiliki gugus etil
pada C-3 dan gugus metil pada C-19. Pengujian biologis mengungkapkan bahwa rantai
samping alifatik panjang dalam senyawa 5 dan 6 memainkan peran yang cukup penting untuk
sitotoksisitas terhadap sel kanker (mungkin karena peningkatan permeabilitas melalui
membran sel), tetapi sebaliknya tidak untuk penghambatan patogen tanaman oomycete. .