Denaturasi Renaturasi dan Perbaikan DNA

Denaturasi DNA

Denaturasi adalah untai ganda molekul DNA yang dapat dipisahkan dengan perlakuan suhu
maupun senyawa alkali sehingga konformasinya berubah dan dapat hampir menjadi
acak. Tingkat denaturasi DNA tergantung pada tingginya suhu. Perubahan tingkat denaturasi
DNA dapat diikuti dengan memperlakukan DNA pada suhu yang bertingkat, kemudian diukur
absorbansinya (A) pada panjang gelombang 260. Perlu diketahui bahwa basa asam nukleat
menyerap dengan kuat cahaya pada panjang gelombang 260. Kurva hubungan antara
peningkatan suhu dengan suhu dengan nilai A260 menunjukkan perubahan tingkat denaturasi
DNA. Banyaknya cahaya dapat diserap oleh molekul DNA tergantung pada struktur molekulnya.
Semakin teratur molekulnya maka semakin sedikit cahaya yang diserap. Oleh karena itu
nukleotida bebas menyerap cahaya lebih besar daripada molekul DNA untai tunggal atau RNA.
Nilai serapan cahaya oleh molekul DNA dengan struktur DNA tetapi dengan konsentrasi yang
sama (50mg/ml) adalah sebagai berikut :
DNA untai ganda A260 = 1,0
DNA untai tunggal A260 = 1,37
Nukleotida bebas A260 = 1,60

Beberapa hal penting dalam kurva diatas antar lain :

1. Nilai A260 tidak berubah sampai keadaan suhu yang umumnya dijumpai pada sel hidup dialam.
2. Peningkatan nilai A260 terjadi dalam kisaran 6 sampai 8˚C.
3. Nilai A260 maksimum sekitar 37% lebih besar dibandingkan dengan nilai awalnya.
Aspek Fisiologis Denaturasi DNA
Proses denaturasi DNA sebenarnya juga terjadi dalam kondisi fisiologis dan bahkan
merupakan bagian dari proses fisiologis yang penting. DNA sebenarnya merupakan struktur
yang dinamis. Bagian tertentu struktur gelembung untai tunggal. Fenomena ini disebut breathing.
Dalam aktivitas fisiologis jasad hidup, keadaan semacam ini sangat penting artinya karena DNA
dapat berinteraksi dengan banyak protein, misalnya dalam proses replikasi dan transkripsi.
Fenomena breathing lebih banyak terjadi pada bagian yang kandungan A T nya lebih tinggi.
 Dengan adanya breathing maka protein yang terlibat dalam proses replikasi dan transkripsi
dapat berinteraksi dengan molekul DNA
Renaturasi DNA
Renaturasi adalah proses pembentukan kembali struktur untai ganda dari keadaan
terdenaturasi.Renaturasi merupakan suatu proses yang dapat terjadi secara in vivo maupun in
vitro. Renaturasi in vitro merupakan suatu fenomena yang sangat berguna untuk analisis
molekuler, misalnya untuk mengetahui kesamaan atau kedekatan genetis antara suatu organisme
dengan organisme lain, untuk mendeteksi macam RNA tertentu, untuk mengetahui apakah suatu
urutan nukleutida tertentu ada lebih dari satu pada suatu jasad, serta untuk mengetahui lokasi
spesifik suatu urutan nukleutida pada genom . Dalam bagian ini merupakan proses renaturasi
secara in vitro.
Tahapan renaturasi :
1. Untai tunggal DNA (sense) bertemu dengan untai tunggal lainnya (antisense) secara acak
2. Jika urutan Nukleotida kedua untai tunggal tersebut komplementer, maka akan terjadi ikatan
hidrogen dan terbentuk struktur untai ganda pada suatu bagian. Pembentukan ikatan hidrogen
kemudian akan dilanjutkan pada bagian yang lain secara cepat sehingga terbentuk struktur untai
ganda yang lengkap
Tahapan yang menentukan kecepatan renaturasi bukan proses pembentukan untai gandanya
melainkan proses tumbukan antara molekul untai tunggal dengan untai tunggal yang lain.
Renaturasi dipengaruhi oleh hambatan friksional. Proses ini berlangsung secara acak sehingga
sangat ditentukan oleh konsentrasi DNA.
Syarat Renaturasi

1. Konsentrasi garam cukup tinggi (0,15 sampai 0,5 M). Ion Na+ yang bersifat positif akan
menetralkan gugus fosfat DNA yang bermuata negatif sehingga tidak terjadi saling tolak
antar untaian DNA yang satu dengan untaian DNA yang lain.
2. Suhu renaturasi harus cukup tinggi (20 sampai 25˚C dibawah nilai Tm).
3. Konsentrasi DNA, semakin tinggi konsentrasinya maka probabilitas tumbukan antar
molekul untai tunggal DNA menjadi semakin besar.
4. Kecepatan perlakuan renaturasi. Jika suatu molekul DNA didenaturasi dengan perlakuan
suhu tinggi kemudian suhunya diturunkan secara cepat, maka probabilitas molekul DNA
 sense untuk berpasangan dengan molekul antisense secara akurat akan lebih kecil. Oleh
karena itu proses renaturasi biasanya dilakukan dengan menurunkan suhunya secara
bertahap.

Perbaikan DNA
DNA sebagai materi genetic yang selalu mengalami berbagai reaksi kimia dan selalu melakukan
kopi DNA. Perubahan struktur DNA ini disebut mutasi DNA yang dapat terjadi pada saat proses
replikasi DNA. Untuk menstabilkan hal tersebut maka DNA memiliki kemampuan untuk
memperbaiki (repair) kesalahan yang terjadi pada dirinya sendiri. Jika mutasi DNA yang terjadi
cukup banyak dan DNA tidak sempat untuk memperbaiki (repair) dirinya sendiri maka akan
terjadi kelainan ekspresi genetic bahkan menyebabkan terjadinya penyakit genetik. Konsumsi
makanan yang bergizi serta istirahat yang cukup memungkinkan tubuh untuk dapat melakukan
repair DNA.
DNA repair merupakan suatu mekanisme perbaikan DNA yang mengalami kerusakan /
kesalahan yang diakibatkan oleh proses metabolisme yang tidak normal, radiasi dengan sinar
UV, radiasi ion, radiasi dengan bahan kimia, atau karena adanya kesalahan dalam replikasi
DNA. Mekanisme perbaikan yang terdapat ditingkat selular secara garis besar disesuaikan
dengan jenis kerusakan yang tentu saja terkait erat dengan jenis factor penyebabnya. Sel-sel
menggunakan mekanisme-mekanisme perbaikan DNA untuk memperbaiki kesalahan-kesalahan
pada sekuens basa molekul DNA. Kesalahan dapat terjadi saat aktivitas selular normal, ataupun
dinduksi. DNA merupakan sasaran untuk berbagai kerusakan: baik eksternal agent maupun
secara spontan.
Apabila ada kesalahan / kerusakan DNA, sel mempunyai dua pilihan :

1. Kesalahan tersebut diperbaiki dengan cara mengaktifkan DNA repair. Namun apabila
kesalahan yang ada sudah tidak mampu lagi ditanggulangi, sel memutuskan untuk beralih
ke pilihan kedua.
2. Apabila DNA tidak mampu diperbaiki lagi, akibat dari adanya kesalahan yang fatal maka
akan dimatikan daripada hidup membawa pengaruh yang buruk bagi lingkungan
sekelilingnya. Kemudian sel dengan DNA yang normal akan meneruskan perjalanan
untuk melengkapi siklus yang tersisa yaitu S (sintesis) G2 (Gap 2) dan M (Mitosis).
Proses perbaikan DNA itu harus melibatkan berbagai macam komponen, yang sangat berperan
penting dalam mekanisme perbaikan DNA tersebut. Komponen-komponen yang terlibat dalam
mekanisme perbaikan DNA dapat dijelaskan secara rinci pada penjelasan berikut ini.
Komponen yang Terlibat dalam Proses DNA Repair

Repair system Enzim/protein Repair sistem Enzim/protein

DNA glycosylase Dam metilase
AP Endonuklease MutS,MutL,MutH
Base excision
DNA Polymerase I Exonuclease
DNA ligase Mismatch DNA Helicase II
UVrA,UVrB,UVrC SSB Protein
Nucleotid exicion DNA polymerase I DNA plomerase III
DNA Ligase DNA Ligase
Mekanisme DNA repair
Pada dasarnya perbaikan DNA dapat dikelompokkan menjadi 3 yaitu :

1. Demage reversal : penggantian secara langsung, photoreactivation merupakan cara

perbaikan DNA dengan melibatkan pembuangan atau pembalikan DNA yang rusak oleh
sebuah enzim tunggal yang tergantung oleh cahaya. Pada bakteri E.coli enzim itu
dikodekan oleh gen phr. Adanya kerusakan pada suatu segmen pirimidin (timin dan
sitosin) yang telah berpasangan (dimer) pada suatu struktur DNA, akan mengaktifkan
suatu proses perbaikan dimana suatu kompleks protein enzim fotoreaktif akan
memutuskan ikatan hydrogen tetapi tanpa memutuskan ikatan fosfodiester antar
nukleotida. Perubahan urutan akan diperbaiki dengan pergantian sesame nukleotida
dengan basa pirimidin, dan akan diikuti proses penangkupan kembali celah yang semula
tercipta.
2. Demage removal : proses ini lebih kompleks karena melibatkan replacing atau
penggantian dengan dipotong-potong. Pada excision repair diawali dengan proses
pengidentifikasian ketidaksesuaian sekuen / urutan DNA dalam suatu proses pengawasan
yang dilakukan oleh endonuklease perbaikan DNA. Kompleks enzim tersebut akan
menginisiasi proses pemisahan DNA heliks utas ganda menjadi suatu segmen utas
 tunggal. Proses ini akan diakhiri dengan pertautan kembali antara dua utas tunggal
tersebut untuk kembali menjadi bagian dari heliks utas ganda, dengan perantaraan enzim
DNA ligase.
3. Demage tolerance : Mentoleransi kesalahan.Hal ini dilakukan bila kesalahan tidak dapat
diperbaiki sehingga kesalahan terpaksa ditoleransi dan yang terotong adalah kedua
strand. Mekanisme ini adalah sebentuk replikasi rawan kesalahan (error-phone) yang
memprbaiki kerusakan-kerusakan pada DNA tanpa mengembalikan sekuens basa awal.
Tipe perbaikan ini bisa dipicu oleh kerusakan DNA dalam tingkat tinggi. Pada bakteri E.
Coli, system tersebut diatur oleh gen-gen recA dan umu yang dihipotesiskan mengubah
fidelitas (ketepatan) polymerase DNA setempat. Dalam rose situ, polymerase melakukan
replikasi melewati kerusakan DNA, sehingga memungkinkan sel untuk bertahan hidup
atau sintas. Jika sel tersebut berhasil sintas melalui seluruh kerusakan DNA, besar
kemungkinan sel itu mengandung satu atau lebih mutasi.

Ada 3 tipe demage removal yaitu :

a. Base excision repair, hanya 1 basa yang rusak dan digantikan dengan yang lain. Basa-
basa DNA dapat dirusak melalui deaminasi. Tempat kerusakan basa tersebut dinamakan
dengan”Abasic site” atau “AP site”. Pada E.coli enzim DNA glycosilase dapat mengenal AP site
dan membuang basanya. Kemudian AP endonuklease membuang AP site dan Nukleotida
sekitarnya. Kekosongan akan diisi dengan bantuan DNA Polymerase I dan DNA Ligase. DNA
polymerase I berperan didalam mensintesis atau menambahkan pasangan basa yang sesuai
dengan pasangannya.sedangkan DNA Ligase berperan dalam menyambungkan pasangan basa
yang telah disintesis oleh DNA polymerase I.
 Base Excision Repair

b. Nucleotide excision repair, adalah memotong pada bagian / salah satu segmen DNA,
dari DNA yang mengalami kerusakan. Kerusakan nukleotida yang disebabkan oleh sinar UV,
sehingga terjadi kesalahan pirimidin dimer (kesalahan dua basa tetangga). Pada E. Coli terdapat
protein yang terlibat dalam proses pembuangan atau pemotongan DNA yang mengalami
kerusakan, protein tersebut adalah UVrA, UVrB, UVrC, setelah protein tersebut mengenali
kesalahan, maka nukleotida yang rusak tersebut dihilangkan (dipotong) sehingga terjadi
kekosongan pada segmen untaian nukleotida tersebut. Selanjutnya untuk mengisi kekosongan
tersebut maka RNA polymerase I mensintesis nukleotida yang baru untuk dipasangkan pada
segmen DNA yang mengalami kekosongan tadi, tentu saja dengan bekerja sama dengan DNA
ligase dalam proses penyambungan segmen DNA tersebut.
 Nucleotide Excision Repair

c. Mismatch repair. Pada tahap ini yaitu memperbaiki kesalahan-kesalahan yang terjadi
ketika DNA disalin. Selama replikasi DNA, DNA polymerase sendirilah yang melakukan
perbaikan salah pasang. Polimerase ini mengoreksi setiap nukleotida terhadap cetakannya begitu
nukleotida ditambahkan pada untaian. Dalam rangka mencari nukleotida yang pasangannya tidak
benar, polymerase memindahkan nukleotida tersebut kemudian melanjutkan kembali sintesis,
(tindakan ini mirip dengan mengoreksi kesalahan pada pengolah kata dengan menggunakan
tombol “delete” dan kemudian menuliskan kata yang benar). Protein-protein lain selain DNA
polymerase juga melakukan perbaikan salah pasang. Para peneliti mempertegas pentingnya
protein-protein tersebut ketika mereka menemukan bahwa suatu cacat herediter pada salah satu
dari protein-protein ini terkait dengan salah satu bentuk dari kanker usus besar. Rupanya cacat
ini mengakibatkan kesalahan penyebab kanker yang berakumulasi di dalam DNA. Pada intinya
mekanisme perbaikan mismatch ini mendeteksi terlebih dahulu pasangan basa yang tidak “cocok
(matched)” atau tidak berpasangan dengan benar. Kesalahan berpasangan basa atau mismatch
dapat terjadi saat replikasi ataupun rekombinasi DNA, dimana untuk memperbaiki basa yang
tidak berpasangan, terlebih dahulu harus diketahui pasangan ba
sa mana yang mengalami kesalahan basa pada untai DNA. Caranya segmen DNA yang
membawa basa yang salah dibuang, sehingga terdapat celah (gap) di dalam untai DNA.
Selanjutnya dengan bantuan enzim polymerase celah ini akan diisi oleh segmen baru yang
membawa basa yang telah diperbaiki, yang kemudian dilekatkan dengan bantuan enzim ligase.

Mismatch Repair