ISOLASI DNA

dan
ELEKTROFORESIS DNA

Roga F. Kembaren, M,Si

 KROMOSOM DAN PLASMID
Kromosom dan plasmid:
• komponen sel
• Terbuat dari DNA
• Membawa gen
Kromosom:
• Dilindungi oleh protein
• DNA linier
Plasmid:
• DNA sirkuler
• Tidak dilindungi oleh protein
 PLASMID

Plasmid:
• Molekul DNA sirkuler
• Berada di luar kromosom
• Bereplikasi secara independen, tidak
bergantung pada kromosom,
(setiap plasmid memiliki origin of replication,
yang disingkat dengan ori).
• Berperan dalam adaptasi bakteri dan evolusi.
• Molekul yang berperan penting dalam studi
biologi molekuler.
 KLASIFIKASI PLASMID
• Plasmid fertility atau plasmid F membawa gen tra -
berfungsi dalam proses konjugasi bakteri.
• Resistance plasmid atau plasmid R: membawa gen
pengkode resisten antibiotik
• Plasmid Col mengkode kolikin – protein yang membunuh
bakteri lain.
• Plasmid degradatif: berfungsi dala memetabolisme
molekul tertentu yang tidak biasa. Contoh: plasmid TOL
yang memampukan bakteri memetabolisme toluen.
• Plasmid virulen: plasmid yang menyebabkan bakteri
pathogen terhadap sel inangnya dengan mentransfer DNA
ke dalam sel inangnya.
Contoh: plasmid Ti dari Agrobacterium tumefaciens yang
menyebabkan tumor pada tanaman yang disebut crown
gall disease.
 Peta Plasmid
Gambaran yang menunjukkan daerah yang penting
pada plasmid seperti daerah pemotongan oleh
enzim restriksi, daerah gen pengkode marker, origin
of replication (ori).
 PLASMID
 Plasmid Kloning (Cloning Plasmid)
Plasmid kloning berfungsi hanya sebagai
pembawa gen asing tapi tidak memiliki perangkat
untuk mengekspresikan gen sisipan tersebut
menjadi protein.

 Plasmid Ekspresi (Expression Plasmid)

Plasmid ekspresi dapat berfungsi sebagai
plasmid kloning sekaligus dapat
mengekspresikan gen sisipan, karena memiliki
perangkat untuk ekspresi gen.
 PLASMID

Contoh plasmid kloning:

 PLASMID
Plasmid/vektor ekspresi:
• Plasmid ekspresi juga adalah plasmid kloning.
• Selain alat-alat untuk kloning gen, juga
memiliki alat-alat untuk ekspresi gen.
(promotor, ribosom binding site(rbs) dan
terminator).

• Gen (coding gene) yang disisipkan (diklon)

pada plasmid ekspresi dapat diekspresikan
menjadi protein/enzim.
 PLASMID
Contoh peta plasmid ekspresi
 PLASMID
Contoh peta plasmid ekspresi (cont’d)
ISOLASI DNA
 ISOLASI DNA

• Isolasi DNA total = kromosom + plasmid

• Isolasi kromosom
• Isolasi plasmid
Tahap-tahap umum isolasi DNA total dari sel bakteri

1. Bakteri ditumbuhkan pada media tumbuh.

2. Sel dipisahkan dari media tumbuh dan sel dilisis
untuk menghasilkan ekstrak sel
3. DNA dipisahkan dan dimurnikan dari ekstrak sel
4. DNA murni.
Brown T.A. 2010. Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction, 6th ed. Wiley-Blackwell
 Panen sel dengan sentrifuga

Brown T.A. 2010. Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction, 6th ed. Wiley-Blackwell
 ISOLASI DNA
Lisis sel:
 metode dan bahan bergantung pada jenis sel;
bakteri, jamur, tanaman atau hewan.
→ komponen membran sel berbeda.

Metode lisis sel:

• Secara fisik - sonikasi
• Secara kimia – bufer lisis
• Secara enzimatis
• Bisa juga gabungan ketiga metode di atas
 ISOLASI DNA
Lisis sel dengan metode kimia:
Bahan kimia yang dapat merusak dinding
sel: bergantung jenis mikroba.
Untuk sel E. coli :
- Enzim lisosim  enzimatis
- Etilendiamintetraasetat (EDTA)
Secara kimia
- Sodium dodesil sulfat (SDS)
- Gabungan enzimatis dan kimiawi
 Pembuatan ekstrak sel

a. Lisis sel

b. Sentrifugasi ekstrak sel untuk memisahkan

sisa sel yang tidak larut

Brown T.A. 2010. Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction, 6th ed. Wiley-Blackwell
 ISOLASI DNA
Kontaminan pada isolasi DNA:
- Komponen sel lainnya: protein, RNA.
Harus dihilangkan = tahap pemurnian DNA.

Protein dapat dihilangkan dengan

- campuran fenol dan kloroform.
- Enzim proteinase.

- RNA dapat dihilangkan dengan enzim Rnase.

Pemisahan kontaminan protein dengan ekstraksi fenol

Brown T.A. 2010. Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction, 6th ed. Wiley-Blackwell
Pemurnian DNA dengan kromatografi pertukaran ion

a. Penempelan DNA pada

matriks kromatografi.

a. DNA dimurnikan dengan

kromatografi kolom.
Larutan dilewatkan
melalui kolom dengan
sentrifugasi.

Brown T.A. 2010. Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction, 6th ed. Wiley-Blackwell
 Pengendapan DNA dengan etanol

a. Etanol absolut dengan

larutan DNA yang pekat,
DNA dapat diambil
dengan melilitkan pada
batang gelas.

b. Untuk larutan DNA yang

kurang pekat, DNA
diendapkan dengan etanol
kemudian disentrifuga,
DNA berada pada
endapan.
Brown T.A. 2010. Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction, 6th ed. Wiley-Blackwell
 ISOLASI PLASMID
• Metode yang umum: Lisis alkali.
• Kontaminan: protein, RNA dan DNA kromosom.
• Lisis sel dan menghilangkan kontaminan protein
dan RNA: sama dengan cara pada isolasi DNA.

Tahap yang penting: pemisahan plasmid dari

kromosom.
 ISOLASI PLASMID
Pemurnian plasmid dengan metode lisis alkali

Suasana basa: Netralisasi:

mendenaturasi DNA DNA kromosom tidak dapat
direnaturasi,
sedangkan plasmid dapat
direnaturasi,

Brown T.A. 2010. Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction, 6th ed. Wiley-Blackwell
 ISOLASI PLASMID
Pemisahan plasmid dari kromosom:
Berdasarkan perbedaan fisik plasmid dan DNA
kromosom.

Plasmid: sirkuler dan berukuran relatif lebih

kecil dibandingkan DNA kromosom.

 Metode: denaturasi alkali

 ISOLASI PLASMID
Pemisahan plasmid dari kromosom:
Denaturasi alkali:
 Non-supercoiled DNA didenaturasi tapi
supercoiled plasmid tidak.

Pada pH 12 -12,5
 ikatan hidrogen non-supercoiled DNA
diputuskan, menyebabkan double helix rusak
(unwind) dan rantai polinukleotida terpisah.
 ISOLASI PLASMID
Pemisahan plasmid dari kromosom:
Denaturasi alkali (cont’d)
 Pada saat ditambahkan asam: DNA
kromosom yang sudah terdenaturasi akan
beragregasi dan tidak larut.
 Plasmid akan berada di supernatan.
 DNA kromosm dan plasmid dipisahkan
dengan sentrifugasi.
 ELEKTROFORESIS DNA

• Identifikasi DNA
- kromosom
- plasmid
- hasil pemotongan kromosom /plasmid

• Menggunakan gel agarosa

• Pemisahan DNA berdasarkan ukuran
 ELEKTROFORESIS DNA

DNA dalam larutan ditempatkan

pada sumur gel agarosa yang
telah terendam dalam buffer
kemudian dialirkan arus listrik.
DNA yang bermuatan negatif
akan bergerak ke arah muatan
positif yang kecepatan
pergerakannya bergantung pada
ukuran fragmen DNA, sehingga
fragmen-fragmen DNA dipisahkan
berdasarkan ukuran.

Karp, G. 2013. Cell and Molecular Biology: Concepts and Experiments, 7th ed
 ELEKTROFORESIS DNA
Visualisasi DNA pada gel eleketroforesis

• Untuk visualisasi DNA diperlukan pewarna DNA

yang umumnya berupa senyawa`kimia.
• Senyawa kimia yang umum digunakan sebagai
pewarna DNA adalah etidium bromida (EtBr).
• Bahan yang digunakan untuk mewarnai DNA
membutuhkan aktivasi oleh sinar UV.
• Gel agarosa ditempatkan pada UV transilluminator
dan menghasilkan cahaya fluoresense yang dapat
ditangkap oleh kamera.
 ELEKTROFORESIS DNA
Interkalasi etidium bromida (EtBr) pada DNA

Etidium bromida

Brown T.A. 2010. Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction, 6th ed. Wiley-Blackwell
 ELEKTROFORESIS DNA

Pembuatan gel agarosa Loading sampel

Visualisasi Running
ALAT UNTUK VISUALISASI DNA

DNA-gel Illuminator

GelDoc
 ELEKTROFORESIS DNA

DNA kromosom

DNA plasmid

RNA

Elektroforesis DNA total

 KONFORMASI PLASMID

Plasmid memiliki konformasi

1. Nicked

2. Supercoiled (Covalently closed circular, CCC)

Jika dipotong dengan satu jenis enzim restriksi akan

menghasilkan plasmid dengan konformasi linier
 KONFORMASI PLASMID

Nicked

Linier

Supercoiled

Perbedaan migrasi plasmid berdasarkan konformasinya

pada elektroforesis DNA