PRAKTIKUM HEMATOLOGI II

PEMBUATAN SEDIAAN APUSAN DARAH TEPI

OLEH :

LUH GEDE MEILIA AYU SUARI PUTRI

P07134018 087
IV B

KEMENTRIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA

POLITEKNIK KESEHATAN DENPASAR
JURUSAN TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS
TAHUN 2020
 PRAKTIKUM HEMATOLOGI
PEMBUATAN SEDIAAN APUSAN DARAH TEPI

I. TUJUAN
a. Tujuan Umum
1. Mahasiswa dapat mengetahui cara pembuatan dan pewarnaan sediaan
apusan darah tepi (SADT)
2. Mahasiswa dapat menjelaskan cara – pembuatan dan pewarnaan
sediaan apusan darah tepi (SADT)
b. Tujuan Khusus
1. Mahasiswa dapat melakukan pembuatan dan pewarnaan sediaan apusan
darah tepi (SADT)
2. Mahasiswa dapat menganalisis hasil dari cara pembuatan dan pewarnaan
sdiaan apus darah tepi (SADT)

II. METODE
Metode yang digunakan adalah hapusan darah (Blood Smear)

III. PRINSIP
a. Prinsip Sediaan Apus
Satu apusan darah tipis dibuat dengan meletakkan setetes darah pada kaca
obyek, diratakan sedemikan sehingga terbentuk apusan darah yang tipis.
b. Prinsip Pewarnaan
Menggunakan dua zat warna yang berbeda yang terdiri dari Azure B
(trimethylthionin) bersifat basa dan eosin Y (tetrabromoflourescein) yang
bersifat asam

IV. DASAR TEORI

Darah adalah organ khusus yang berberbeda dengan organ lain karena
berbentuk cairan. Darah merupakan alat utama transportasi, distribusi dan
sirkulasi dalam tubuh. Volume darah manusia sekitar 7% dan 10% berat normal
dan berjumlah sekitar 5 liter. Keadaan jumlah darah pada tiap – tiap orang tidak
sama bergantung pada usia, pekerjaan, serta keadaan jantunh atau pembuluh darah
(Handayani & Sulistyo, 2008)
Sel darah pada umumnya dikenal ada tiga tipe yaitu: eritrosit, lekosit dan
trombosit. Eritrosit manusia dalam keadaan normal berbentuk cakram bulat
bikonkaf dengan diameter 7,2 µm tanpa inti, lebih dari separoh komposisi eritrosit
terdiri dari air (60%) dan sisanya berbentuk substansi koloidal padat. Sel ni
bersifat elastis dan lunak. Lekosit (sel darah putih) terdapat pada bagian pinggir
sel darah, lekosit ini dibagi menjadi dua yaitu granulosit dan agranulosit.
Untuk melihat struktur sel-sel darah dengan mikroskop cahaya pada
umumnya dibuat sediaan apus darah. Sediaan apus darah ini tidak hanya
digunakan untuk mrmpelajari sel darah tapi juga digunakan untuk menghitung
perbandingan jumlah masing-masing sel darah. Pembuatan preparat apus darah ini
menggunakan suatu metode yang disebut metode oles (metode smear) yangm
erupakan suatu sediaan dengan jalan mengoles atau membuat selaput (film) dan
substansi yang berupa cairan atau bukan cairan di atas gelas benda yang bersih
dan bebas lemak untuk kemudian difiksasi, diwarnai dan ditutup dengan gelas
penutup . Apusan Darah Tepi atau blood smear adalah pemeriksaan laboratorium
yang melibatkan sitologi sel darah tepi yang dioleskan pada slide obyek glass.
Sebagai dasar seperti itu, blood smear sangat berharga dalam karakterisasi
berbagai penyakit klinis (Adewoyin and Nwogoh, 2015).
Film darah (sediaan oles) ini dapat diwarnai dengan berbagai macam
metode termasuk larutan-larutan yang sederhana antara lain: pewarnaan Giemsa,
pewarnaan acid fast, pewarnaan garam, pewarnaan wright, dan lain-lain.
Pewarnaan Giemsa disebut juga pewarnaan Romanowski. Metode pewarnaan ini
banyak digunakan untuk mempelajari morfologi sel-sel darah, sel-sel lien, sel-sel
sumsum dan juga untuk mengidentifikasi parasit-parasit darah misal
Tripanosoma, Plasmodia dan lain-lain dari golongan protozoa.
Sebagian besar laboratorium komersial menggunakan beberapa bentuk
pewarnaan tipe Romanowsky (misalnya Wright - Geimsa) dan pewarnaan ini
memberikan hasil yang sangat baik tetapi cenderung menjadi cerewet (Adewoyin
and Nwogoh, 2015).
V. ALAT DAN BAHAN
a. Alat
 Mikroskop Binokuler
 Kaca obyek 25 x 75 mm (harus sudah dibilas sampai bersih dan kalua
perlu, dibersihkan lagi dengan kain lap lembut yang dibasahi etanol
atau eter)
 Lampu spritus
 Kaca penghapus
 Rak pewarnaan
 Lancet atau syringe
 Batang pengaduk
 Gelas ukur
 Botol berisi air
 Timer

b. Spesimen Pemeriksaan
 Darah kapiler atau darah Vena dengan antikoagulan (EDTA)

c. Reagen
 Methanol absolut
 Zat warna wright
 Zat warna giemsa
 Larutan dapar

VI. CARA KERJA

1. Kaca objek yang bertepi rata untuk digunakan sebagai kaca penghapus,
sudut kaca objek yang dipatahkan menurut garis diagonal untuk
mendapatkan hasil sediaan apus darah yang tidak mencapai tepi kaca
objek.
 2. Satu tetes darah diletakkan pada ± 2 – 3 mm dari ujung kaca objek. Kaca
penghapus diletakkan dengan sudut 30 – 45 derajat terhadap kaca objek
didepan tetes darah
3. Kaca penghapus ditarik kebelakang sehingga menyentuh tetesan darah,
ditunggu sampai darah menyebar pada sudut tersebut
4. Dengan gerak mantap, kaca penghapus didorong sehingga terbentuk
apusan darah sepanjang 3 – 4 cm pada kaca objek. Darah harus habis
sebelum kaca penghapus mncapai ujung lain dari kaca objek. Apusan
darah tidak boleh terlalu tipis atau tebal. Ketebalan dapat diatur dengan
mengubah sudur antara kedua kaca objek dan kecepatan menggeser.
Makin besar sudut atau makin cepat menggeser, makin tipis apusan
darah yang dihasilkan

VII. NILAI NORMAL

Adapun kriteria apusan yang baik adalah sebagai berikut :
1) Apusan tidak melebar sampai ke pinggir kaca objek, panjangnya ½ - 2/3
panjang kaca
2) Tidak boleh berlubang
3) Penyebaran leukosit merata, leukosit tidak berkumpul di pinggir atau
ujung sediaan
4) Terdapat 6 zona sebagai berikut :
Zona I : Masih terdapat tumpukan eritrosit tebal, berdesakan, tidak
beraturan
Zona II : Lebih tipis, eritrosit masih bertumpuk, tidak merata
Zona III : Tebal, eritrosit bergerombol, roulex
Zona IV : Sama seperti zona II dan tipis
Zona V : Sel darah tidak tertumpuk, penyebaran satu – satu, rata,
bentuk utuh
Zona VI : Penyebaran sel tersusun lebih longgar
Sedangkan kriteria pewarnaan sediaan yang baik adalah :
a. Inti leukosit berwarna ungu
b. Trombosit berwarna ungu muda dan merah muda
c. Sisa eritrosit muda berwarna bitu atau biru muda
 d. Sitoplasma lifosit berwarna biru pucat
e. Sitoplasma monosit berwarna biru
f. Granula eosinophil berwarna orange atau jingga
g. Latar belakang sediaan bersih dan biru pucat

VIII. HASIL PENGAMATAN

1. Identitas Probandus
Nama : Desak Intan Purnama
Umur : 20 Tahun
Jenis Kelamin : Perempuan

2. Hasil Pengamatan Preparat

NO HASIL PENGAMATAN KETERANGAN

Preparat Sediaan Apusan Darah Tepi
dengan panjang hapusan 2/3 kaca
objek, tidak ada lubang pada apusan.

Evaluasi SADT pada pengamatan

mikroskop :
 Lingkar merah
Eritrosit : berwarna keunguan
 Lingkar hijau
2 Leukosit : berwarna ungu muda
dengan inti ungu
 Lingkar kuning
Trombosit : berwarna ungu
 Sisa cat : terdapat sedikit sisa cat
 Area sekitar sel : putih (tidak ada
 sisa cat yang menempel pada
dasar)

IX. PEMBAHASAN
Apusan Darah Tepi atau blood smear adalah pemeriksaan laboratorium yang
melibatkan sitologi sel darah tepi yang dioleskan pada slide obyek glass. Sebagai
dasar seperti itu, blood smear sangat berharga dalam karakterisasi berbagai
penyakit klinis (Adewoyin and Nwogoh, 2015).
Untuk melihat struktur sel-sel darah dengan mikroskop cahaya pada umumnya
dibuat sediaan apus darah. Sediaan apus darah ini tidak hanya digunakan untuk
mrmpelajari sel darah tapi juga digunakan untuk menghitung perbandingan
jumlah masing-masing sel darah.
Pemeriksaan mikroskopis dari apusan darah yang telah disiapkan dan diwarnai
dengan baik oleh seorang profesional laboratorium yang berpengetahuan luas
diperlukan dan berguna secara klinis di sejumlah negara keadaan dan karena
berbagai alasan. Pemindaian apusan darah berfungsi untuk setidaknya (a)
memverifikasi hasil hematologi otomatis yang ditandai dan (b) menentukan
apakah manajemen jumlah leukosit diferensial diferensial perlu
dilakukan. Pemeriksaan / pemeriksaan apusan darah jumlah leukosit diferensial
dengan hitung darah lengkap (CBC) memberikan gambaran matologis dari kasus,
setidaknya dari sudut pandang morfologis. Blood smear kembali pandangan
dengan atau tanpa interpretasi berfungsi untuk memastikan bahwa tidak ada
temuan klinis yang signifikan tidak terjawab, selain memberikan diagnosis atau
petunjuk diagnostik, terutama jika dan ketika diprogram oleh seorang dokter.
(Gulati, 2013)
Guna pemeriksaan apusan darah:
1. Evaluasi morfologi dari sel darah tepi (eritrosit, trombosit, dan
leukosit)
2. Memperkirakan jumlah leukosit dan trombosit
3. Identifikasi parasit (misal : malaria. Microfilaria, dan
Trypanosoma).
 Bahan pemeriksaan yang terbaik adalah darah segar yang berasal dari
kapiler atau vena yang dihapuskan pada kaca obyek. Sampel yang digunakan
dapat darah kapiler atau darah dengan anti koagulan EDTA. Ethylenediamine
tetra-acetic acid merupakan antikoagulan yang sering dipakai untuk tes
hematologi rutin karena tidak mengubah bentuk sel darah. EDTA dapat dipakai
karena tidak berpengaruh terhadap morfologi eritrosit dan lekosit serta mencegah
trombosit bergumpal. Tes sebaiknya dilakukan dalam waktu kurang dari 2 jam.
Tiap 1 ul EDTA digunakan untuk 1 ml darah vena.
Meskipun EDTA kerap digunakan untuk membuat apusan darah tepi, ada
keadaan tertentu dimana EDTA tidak dapat digunakan sebagai antikoagulan darah
karena adanya pseudotrombositopenia. Sebagian besar pseudotrombositopenia
terjadi jika digunakan antikoagulan ethylenediamine tetra-acetic acid (EDTA),
prevalensinya dilaporkan 0,1%. Aglutinasi trombosit yang disebabkan oleh EDTA
terjadi akibat adanya antibodi yang bersirkulasi terhadap epitop pada kompleks
glikoprotein alfa IIb/beta IIIa membran trombosit yang hanya muncul jika
terdapat EDTA.
Sediaan apus darah tepi dapat diwarnai dengan berbagai macam metode
termasuk larutan-larutan yang sederhana antara lain: pewarnaan Giemsa,
pewarnaan acid fast, pewarnaan garam, pewarnaan wright, dan lainlain.
Pewarnaan Giemsa disebut juga pewarnaan Romanowski. Metode pewarnaan ini
banyak digunakan untuk mempelajari morfologi sel-sel darah, sel-sel lien, sel-sel
sumsum dan juga untuk mengidentifikasi parasit-parasit darah misal
Tripanosoma, Plasmodia dan lain-lain dari golongan protozoa.
Tujuan dilakukannya pewarnaan pada preparat apus darah tepi yaitu agar
memudahkan dalam melihat berbagai jenis sel dan juga dalam mengevaluasi
morfologi dari sel-sel tersebut. International Council for Standardization in
Haematology (ICSH) merekomendasikan metode pewarnaan Romanowsky karena
pewarnaan ini mampu memberikan hasil memuaskan pada apusan darah tepi
(Bain, 2014).
Beberapa pewarnaan yang termasuk dalam metode pewarnaan
Romanowsky yaitu pewarnaan Wright, Giemsa, WrightGiemsa, Leishman, May-
Grundwald dan pewarnaan Jenner. Pewarna Romanowsky mengandung pewarna
kationik atau basa seperti (1) azure B yang dapat memberikan warna biru-ungu
atau biru pada inti sel, nukleoprotein, granula basofil dan granula neutrofil, dan
(2) pewarna anion atau asam, seperti eosin Y dapat memberikan warna merah atau
oranye pada eritrosit dan granula eosinofil serta mewarnai inti sel (McKenzie,
2014 ; Bain, 2014).
Di Indonesia, pewarnaan yang umum digunakan ialah pewarnaan Giemsa
sebab Giemsa lebih tahan lama dalam iklim tropis. Beberapa klinik juga
menggunakan pewarna Wright dalam mewarnai apusan darah tepi. Terkadang
pewarnaan Giemsa juga dikombinasikan dengan Wright, dimana diharapkan
kelebihan dari tiap-tiap zat warna Giemsa dan Wright bisa didapatkan dan akan
menjadikan sediaan apus darah tepi lebih jelas terlihat secara mikroskopis dan jadi
lebih tahan lama (Riswanto, 2013 ; Gandasoebrata, 2007).
Untuk mendapatkan hasil yang akurat diperlukannya hasil pembuatan
apusan darah tepi yang baik. Adapun ciri sediaan apus yang baik adalah sebagai
berikut :
1. Ketebalan gradual, paling tebal di daerah kepala, makin menipis ke arah
ekor
2. Apusan tidak melampaui atau menyentuh pinggir kaca obyek
3. Tidak bergelombang dan tidak putus-putus
4. Tidak berlubang-lubang
5. Bagian ekor tidak membentuk bendera robek
6. Panjang apusan kira-kira 2/3 dari panjang kaca obyek
Preparat darah apus yang baik memiliki tiga bagian yaitu kepala, badan
dan ekor. Apabila diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran rendah (lensa
obyektif 10X) terdapat pembagian menjadi enam zona berdasarkan distribusi
eritrosit yaitu :
1. Zona I (irregular zone) yaitu zona dimanadistribusi eritrosit tidak teratur,
ada yang bergerombol sedikit atau banyak (tidak selalu sama masingmasing
preparat).
2. Zona II (Thin zone), yaitu zona dimana distribusi eritrosit tidak teratur,
saling bertumpukan atau berdesakan.
 3. Zona III (Thick zone), yaitu zona dimana distribusi eritrosit saling
bergerombol lebih rapat dibandingkan zona II, bertumpukan dan
berdesakan yang merupakan daerah paling luas.
4. Zona IV (Thin zone), pada zona ini keadaan sama dengan zona II.
Distribusi eritrosit tidak teratur, saling bertumpukan dan berdesakan.
5. Zona V (Even zone/regular zone), pada zona ini distribusi eritrosit tersebar
merata tidak saling bertumpukan dan berdesakan sehingga masih utuh.
6. Zona VI (Very thin zone), ini merupakan daerah yang terletak di ujung
preparat bersebelahan dengan daerah ekor. Distribusi eritrosit agak longgar
dibandingkan populasi pada zona II dan IV.
Pembacaan preparat apusan darah dapat dilakukan pada bagian atas dan
bawah pada zona IV sampai VI yang dekat dengan bagian ekor. Tekhnik
pembacaan merupakan salah satu faktor penentu dalam keberhasilan penilaian
sediaan apus darah (Santoso B, 2010). Syarat pewarnaan yang baik diantaranya :
a. Inti leukosit berwarna ungu
b. Trombosit berwarna ungu muda dan merah muda
c. Sisa eritrosit muda berwarna bitu atau biru muda
d. Sitoplasma lifosit berwarna biru pucat
e. Sitoplasma monosit berwarna biru
f. Granula eosinophil berwarna orange atau jingga
g. Latar belakang sediaan bersih dan biru pucat
Pada prakikum yang telah dilakukan pada pasien atas nama Desak Intan
Purnama, 20 tahun, jenis kelamin perempuan pengamatan didapatkan hasil
pembuatan sediaan apusan darah tepi dengan panjang apusan 2/3 kaca objek, tidak
ada lubang pada apusan sedangkan setelah diamati dimikroskop didapatkan hasil
pengamatan eritrosit berwarna keunguan, leukosit : berwarna ungu muda dengan
inti ungu, trombosit berwarna ungu, sisa cat : terdapat sedikit sisa cat dan area
sekitar sel : putih (tidak ada sisa cat yang menempel pada dasar). Apabila
dibandingkan dengan syarat apusan darah tepi yang baik, apusan yang dibuat
termasuk baik.
Kualitas slide yang buruk biasanya disebabkan oleh tekanan ke bawah yang
berlebihan, gerakan penyebaran yang lambat, atau goyangan slide penyebar di
permukaan noda. Gerakan penyebaran lambat cenderung menyebabkan panjang,
apusan tipis yang tidak memiliki tubuh padat, lapisan tipis, dan ujung berbulu
yang berkembang dengan baik. Seringkali ada goresan pada apusan. Garis linier
disusun secara horizontal ke tepi depan disebut tanda ragu-ragu dan mereka
menunjukkan keraguan dalam gerakan ke depan. Berlebihan ke bawah tekanan
akan menghasilkan slide pendek dengan tanda ragu dan ujung bulu yang kurang
berkembang wilayah monolayer. Goyangan sering karena kurangnya pengalaman
atau mencoba untuk memberikan tekanan daripada membiarkan slide penyebar
beristirahat di permukaan noda. Jika Anda kesulitan membuat slide yang
berkualitas, itu dapat membantu jika ada orang yang berpengalaman mengenali
teknik Anda
Ada beberapa sebab yang mengakibatkan apusan darah tepi menjadi tidak
layak untuk diperiksa antara lain :
NO SEBAB AKIBAT
Pemeriksaan ditunda setelah sampel
1 Distorsi atau kerusakan sel
berhasil diambil
Terjadi disproporsi sel – sel yang
Lambat melakukan apusan setelah
2 berukuran besar seperti monosit dan
darah diteteskan pada obyek glass
neutrofil
3 Kaca obyek kotor Bintik-bintik pada apusan
Apusan terlalu tebal dan pendek atau
4 Tetesan terlalu banyak/sedikit
terlalu tipis dan panjang
Sudut terlalu besar apusan terlalu
Sudut geseran terlalu besar atau
5 tebal ; sudut terlalu kecil apusan
terlalu kecil
terlalu panjang
6 Geseran terlalu lambat Penyebaran sel tidak baik
Tekanan spreader pada kaca obyek Tekanan terlalu kuat menyebabkan
7
tidak akurat apusan telalu tipis
Kelembaban yang terlalu tinggi
8 Kelembaban ruang menyebabkan apusan lama kering
sehingga eritrosit rusak
Tabel Kesalahan dalam membuat apusan darah tepi (Kiswari, 2014)
 SIMPULAN
Pada praktikum pembuatan sediaan apusan darah tepi pada pasien atas
nama Desak Intan Purnama, 20 tahun, jenis kelamin perempuan didapatkan hasil
Sediaan Apusan Darah Tepi yang sesuai kriteria yaitu eritrosit berwarna
keunguan, leukosit berwarna ungu muda dengan inti berwarna ungu, trombosit
berwarna ungu, panjang apusan 3 cm, terdapat sedikit sisa cat dan area sekitar sel
tidak ada cat yang mengendap.
 DAFTAR PUSTAKA

Adewoyin, A. and Nwogoh, B. (2015) ‘Peripheral blood film - a review’,

(December 2014).
Rudyatmi E 2012. Bahan Ajar Mikroteknik. Semarang: Jurusan Biologi FMIPA
UNNES. Subowo. 2006. Histologi Umum. Jakarta : PT Bumi Aksara.
Gulati, Gene, Jinming, Lagu MD, Dulau Florea Alina, MD, dan Jerald Gong, MD.
2015. Purpose and Criteria for Blood Smear Scan, Blood Smear
Examination, and Blood Smear Review. Department of Pathology,
Anatomy, and Cell Biology, Jefferson Medical College and Thomas
Jefferson University Hospital, Philadelphia, USA
JENNIFER A. NEEL, DVM, DACVP (CLINICAL) ASSOCIATE PROFESSOR,
CLINICAL PATHOLOGY NC STATE COLLEGE OF VETERINARY
MEDICINE. BLOOD SMEAR BASICS
Kurniawan B. Liong. 2014. Konfirmasi Apusan Darah Tepi untuk
Pseudotrombositopenia. CDK-217/ vol. 41 no. 6, th. 2014. Bagian Ilmu
Patologi Klinik, Fakultas Kedokteran, Universitas Hasanuddin, Makassar,
Sulawesi Selatan, Indonesia
Mac Neal WJ. Methylene violet and methylene azure. The Journal of Infectious
Diseases 1906; 3(3):412-33.
Horobin RW. How Romanowsky stains work and why they remain valuable
including a proposed universal Romanowsky staining mechanism and a
rational troubleshooting scheme. Journal of Biotechnic & Histochemistry
2011; 86(1):36-51.
Gandasoebrata R. 2007. Penuntun Laboratorium Klinik. Dian Rakyat, Jakarta.
Riswanto. 2013. Pemeriksaan Laboratorium Hematologi. Alfamedia dan Kanal
Medika, Yogyakarta.
Bain, B.J.. 2014. Blood cells: a practical guide. John Wiley & Sons.
Kiswari, R. 2014. Hematologi dan Transfusi. Elangga, Jakarta.
McKenzie, S.B. 2014. Clinical Laboratory Hematology. Pearson Education Inc,
New Jersey.