Laporan Praktikum Biokimia Kinetika Reak
Laporan Praktikum Biokimia Kinetika Reak
PERCOBAAN KE VII
Disusun Oleh:
2015
I. Tujuan
Tujuan dilakukannya praktikum ini adalah agar mahasiswa dapat mengetahui
dan memahami kinetika reaksi enzim dan faktor-faktor yang mempengaruhi
kondisi optimum suatu enzim.
Kadar enzim yang tinggi akan mempengaruhi kecepatan reaksi secara linier
(kecepatan bertambah konstan). Dapat dikatakan bahwa hubungan antara konsentrasi
enzim dengan kecepatan reaksi enzimatis berbanding lurus. kecepatan reaksi suatu
enzim satu dengan yang lain berbeda-beda meskipun mempunyai konsentrasi enzim
yang sama. Konsentrasi enzim yang sangat tinggi dalam suatu sistem yang kompleks
akan berpengaruh terhadap terhadap kecepatan reaksi. (Dwidjoseputro, 1992)
Enzim dapat bekerja dengan beberapa cara, yang kesemuaannya menurunkan ΔG‡:
Tanpa bantuan enzim, semua bahan makanan yang masuk ke dalam tubuh hanya
sekedar numpang lewat. Enzim merupakan komponen penting yang diperlukan untuk
proses pencernaan dan penyerapan makanan. Kini pemahaman masyarakat mengenai
enzim pencernaan dan fungsinya masih sangat rendah. Umumnya masyarakat hanya
mengaitkan masalah pencernaan dengan penyakit maag. Enzim bertanggung jawab
menjaga kesehatan dan proses metabolisme di dalam tubuh. Kekurangan enzim dapat
menyebabkan tubuh mengalami gangguan pencernaan yang selanjutnya
menyebabkan gangguan penyerapan (malabsorpsi). Gejala malabsorpsi adalah
kembung pada perut, nafsu makan menurun, diare dan perut tidak nyaman. Salah satu
solusi untuk mengatasi masalah malabsosrpsi akibat kekurangan enzim adalah dengan
mengkonsumsi suplemen enzim. Kekurangan enzim akan menyebabkan tubuh
mengalami gangguan pencernaan atau dalam istilah kedokteran disebut maldigesti,
yang selanjutnya dapat menyebabkan gangguan pencernaan atau malabsorbsi. Di sisi
lain, kekurangan enzim juga akan mengakibatkan timbulnya gas yang berlebih di
dalam sistem pencernaan, baik di lambung maupun usus halus dan usus besar
(Almatsier, 2003).
Pada praktikum ini yang digunakan adalah enzim tripsi. Berikut penguraian enzim
tipsin:
Tripsin adalah protease serina pankreas dengan substrat khusus rantai lysine
dan arginin. Di manusia, enzim ini memproduksi enzim inaktif dari tripsinogen.
Tripsinogen masuk usus kecil, biasanya melalui cairan empedu dimana tripsinogen
diubah menjadi tripsin aktif. (Alghamdi, 2010).
Fungsi enzim tripsin adalah mengubah protein menjadi bentuk yang lebih
sederhana, seperti pepton dan asam amino. Enzim tripsin dihasilkan oleh kelenjar
pankreas dan dialirkan ke usus 12 jari (duodenum).Selain itu fungsi enzim tripsin
adalah untuk mengubah tripsinogen menjadi tripsin aktif dan menghidrolisis protein
yang dihasilkan oleh pancreas. (Poedjiadi, 2006).
Manfaat enzim tripsin adalah untuk membuat vaksin meningitis dari pankreas
babi dan yang berperan adalah enzim tripsin di dalam pankreas babi.
(Sectiocadavaris, 2011)
Pada praktikum ini substrat yang digunakan adalah kasein. Berikut penguraian
kasein:
A = e.b.c
dimana :
A = absorban
e = absorptivitas molar
b = tebal kuvet (cm)
c = konsentrasi
(Rohman, 2007)
INSTRUMEN SPEKTROFOTOMETRI UV – VIS
PRINSIP KERJA
Cahaya yang berasal dari lampu deuterium maupun wolfram yang bersifat
polikromatis di teruskan melalui lensa menuju ke monokromator pada
spektrofotometer dan filter cahaya pada fotometer. Monokromator kemudian akan
mengubah cahaya polikromatis menjadi cahaya monokromatis (tunggal). Berkas-
berkas cahaya dengan panjang tertentu kemudian akan dilewatkan pada sampel yang
mengandung suatu zat dalam konsentrasi tertentu. Oleh karena itu, terdapat cahaya
yang diserap (diabsorbsi) dan ada pula yang dilewatkan. Cahaya yang dilewatkan ini
kemudian di terima oleh detector. Detector kemudian akan menghitung cahaya yang
diterima dan mengetahui cahaya yang diserap oleh sampel. Cahaya yang diserap
sebanding dengan konsentrasi zat yang terkandung dalam sampel sehingga akan
diketahui konsentrasi zat dalam sampel secara kuantitatif. (Rohman, 2007)
HAL – HAL YANG PERLU DIPERHATIKAN
1. Larutan yang dianalisis merupakan larutan berwarna
Apabila larutan yang akan dianalisis merupakan larutan yang tidak berwarna,
maka larutan tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi larutan yang
berwarna. Kecuali apabila diukur dengan menggunakan lampu UV.
2. Panjang gelombang maksimum
Panjang gelombang yang digunakan adalah panjang gelombang yang
mempunyai absorbansi maksimal. Hal ini dikarenakan pada panajgn
gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal karena pada panjang
gelombang tersebut, perubahan absorbansi untuk tiap satuan konsentrasi
adalah yang paling besar. Selain itu disekitar panjang gelombang maksimal,
akan terbentuk kurva absorbansi yang datar sehingga hukum Lambert-Beer
dapat terpenuhi. Dan apabila dilakukan pengukuran ulang, tingkat
kesalahannya akan kecil sekali.
3. Kalibrasi Panjang gelombang dan Absorban
Spektrofotometer digunakan untuk mengukur intensitas cahaya yang
dipancarkan dan cahaya yang diabsorbsi. Hal ini bergantung pada spektrum
elektromagnetik yang diabsorb oleh benda. Tiap media akan menyerap cahaya
pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawa yang terbentuk.
Oleh karena itu perlu dilakukan kalibrasi panjang gelombang dan absorban
pada spektrofotometer agar pengukuran yang di dapatkan lebih teliti.
(Rohman, 2007)
III. Alat Dan Bahan
Alat Bahan
Tabung reaksi Larutan TCA 20%
Batang pengaduk Larutan kasein 2% (b/v)
Pipet ukur 1 mL, 5 mL, 10 mL Larutan dapar fosfat 0,1M pH 8
Pipet tetes Larutan NaOH
Water bath 35oC Aquadest
Kertas saring Reagen Folin-Ciocalteu
Spektofotometer Larutan Tripsin
Corong kaca
Tabung t = 20 menit
Setelah semua tabung diisi dengan kasein yang berwarna putih keruh.
Tabung Setelah didinginkan dan ditambahkan TCA20%
I Bening
II Agak putih
III Keruh, terdapat gumpalan putih tersebar
IV Terbentuk endapan keruh
V Terbentuk endapan
Pengolahan data absorbansi
Perhitungan
1. Menghitung ΔA
ΔA = At20 – At0
ΔA1 = 0.014 – 0.008 = 0.006
ΔA2 = 0.024 – 0.005 = 0.019
ΔA3 = 0.110 – 0.007 = 0.109
ΔA4 = 0.100 – 0.002 = 0.098
ΔA5 = 0.240 – 0.009 = 0.231
2. Menghitung V
V = ΔA/Δt
Δt = t20 – t0
Δt = 20 – 0 = 20 menit
0.006
V1 = = 0.3 𝑥 10−3
20
0.019
V2 = = 0.95 x 10−3
20
0.109
V3 = = 5.15 x 10−3
20
0.098
V4 = = 4.9 x 10−3
20
0.231
V5 = = 11.5 x 10−3
20
3. Menghitung S
𝑨𝒍𝒊𝒒𝒖𝒐𝒕
S= x 2%
𝑽𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍
0.1
S1 = 𝑥 2 % = 0.29 𝑥 10−3
7
0.5
S2 = 𝑥 2 % = 1.43 𝑥 10−3
7
1.0
S3 = 𝑥 2 % = 2.86 𝑥 10−3
7
3.0
S4 = 𝑥 2 % = 8.57 𝑥 10−3
7
5.0
S5 = 𝑥 2 % = 14.29 𝑥 10−3
7
4. Grafik Michaelis-Menten
S (X) V (Y)
0.29 𝑥 10−3 0.3 𝑥 10−3
1.43 𝑥 10−3 0. 95 x 10−3
2.86 𝑥 10−3 5.15 x 10−3
8.57 𝑥 10−3 4.9 x 10−3
14.29 𝑥 10−3 11.5 x 10−3
a = 6.6969 x 10−4
b = 0.7088
R = 0.9300
Persamaan Michaelis-Menten
Hubungan antara V dengan S
0.014
0.012
0.01
0.008
V
0.006
0.004
0.002
0
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.014 0.016
S
5. Grafik Lineweaver-Burk
1 1
(𝑋) (𝑌)
𝑆 𝑉
3,448.27 3,333.33
699.30 1,052.63
349.65 194.17
116.68 204.08
69.97 86.95
a = 79.8107
b = 0.9547
R = 0.990
3500
3000
2500
1/V
2000
y = 0.9548x + 79.811
1500 R² = 0.9806
1000
500
0
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
1/S
6. Menghitung Vmaks dan 𝑲𝑴
𝑲𝑴
b(gradien) =
𝑽𝒎𝒂𝒌𝒔
1 1
=a maka, Vmaks =
𝑉𝑚𝑎𝑘𝑠 𝑎
1
Vmaks = 79.811
𝐾𝑀 = b(gradien) x Vmaks
𝐾𝑀 = 0.9548 x 0.0125
𝐾𝑀 = 0.011935
Gambar
VI. Pembahasan
Pada praktikum kali ini dilakukan uji untuk mengetahui kinetika reaksi enzim
yang berikatan dengan substrat.
Pertama-tama pengujian dilakukan pada saat t = 0 menit.
Disiapkan tabung reaksi sebanyak 5 buah kemudian diisi oleh buffer
fosfat dalam berbagai konsentrasi. Di sini buffer fosfat berguna untuk
mempertahankan pH optimum enzim agar tidak mudah berubah akibat
penambahan sedikit asam maupun basa. Lalu dimasukkan tripsin ke dalam
masing-masing tabung. Tripsin di sini berperan sebagai enzimnya. Di mana
fungsi enzim tripsin adalah untuk mengubah tripsinogen menjadi tripsin aktif
dan menghidrolisis protein yang dihasilkan oleh pancreas, seperti teori yang
disampaikan Poedjiadi (2006). Kemudian ke dalam masing-masing tabung
ditambahkan larutan TCA 20%. Larutan TCA ini berguna sebagai zat yang
dapat menghentikan mekanise pengikatan antara enzim dan substrat, serta pH
optimum enzim tripsin adalah sekitar 7.8-8.7 (Anonim2, 2015) . Berikutnya
semua tabung diinkubasi pada suhu 35oC, suhu ini merupakan suhu optimum
kerja enzim tripsin. Setelah diinkubasi, tabung diambil dan ke dalam masing-
masing tabung dimasukkan larutan kasein dalam berbagai konsentrasi, kasein
berperan sebagai substrat, di mana kasein merupakan golongan protein yang
komposisinya mencapai 80% dari komposisi keseluruhan protein susu
(Anonim, 2014). Setelah itu semua tabung direndam di dalam air es dengan
tujuan memperjelas bentuk dari endapan jika terdapat endapan. Setelah
penambahan kasein dan didinginkan di air es tersebut, hasil yang didapat
praktikan adalah bahwa dari tabung ke 1 sampai tabung ke 5 kekeruhan pada
larutan terlihat semakin jelas. Hal ini terjadi karena perbedaan konsentrasi
buffer fosfat dan konsentrasi substrat yang berbeda pada setiap tabung. Dapat
dinyatakan bahwa selain menurunnya konsentrasi buffer fosfat pada tabung 1
sampai tabung 5, konsentrasi substrat malah semakin banyak, namun
bukannya meningkatkan kinetika reaksi enzim, tetapi malah menurunkan
kinetikita reaksinya disebabkan konsentrasi enzim yang konstan diberikan
pada setiap tabung, sehingga hanya tabung 1 saja yang dapat lebih banyak
mengubah substrat menjadi produk yang ditandai lebih banyaknya larutan
yang bening dibandingkan dengan larutan yang putih keruh. Sebaliknya, pda
tabung 5 keseluruhan larutan berwarna putih keruh dan terdapat endapan,
adanya endapan menandakan bahwa enzim terdenaturasi sehingga tidak dapat
mengubah substrat menjadi produk. Tahap selanjutnya, kelima larutan
disentrifugasi dan disaring untuk mendapatkan supernatantnya. Hasil filtrasi
lebih lanjut dilakukan dengan cara metode Anson, yaitu memakai prinsip
kerja spektrofotometri yang menggunakan instrument uv-vis. Untuk
mendapatkan data serapan dari kelima supernatant yang ada harus
ditambahkan dulu oleh NaOH, yang berguna untuk menetralkan TCA-filtrat
yang bersifat asam, danditambahkan ragen Folin-Ciocalteu yang berguna
sebagai senyawa kromogenik sekaligus senyawa yang akan mencari gugus
aromatic pada enzim yang berada di supernatant agar dapat mengubah
fosfotungstat dan malibdan menjadi tungstat dan malibdenum yang hasilnya
merupakan senyawa berwarna biru kehijauan agar dapat diukur serapannya
pada instrument spektrofotometer yang memiliki syarat bahwa larutan harus
bersifat netral, tidak boleh asam maupun basa, dan larutan yang diukur
serapannya harus memiliki warna agar dapat terbaca.
Setelah kelima supernatant telah berwarna, segera dilakukan pencarian
nilai absorbansi yang sebelumnya harus ditunggu selama 10 menit guna
mengoptimalkan kerja reagen Folin-Ciocalteu terhadap supernatant. Pengujian
dilakukan pada panjang gelombang 650 nm (panjang gelombang sinar
tampak). Lalu di dapatlah hasil beberapa serapan seperti yang ada pada data
pengamatan.
Penjelasan Kurva
Kurva pertama adalah kurva Michealis-Menten, pada kurva ini terlihat
fluktuatif sehingga sulit sekali ditentukan Vmaks dari kurva tersebut.
Seharusnya kurva yang terbentuk seperti:
Sehingga jika kurva seperti yang ada di atas, maka dapat langsung dihitung
Vmaks dan dapat ditentukan nilai KM-nya. Namun kurva yang didapat tidak
sesuai yang praktikan inginkan, beberapa faktor penyebab terjadinya fluktuatif
pada kurva ini yaitu akibat enzim yang digunakan mungkin saja sudah
mendekati batas daluwarsanya, dan data absorbansi pada tabung 2 pada t = 20
menit kami dapatkan dari kelompok lain, yaitu dari kelompok 4 karena pada
saat pengerjaan tabung 2 oleh kelompok 2 mengalami kesalahan dalam data
absorbansinya, sehingga tidak memungkinkan praktikan pada kelompok ini
untuk memakai data absorbansi dari kelompok 2.
Kurva yang kedua adalah kurva Linewaver-Burk, kurva ini dibuat
dengan tujuan agar kurva yang dihasilkan memiliki kemiringan sehingga
dapat dengan tepat didapatkan hasil regresi yang digunakan untuk menghitung
nilai Vmaks dan KM.
Kesimpulan dari kedua kurva adalah bahwa kemampuan berikatan
enzim dan substrat menurun akibat beberapa faktor, baik dari konsentrasi
enzimnya, konsentrasi substratnya, senyawa tambahan yang bersifat
menghentikan mekanisme kerja ezim berikatan dengan substrat, dan suhu
serta pH optimum enzim.
Nilai Vmaks yang dihasilkan seharusnya sedikit lebih besar karena
jika konsentrasi substrat meningkat, maka hal tersebut dapat meningkatkan
kecepatan awal reaksi serta meningkatkan kemampuan enzim untuk berikatan
dengan substrat. Dan saat sudah dalam keadaan enzim yang jenuh akibat
banyaknya substrat akan dihasilkan nilai Vmaks yang konstan, nilai ini
seharusnya cukup besar jika kemampuan berikatan enzim dan substatnya
benar-benar tinggi, namun hasil yang praktikan dapatkan yaitu nilai Vmaks
hanya 0,0118 dan nilai KM = 0,01192. Yang menandakan benar bahwa
kemampuan berikatan enzim dan substrat menurun ditandai tidak besarnya
nilai Vmaks yang dihasilkan. Dan karena nilai Vmaks kecil, maka
mempengaruhi hasil dari nilai KM juga, sehingga nilai KM yang didapat juga
kecil.
VII. Kesimpulan
1. Kerja enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu pH, suhu,
konsentrasi enzim dan konsentrasi substrat
2. Enzim tripsin mempunyai pH optimum 7,8 – 8,7
3. Metode yang dilakukan pada percobaan kinetika kerja enzim ada tiga
metode yaitu, metode Michaelis-Menten (penentuan kurva 1),
Lineweaver-Burk (penentuan kurva 2) dan metode Anson (pencarian nilai
serapan masing-masing supernatant).
4. Nilai absorbansi yang dihasilkan dari percobaan pada tiap tabung t=0 dan
t=20 cenderung mengalami peningkatan.
5. Grafil Michaelis-Menten memberikan kurva yang fluktuatif.
6. Grafik Lineweuver-burk yang dihasilkan yang dihasilkan dari praktikum
ini tidak linier atau tidak lurus.
7. Nilai Vmax yang didapat = 0.0125 ppm/menit
8. Nilai Km yang didapat = 0.011935
DAFTAR PUSTAKA
Pukul 18:15
Anonim.2014.Kasein.http://id.wikipedia.org/wiki/Kasein
Pukul 18:17
Anonim1.2015.Enzim. http://id.wikipedia.org/wiki/Enzim
Pukul 18:21
Pukul 18:23
Pukul 19:05