MAKALAH KSK BIOKIMIA III

Dosen:
Dr. Endang Saepudin

PRODUKSI THEOBROMINE OLEH N-DEMETILASI DARI KAFEIN

MENGGUNAKAN REKAYASA METABOLIK E. coli

Oleh:

Rina Karunia Rahim 1506729090

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS INDONESIA

DEPOK

2018
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Theobromine mengurangi tekanan darah karena pelebaran pembuluh darah dan memiliki
efek sebagai stimulan sistem saraf pusat (Mumford dkk. 1994). Biasanya digunakan sebagai
diuretik, stimulan miokardiak, atau vasodilator (Stavric 1988). Theobromine berfungsi sebagai
antioksidan, prooxidant (Azam dkk. 2003), dan bronchodilator (LIPMAN 1993). Theobromine
juga telah digunakan dalam perawatan kulit alami dan agen pelangsing yang disebut Sveltan
(Libragen 2016) dan terbukti menjadi inhibitor batuk yang efektif (Usmani dkk. 2005).
Theobromine diproduksi dengan metode alami dan sintetis. Metode alami konvensional
menggunakan ekstraksi theobromine dari biji kakao oleh pelarut, air, atau cairan superkritis
(Saldaña dkk. 2002). Proses ini mahal, tidak spesifik, dan melibatkan penggunaan tekanan
operasi tinggi dan pelarut organik beracun (Gokulakrishnan dkk. 2005). Theobromine juga dapat
disintesis secara kimia dari 3-methylxanthine melalui metilasi oleh dimethylsulfate sebagai
methylating agent (Christ 2008). Metode ini tidak praktis karena 3-methylxanthine jauh lebih
mahal daripada theobromine (Algharrawi dkk. 2015). Metode kimia yang tidak ramah
lingkungan ini menggunakan beberapa bahan kimia, beberapa reaksi, dan kondisi reaksi yang
keras (Hutzenlaub dan Pfleiderer 1979).

Proses produksi theobromine alternatif yang menguntungkan lingkungan adalah melalui

biokatalis. Kafein adalah bahan baku yang banyak tersedia dari komoditas pertanian, kopi, yang
dapat dikonversi ke nilai yang lebih tinggi dari theobromine yang tidak beracun. Sudah beberapa
peneliti telah melaporkan produksi theobromine menggunakan bakteri yang mampu
mendegradasi kafein (Yamada 1993). Bakteri yang paling dipelajari adalah Pseudomonas putida
CBB5, di mana semua gen yang terlibat dalam sekuen N-demetilasi dari kafein ke theobromine,
kemudian ke 7-methylxanthine dan xanthine (Yu dkk. 2009) telah sepenuhnya dikarakterisasi.

Penelitian ini mendeskripsikan metode menggunakan E. coli yang direkayasa secara

metabolik dengan gen ndmA dan ndmD, untuk konversi kafein secara langsung ke theobromine
(produk utama (konversi 98,5%)) dan paraxanthine (produk minor (konversi 1,5%)). Nomor
salinan yang berbeda dari gen-gen ini dimasukkan ke dalam E. coli menggunakan dua vektor
yang kompatibel untuk menghasilkan lima strain yang direkayasa secara metabolik. Strain
rekayasa metabolik ini digunakan untuk produksi theobromine dan paraxanthine dari kafein.
Theobromine adalah produk utama karena kafein N1-demetilasi yang sangat selektif oleh NdmA.
Paraxanthine adalah produk minor karena N3-demetilasi tidak selektif untuk NdmA. Strain
optimal dengan konversi kafein tertinggi dipilih untuk konversi bio-katalitik kafein ke
theobromine. Bioproses ini melibatkan persiapan biokatalis, reaksi N-demetilasi dari kafein ke
theobromine dan hasil theobromin yang sangat murni (hasil molar 79%). Konversi kafein ke
theobromine (dan paraxanthine) terjadi pada suhu dan tekanan sekitar, dan ramah lingkungan.

1.2. Rumusan Masalah

1. Bagaimana proses produksi biologis theobromine dari kafein menggunakan E. coli yang
direkayasa secara metabolik?
2. Bagaimana cara untuk mengembangkan platform bio-katalitik baru menggunakan N-
demethylase?
1.3. Tujuan
1. Mengetahui produksi theobromine dari kafein dengan proses biologis menggunakan E.
coli yang direkayasa secara metabolik.
2. Mengetahui cara untuk mengembangkan platform bio-katalitik baru menggunakan N-
demethylase, untuk produksi dimethylxanthines (theobromine, paraxanthine, dan
theophylline) dan monomethylxanthines (1-, 3-, dan 7-methylxanthines) dari bahan
baku murah, seperti kafein.
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Theobromine

Theobromine (3,7-dimethylxanthine) dan paraxanthine (1,7-dimethylxanthine) merupakan

sekelompok senyawa yang dikenal sebagai purin alkaloid, yang berasal dari nukleotida purin.
Keduanya adalah produk metabolisme kafein pada bakteri dan tumbuhan (Dash dan Gummadi
2006). Theobromine ditemukan secara alami dalam biji kakao (Suzuki dan Waller 1984) dan
merupakan sumber dari rasa coklat yang pahit. Pertama kali diidentifikasi pada tahun 1841, dan
namanya berasal dari tanaman coklat "Theobroma" yang berarti "makanan para dewa"
(Weinberg dan Bealer 2001). Paraxanthine (PX) adalah metabolit utama kafein yang ditemukan
dalam tubuh manusia (Müller 1993).

2.2. Kafein
Kafein (1,3,7-trimethylxanthine) adalah zat farmakologis utama yang dikonsumsi oleh
penduduk. Hal ini ditemukan dalam banyak minuman dan minuman umum seperti kopi, teh,
coke, dll. Kafein telah dilaporkan memiliki beberapa efek samping seperti peningkatan tekanan
darah dan detak jantung, insomnia, kecemasan, diuresis, agitasi (Ammon 1991), dan mengurangi
biosintesis kolagen di kulit (Donejko dkk. 2014).

2.3. Escherichia coli

Escherichia coli, atau biasa disingkat E. coli, adalah salah satu jenis spesies utama bakteri
gram negatif. Pada umumnya, bakteri yang ditemukan oleh Theodor Escherich ini dapat
ditemukan dalam usus besar manusia. Kebanyakan E. Coli tidak berbahaya, tetapi beberapa,
seperti E. Coli tipe O157:H7, dapat mengakibatkan keracunan makanan yang serius pada
manusia yaitu diare berdarah karena eksotoksin yang dihasilkan bernama verotoksin. Toksin ini
bekerja dengan cara menghilangkan satu basa adenin dari unit 28S rRNA, sehingga
menghentikan sintesis protein.[1] Sumber bakteri ini contohnya adalah daging yang belum masak,
seperti daging hamburger yang belum matang. E. Coli yang tidak berbahaya dapat
menguntungkan manusia dengan memproduksi vitamin K2, atau dengan mencegah bakteri lain di
dalam usus. E. coli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika. Biasa digunakan
sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untuk dikembangkan. E. coli
dipilih karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah dalam penanganannya.

Klasifikasi ilmiah:

Domain : Bacteria
Filum : Proteobacteria
Kelas : Gammaproteobacteria
Ordo : Enterobacteriales
Famili : Enterobacteriaceae
Genus : Escherechia
Spesies : E. coli

Gambar 1. Escherichia coli

(Sumber: https://alchetron.com/Theodor-Escherich)

2.4. Rekayasa Metabolik

Rekayasa metabolik adalah teknik mutakhir dalam rekayasa genetika guna memperoleh sel
mutant yang unggul untuk menghasilkan produk kimia industri bernilai jual tinggi. Berbeda
dengan teknik rekayasa genetika di masa lalu yang bersifat acak, metabolic engineering bersifat
sistematis dan berdasarkan model metabolism yang didukung data lengkap sehingga bisa
memberikan hasil lebih baik.
2.5. N-demetilasi

Demetilasi adalah penghilangan gugus metil (CH3-) dari asam nukleotida, protein, dan molekul
lainnya. Biasanya menggunakan enzim demelilase yang penting pada mekanisme modifikasi
epigenetik.
 BAB III
METODE PENELITIAN

3.1. Bahan

Kafein, theobromine, dan paraxanthine dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Digunakan
media dehidrasi Luriaï Bertani Lennox (LB), Terrific Broth (TB), dan Super Broth (SB) dari
Becton Dickinson and Company (Sparks, MD). Isopropil ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) dari
RPI Corp (Mt. Prospect., IL). Semua metanol yang digunakan untuk pemisahan kromatografi
adalah HPLC-grade dari (J.T. Baker, Phillipsberg, NJ).

3.2. Pertumbuhan Sel dan Ekspresi Protein

Daftar semua strain E. coli yang digunakan dalam proyek ini diberikan pada Tabel 1. Sel-sel
ditanam dalam media 2XLB, TB, atau SB
dengan antibiotik yang tepat pada suhu
37°C dengan pengocokan pada 250 rpm.
Medium 2XLB disiapkan dengan
menggandakan bubuk LB. TB dan SB disiapkan sesuai dengan petunjuk. Konsentrasi antibiotik
yang digunakan adalah 34 μg / mL kloramfenikol dan 100 µg / mL ampisilin.

Tabel 1. Strain E. coli yang direkayasa secara metabolik

3.3. Reaksi N-demethylation dari Kafein

Microcentrifuge tubes (2 mL) digunakan untuk melakukan semua reaksi demethylation.

Total volume reaksi di masing-masing tabung ini adalah 1 mL dengan konsentrasi kafein awal 1
mM. Dipelajari konversi kafein lengkap berada pada suhu 30°C dengan kecepatan 400 rpm.
Konsentrasi kafein, theobromine, dan paraxanthine ditentukan dengan secara berkala mengambil
100 µL sampel dari campuran reaksi, dan dianalisis dengan HPLC dengan membandingkan
dengan larutan standar. Setelah semua kafein dikonsumsi, campuran pasca-reaksi disentrifugasi
pada 10.000 x g selama 20 menit untuk memisahkan supernatan (produk) dari sel. Disiapkan
supernatan untuk pemisahan kromatografi dengan penyaringan dan larutan supernatan akhir
setelah pemisahan sel adalah 1,95 L.

3.4. M etode HPLC Preparasi dan Isolasi Produk

Pemisahan theobromine pertama kali dilakukan dengan memasukkan supernatan ke dalam

sistem kromatografi preparatif untuk pemisahan 1- dan 3-methylxanthine. Molekul theobromine
terelusi dari kolom dan melewati detektor array fotodioda, lalu spektrum penyerapan UV-vis
dicatat. Dua pompa digunakan dalam kromatografi preparatif (beroperasi pada 2,5 mL / menit).
Pompa pertama digunakan untuk mengirimkan pelarut dan yang kedua digunakan untuk
menyuntikkan 25 mL campuran reaksi pasca 10 menit. Pada akhir pemisahan kromatografi,
larutan dikumpulkan dan kemudian dipekatkan dengan penguapan di bawah vakum pada 70°C.
Volume larutan theobromine dikurangi dengan penguapan hingga 300 mL. Larutan pekat yang
dihasilkan akhirnya dikeringkan pada 140°C dalam oven pengeringan selama 4 jam untuk
menghasilkan bubuk theobromine yang sangat murni.

3.5. Prosedur Analitis

Sistem HPLC, dilengkapi dengan kolom Hypersil BDS C18 4.6 x 125 mm sebagai fase
diam, digunakan untuk mengidentifikasi dan mengukur kafein, theobromine, dan paraxanthine.
Laju aliran fase gerak (5% metanol-95% air- 0,5% asam asetat) adalah 0,5 mL / menit. NMR dan
Resolusi Tinggi LC-MS digunakan untuk mengkonfirmasi kemurnian teobromin yang
dihasilkan.
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Pemeriksaan Awal Produksi Theobromine dan Paraxanthine oleh E. coli yang
Diekstraksi Secara Metabolisme

Lima strain E. coli yang sebelumnya direkayasa untuk memproduksi 3-methylxanthine dari
theophylline disaring untuk produksi theobromine dan paraxanthine dari kafein. Strain ini adalah
pAD1, dDA, pAD1dAA, pAD1dDA, dan pAD1dDD (Tabel 1). Gen-gen tunggal dan ganda dari
N-demethylase NdmA dan NdmD digabungkan ke dalam plasmid yang kompatibel dan diubah
menjadi E. coli BL21 (DE3).

pAD1 dan dDA, keduanya memendam plasmid tunggal, menunjukkan konversi kafein
yang hampir identik dengan produk. Penambahan plasmid dAA ke strain pAD1 menghasilkan
strain pAD1dAA, yang menunjukkan peningkatan hampir 40% pada konversi kafein.
Mengoptimalkan nomor salinan gen menjadi pendekatan terbaik untuk mendapatkan hasil
produk yang tinggi. Secara khusus, meningkatkan perkiraan jumlah copy gen ndmD meningkat
aktivitas, menunjukkan bahwa ekspresi
ndmD mempengaruhi aktivitas ke tingkat
yang lebih besar daripada ekspresi ndmA.
Setelah dua jam, strain pAD1dDD
menghasilkan paling banyak theobromine
dan paraxanthine (Tabel 2), dan dipilih untuk pekerjaan lebih lanjut untuk menghasilkan dan
memurnikan TB dari kafein.

Tabel 2. Konsentrasi methylxanthines oleh 5 strain E. coli yang direkayasa secara metabolik
4.2. Optimasi Reaksi dan Pertumbuhan Kondisi untuk Produksi Theobromine

Untuk menentukan konsentrasi sel yang dibutuhkan untuk mencapai konversi kafein 1 mM
menjadi theobromine dan paraxanthine, tiga konsentrasi yang berbeda (10, 15, dan 20 mg / mL)
diuji. Dengan meningkatnya konsentrasi sel dalam pengujian akan meningkatkan laju konsumsi
kafein. Pada konsentrasi sel 10 mg / mL, 90% kafein dikonsumsi dalam waktu dua jam yang
sama dengan 15 mg / mL, dan dalam 90 menit oleh 20 mg / mL sel. Mayoritas kafein dikonsumsi
pada jam pertama reaksi, dengan 81, 91, dan 98% kafein dikonsumsi oleh 10, 15, dan 20 mg /
mL sel. Dalam semua kasus, theobromine adalah produk utama dan paraxanthine adalah produk
minor. Dua jam sebagai waktu reaksi yang wajar untuk konversi kafein ke theobromine dan
paraxanthine, konsentrasi sel 15 mg / mL dipilih untuk produksi produk.

Dipelajari efek dari tiga media pertumbuhan yang berbeda, 2XLB, TB, dan SB, pada
pertumbuhan dan produktivitas theobromine dengan strain pAD1dDD. Tabel 3 menunjukkan
berat sel basah yang didapat dari masing-masing media pertumbuhan, dan substrat serta produk
yang ditemukan dalam campuran reaksi 1 mL setelah dua jam waktu reaksi. Medium 2XLB
menghasilkan jumlah sel terendah, sementara media TB dan SB menghasilkan sekitar 10% dan
27% massa sel lebih tinggi. Sel menghasilkan konversi kafein ke theobromine (dan
paraxanthine) tertinggi pada SB. Ini adalah
dasar pemilihan SB sebagai media
pertumbuhan untuk produksi theobromine.
Dalam semua kasus, konversi kafein ke
theobromine dan paraxanthine sekitar
98,5% dan 1,5% masing-masing.

Tabel 3. Perbandingan pertumbuhan dan aktivitas sel dari strain pAD1dDD yang ditanam di 2XLB, TB
dan SB.

4.3. Produksi Lebih Besar dari Theobromine

Produksi theobromine menggunakan strain pAD1dDD ditingkatkan hingga 4L untuk

menunjukkan kelayakan pendekatan biologis. Strain pAD1dDD ditumbuhkan dalam medium SB
semalaman menghasilkan 30,2 g sel basah. Jumlah sel ini cukup untuk melakukan reaksi
biokatalitik 2 L dengan konsentrasi kafein awal 1 mM dan suspensi sel 15 mg / mL. Konsentrasi
substrat dan pembentukan produk dalam reaksi N-demethylation sebanding dengan jumlah
biokatalis yang digunakan.

Reaksi dilakukan pada suhu 30°C dan kecepatan pengocokan 250 rpm. Analisis HPLC
awal menunjukkan bahwa kafein benar-benar dikonsumsi dalam waktu dua jam. Theobromine
yang dihasilkan selama periode waktu tersebut adalah 0,983 mM (177 mg / L). Supernatan
pasca-reaksi 1,95 L, yang termasuk theobromine kemudian diuapkan di bawah vakum untuk
mengurangi volume menjadi 1 L. Selanjutnya, theobromine dipisahkan dengan kromatografi
preparatif di mana waktu retensi theobromine adalah 102 menit. 1,1 L larutan theobromine
dikumpulkan dari kolom preparatif dalam botol. 98,3% konversi kafein ke theobromine dalam
reaksi 2 L menghasilkan produksi 354 mg theobromine. Namun, 10% dari campuran pasca-
reaksi digunakan untuk optimasi pemisahan produk melalui kromatografi preparatif. Akibatnya,
jumlah theobromine yang dimuat ke kolom untuk pemurnian dan pemulihan adalah 318 mg.
Setelah pengeringan, 255 mg bubuk theobromine murni diperoleh. Ini menunjukkan bahwa hasil
theobromine selama pemisahan dan pemurnian berdasarkan jumlah theobromine yang
disuntikkan ke dalam kolom adalah 80%. Ini adalah konversi tertinggi (98,5%) kafein ke
theobromine yang dikatalisis oleh E. coli yang direkayasa secara metabolik, dengan hasil akhir
80%.

4.4. Karakterisasi Anologis Biokimia Yang Diproduksi Theobromine

Analytical HPLC digunakan untuk menilai kemurnian bubuk theobromine yang diproduksi
secara biologis dengan membandingkan dengan standar. Kedua sampel dielusi pada waktu
retensi yang sama dari kolom HPLC analitis. Spektrum LC-MS Resolusi Tinggi dari
theobromine yang dihasilkan secara autentik dan biologis adalah identik. Spektrum 1 H NMR
untuk masing-masing standar dan teobromin yang diproduksi secara biologis juga sangat cocok.
Spektrofotometri Bruker 500 MHz dengan DMSO-d6 sebagai pelarut digunakan untuk merekam
spektrum 1 H NMR. Standar theobromine menunjukkan adanya puncak pada δ 11,098 (s, 1H)
sesuai dengan proton -NH, dan puncak pada δ 7,973 dan 3,847 sesuai dengan gugus -C = H (s,
1H) dan –CH3 (s, 3H).
 BAB V

KESIMPULAN

Penelitian ini merupakan pengembangan strain E. coli yang dioptimalkan secara metabolik
untuk produksi theobromine dan memperluas platform untuk menghasilkan beberapa
methylxanthines dari kafein (dan / atau theophylline). Salah satu hal penting dari percobaan ini
adalah keseragaman pertumbuhan, kondisi reaksi dan pemulihan produk dengan fleksibilitas
berbagai bahan baku untuk mendapatkan metilxantin spesifik yang diinginkan. Namun, teknik
metabolik E. coli dengan dosis optimal dari gen yang tepat sangat penting. Hasil molar dari
theobromine dalam penelitian ini (79%) dan dilakukan dengan proses kromatografi sederhana.
Percobaan ini lebih efisien dan ramah lingkungan untuk produksi theobromine dan
methylxanthines mono lainnya.