Pembahasan Kineka Enzim

Pada praktikum analisis kualitatif dan kuantitatif kineka enzim pada sampel terong
ungu yang bertujuan untuk mengisolasi ekstrak enzim pada terong ungu, mengetahui prinsip
kineja enzim, menentukan spesifikasi enzim dalam terong ungu, mengatahui faktor-faktor
yang mempengaruhi aktivitas enzim pada sampel terong ungu, menentukan jenis inhibitor,
dan menentukan Km dan Vmax laju reaksi pada sampel terong ungu. Terong ungu dipilih
karena memiliki enzim oksidareduktase yaitu PPO yang ditandai dengan berubahnya warna
terong saat terkena udara menjadi coklat. Reaksi yang terjadi termasuk kedalam reaksi
browning.
Reaksi ini dapat terjadi bila jaringan tanaman terpotong dan terkupas dikarenakan
kerusakan secara mekanis yang dapat menyebabkan kerusakan integritas jaringan tanaman.
Hal ini menyebabkan enzim dapat kontak dengan substrat yang biasanya merupakan asam
amino tirosin dan komponen fenolik seperti katekin, asam kafeat, dan asam klorogena
sehingga substrat fenolik pada tanaman akan dihidroksilasi menjadi 3,4-dihidroksifenilalanin
(dopa) dan dioksidasi menjadi kuinon oleh enzim phenolase.
Terong ungu dipilih karena mengandung enzim poli phenol oksidase yang mengalami
reaksi browning. Reaksi browning nya dapat terjadi dengan cepat sehingga mudah diamati.
Karena cepatnya reaksi browning yang terjadi, preparasi sampel dilakukan dengan cepat dan
dalam keadaan dingin agar reaksi enzimatis dapat terhambat melalui penurunan suhu. Jika
dilakukan dengan penaikan suhu, dikhawatirkan enzim menjadi rusak dan sulit untuk
mengembalikan sampel ke keadaan semula.
1. Analisis kualitatif
Pengujian pertama spesifikasi enzim dilakukan dengan mencampurkan enzim dengan
berbagai reagen setelah masing masing di inkubasi dalam waterbath bersuhu 37°C. Hal ini
bertujuan agar enzim dan reagen berada pada kondisi yang sama sehingga tidak ada faktor lain
yang berpengaruh pada penentuan substrat ini. Berdasarkan hasil praktikum, enzim pada
sampel terong ungu bekerja secara pesifik terhadap substrat katekol. Hal ini dapat diamati
melalui intensitas warna coklat yang terdapat pada campuran reagen dan sampel. Sehingga
dapat diketahui salah satu prinsip kerja dari enzim adalah bekerja pada substrat yang spesifik
seperti model lock and key seperti persamaan reaksi berikut…..
Setelah itu dilakukan uji terhadap pengaruh konsentrasi enzim dan substrat. Dari hasil
percobaan diperoleh bahwa enzim akan optimum pada konsentrasi enzim dan substrat tanpa
pengenceran. H2O pada proses pengenceran menyebabkan konsentrasi enzim dan substrat
berkurang meskipun perbandingan volumenya sama. Hal ini sesuai dengan prinsip kinetika
enzim yaitu, konsentrasi enzim maupun substrat harus berbanding lurus untuk mencapai titik
optimum.
Kemudian dilakukan uji terhadap pengaruh suhu dan pH. Enzim merupakan
biokatalisator yang tersusun dari protein yang sangat mudah berubah strukturnya (denaturasi)
apabila disimpan dalam lingkungan yang ekstrem seperti suhu terlalu tinggi dan pH yang jauh
dari keadaan optimumnya. Percobaan dilakukan dengan mencampurkan enzim dan substrat
yang sudah diinkubasi kemudian dipanaskan pada berbagai suhu dengan rentang 0-80 C.
Sedangkan untuk pH dibuat berbagai variabel pH dengan rentang pH 1 – 10 .Berdasarkan
hasil percobaan, suhu optimum enzim PPO adalah 35 C dan pada pH 7. Hal ini sesuai dengan
pengamatan akan mudahnya terong hijau yang sudah dikupas berubah menjadi coklat hanya
dengan diletakkan pada udara terbuka tanpa diberi suasana apapun.
Kemudian dilakukan uji pengaruh inhibitor. Inhibitor yang digunakan adalah tripsi, p-
nitrofenol, Pb nitrat, EDTA dan aquades. Berdasarkan hasil praktikum , inhibitor yang paling
mempengaruhi kerja enzim PPO adalah EDTA. Hal ini ditunjukkan dengan warna coklat yang
terbentuk sama dengan warna coklat saat mereaksikan enzim dengan substrat. Inhibitor dapat
digolongkan kedalam tiga jenis yaitu inhibitor reversibel, irreversibel dan alosterik. EDTA
pada enzim PPO digolongkan sebagai inhibitor reversibel karena merubah struktur enzim
dengan mengeluarkan Cu dari dalam enzim sehingga enzim menjadi tidak aktif.
Adapun faktor kesalahan dari praktikum ini adalah kesalahan saat meng ekstrak
sampel terong hijau sehingga meyebabkan reaksi browning sudah terjadi sebelum percobaan
dilakukan.
Analisis kuantitatif Pada praktikum kali ini dilakukan uji untuk mengetahui kinetika
reaksi enzim yang berikatan dengan substrat dengan adanya inhibitor atau tanpa inhibitor.
Dari hasil menentukan Km dan Vmax dapat diketahui jenis inhibitor. Substrat yang digunakan
adalah katekol seperti dalam uji spesifikasi bahwa terong ungu bekerja spesifik pada substrat
katekol. Inhibitor yang digunakan tirosin dan fenol.
Hal pertama yang dilakukan dalam analisis kuantitaif adalah pengukuran kinerja enzim
tanpa adanya inhibitor untuk memperoleh Km dan Vmax dari enzim yang berikatan dengan
substrat. Salah satu kontribusi utama Henri-Michaelis-Menten pada kinetika enzim adalah
memandang reaksi enzim sebagai dua tahapan. Pada tahap pertama, subtrat terikat ke enzim
secara reversible, membentuk kompleks enzim-substrat. Kompleks ini kadang-kadang disebut
sebagai kompleks Michaelis. Enzim kemudian mengatalisasi reaksi kimia dan melepaskan
produk. Kurva yang digunakan adalah kurva Linewaver-Burk, kurva ini dibuat dengan tujuan
agar kurva yang dihasilkan memiliki kemiringan sehingga dapat dengan tepat didapatkan hasil
regresi yang digunakan untuk menghitung nilai Vmaks dan KM. Karena jika kurva Michaelis-
menten digunakan maka sulit untuk menentukan vmax dan km dari kinerja enzim.
Reaksi enzim pada substrat berlangsung melalui pembentukan kompleks enzim-substrat
(ES). Nilai maksimal atau Vmax akan tercapai jika sistem/keadaan ES dijenuhkan oleh substrat.
Postulat reaksi : E+ S ⇌ ES ⇌ E + P
Dengan : E = Enzim
S = Substrat
P = Produk
Selanjutnya pengukuran kinerja enzim dengan dipengaruhi oleh inhibitor. Diperoleh
bahawa nilai Vmax menurun, Km menurun, didefinisikan sebagai [S] yang
diperlukan untuk ½ aktivitas maksimal. Sehingga dari kedua inhibitor yang
dipakai yaitu tirosin dan fenol, diperoleh bahwa kedua inhibitor tersbebut merupakan inhibitor
uncompetitive dalam kinerja enzim terong ungu. Hal tersebut dikarenakan dalam grafik nilai
Vmax yang dihasilkan menurun. Pada inhibitor tak kompetitif, inhibitor tidak
dapat berikatan dengan enzim bebas, namun hanya dapat dengan
komples ES (enzim-substrat). Kompleks EIS yang terbentuk kemudian
menjadi tidak aktif.
Pengukuran absorbansi dilakukan dalam dua kali pembacaan