PEMERIKSAAN

LABORATORIUM DALAM
DIAGNOSIS HEMOFILIA
I Nyoman Wande
Bagian Patologi Klinik
FK Unud/ RSUP Sanglah Denpasar
 Pendahuluan
Hemofilia
• Kelainan herediter berupa gangguan pembekuan
darah, ditandai dengan manifestasi perdarahan,
disebabkan oleh kelainan atau defisiensi faktor
koagulasi.
• Macam-macam hemofilia :
- hemofilia A : def. FVIII
- hemofilia B : def. FIX
- hemofilia C : def. FXI
- acquired hemophilia : karena adanya antibodi
terhadap FVIII (tanpa ada defisiensi FVIII) 2
Pola pewarisan hemofilia (A dan B)

Gambar . Skema transfer gen hemofilia dari ibu karier dan bapak menderita
hemofilia (Mansouritorghabeh, 2015).
Gambar. Skema pewarisan gen hemofilia dari bapak hemofilia dengan ibu karier
(Mansouritorghabeh, 2015).
 Faktor koagulasi VIII (FVIII)
• Merupakan glikoprotein
• Dikode oleh gen 186.000 bp
• Protein faktor VIII dibagi menjadi:
• Rantai berat (A1-A2-B)
• Rantai ringan (A3-C1-C2)
• Bentuk aktif FVIII mengandung glycosylated sites-free
domain B  as. Amino Arg740 untuk Glu1649.
• FVIII: C  membentuk kompleks dengan von
Willebrand (vWF).
• Waktu paruh F VIII:
• Dengan vWF: 12 jam
• Tanpa vWF: 2 jam
 Perbandingan Faktor VIII dengan vWF

Von Willebrand Faktor VIII

Factor
Fungsi Adesi platelet, Pembentukan
stabilitas factor fibrin clot
VIII
Tempat Sel endotel, Hepatosit
sintesis Megakariosit
Kontrol Autosomal X-linked
genetik dominant recessive
Hemofilia Normal Rendah
Von Rendah rendah
Willebrand
Disease
Gambar skematik dua bentuk yang berbeda dari
faktor VIII. (Pisarek et al., 2016)
 186 kb

26 ekson

Terletak di
regio Xq2.8
Gen FVIII

8
Rentang normal F VIII yaitu berkisar 50%-150% dari
nilai normal (bervariasi sesuai umur)

FVIII meningkat pada keadaan (Williamson et al., 2011):

• Status inflamasi sebagai reaktan fase akut
• Penggunaan kontrasepsi oral
• Kehamilan trimester terakhir
FVIII menurun pada keadaan (Williamson et al., 2011):
• Hemofilia A
• Disseminated intravascular coagulation (DIC)
• Acquired factor VIII inhibitor
• Von willebrand disease
• Beberpa wanita karier gen hemofilia (ringan)
 Faktor Koagulasi IX (FIX)
• Protein yg tergantung Vit. K, dlm bentuk zymogen
yg tdk aktif
• Aktivitasnya berlangsung pada membran fosfolipid,
diawali dengan membentuk komplek dg faktor
jaringan (TF/VIIa)
• Rentang normal: 70%-120% dari nilai normal
Peningkatan FIX terjadi pada:
• Kehamilan
• Penggunaan kontrasepsi oral
Penurunan FIX terjadi pada keadaan:
• Hemofilia B
• Penyakit hati
• Penggunaan antagonis vitamin K (warfarin) atau
defisiensi vitamin K
• Amyloidosis
• Syndrome nefrotik
• Alloantibodi pada hemofilia B yang diterapi dengan infus
faktor IX
• Autoantibodi terhadap faktor IX pada individu yang
sebelumnya sehat (sangat jarang)
Kaskade koagulasi
Hemofilia A
• Defisiensi faktor VIII  80% dari kasus hemofilia
• Gangguang X-linked

Inversi (± 50%)

Mutasi titik Kadar FVIII

sangat rendah
insersi

delesi
Hemofilia B
• Defisiensi FIX
• Abnormalitas dari gen FIX pada kromosom X:
• Delesi (besar atau kecil)
• Mutasi titik
• Mutasi missense
 Gambaran klinis penderita hemofilia

Hemarthrosis,
hematoma

Terbentuk
inhibitor Perdarahan CNS,
Klinis
antibody thd hematuria
FVIII atau FIX

Perdarahan post Op.

Perdarahan pd cabut gigi
Bagaimana terjadi perdarahan
pada penderita hemofilia?
Haemarthrosis pada hemofilia
berat
Perdarahan pada otot paha
 Differential diagnosis
• Hemofilia:
• Hemofilia B
• Kelainan koagulasi kongeninal lainnya: defisiensi FXI dan FXII
• Von Willebrand disease
• Aquired inhibitor FVIII
• Kombinasi defisiensi kongenital FVIII dan FV
• Hemofilia B:
• Hemofilia A
• Defisiensi faktor koagulasi tergantung vit. K (didapat/
diturunkan)
• Penyakit hati
• Overdosis warfarin
 Tabel. Klasifikasi klinis hemofilia A dan hemofilia B berdasarkan kadar
faktor koagulasi.
Klasifikasi Hemofilia A Hermofilia B Gambaran klinis
Kadar faktor Kadar faktor
VIII IX
Severe ≤ 1% dari ≤ 1% dari 1. Spontaneous hemorrhage
(berat) normal normal from early infancy
(≤0.01 U/ml) (≤0.01 U/ml) 2. Frequent spontaneous
hemarthroses and other
hemorrhages requiring
clotting factor
replacement.
Moderat 1-5% dari 1-5% dari 1. Hemorrhage secondary to
(sedang) normal normal trauma or surgery
(0.01-0.05 (0.01-0.05 2. Occasional spontaneous
U/ml) U/ml) hemarthroses
Mild 6-30% dari 6-30% dari 1. Hemorrhage secondary to
(ringan) normal normal trauma or surgery
(0.06-0.30 (0.06-0.40 2. Rare spontaneous
U/ml) U/ml) hemorrhage
Dikutip dari: Williams Manual of Hematology, sixth edition. 2003 (Lichtman et al., 2003).
 Diagnosis dan pemeriksaan
laboratorium pada hemofilia
Pemeriksaan laboratorium terhadap kecurigaan
hemofilia dilakukan pada (Kitchen and McCraw, 2000):
• Bayi laki-laki, riwayat keluarga (+), dengan atau tanpa gejala
• Remaja atau dewasa asimtomatik  perdarahan yang
berlebihan pada saat trauma atau tindakan.
• Individu asimtomatik  pemanjangan APTT.

Diagnosis pasti hemofilia:

• Assay kadar FVIII atau IX
• Assay cytogenetic
 Algoritme diagnosis laboratorik hemofilia

Pemeriksaan penyaring
hemostasis

APTT memanjang PPT normal

APTT dari campuran plasma pasien dan plasma normal

Terkoreksi Tidak terkoreksi

Tes substitusi Inhibitor

Asai faktor
 Pemeriksaan yang mendukung diagnosis
hemofilia:

Pemeriksaan penyaring: CT, PT, APTT

Mixing test

Differential APTT

Pemeriksaan faktor VIII atau faktor IX

Pemeriksaan inhibitor FVIII atau FIX

 1. Pemeriksaan penyaring hemostasis:

1. Masa pembekuan (clotting time): melihat

defisiensi FVIII dan FIX
2. Masa prothrombin plasma (prothrombin time/
PT): Jalur ekstrinsik dan jalur bersama (Faktor II,
V, VII, X)  memanjang jika 10% dibawah normal
3. Masa tromboplastin partial teraktivasi (activated
partial thromboplastin time/ APTT): defisiensi
jalur intrinsik, terutama FVIII memanjang jika
FVIII < 25%
 2. Mixing test

• Membedakan defisiensi faktor koagulasi

Tujuan dengan adanya inhibitor.

• Dilakukan dengan mencampur plasma

Metode pasien dengan plasma normal dengan
perbandingan 1:1, kemudian diinkubasi.

• APTT memanjang inhibitor faktor VIII

Interpretasi • Koreksi APTT  defisiensi atau tidak
menyingkirkan inhibitor apabila klinis sesuai
 3. Differential APTT
Tujuan: untuk menentukan jenis defisiensi faktor
sebelum assay faktor
200 µL
200 µL aged
adsorbed
plasma
plasma
200 µL plasma
pasien

Masing-masing
dilakukan
pemeriksaan APTT

Skema pemeriksaan differential APTT

 Tabel Interpretasi pemeriksaan differential APTT
Plasma normal Adsorbed plasma Aged plasma Kelainan
(F I,V,VIII,XI,XII) (F II,VII,IX,X,XI,XII)

Terkoreksi Terkoreksi Tidak terkoreksi < FVIII

Terkoreksi Tidak terkoreksi Terkoreksi < FIX

Terkoreksi Terkoreksi Terkoreksi < FXI,XII

Tidak Tidak terkoreksi Tidak terkoreksi Inhibitor

terkoreksi
 4. Pemeriksaan FVIII atau FIX

• Tujuan pemeriksaan faktor VIII atau faktor IX:

1. Menegakkan diagnosis defisiensi faktor
2. Menilai beratnya gangguan/defisiensi
3. Monitor terapi pengganti
4. Mendeteksi karier
Metode pemeriksaan:
1. one-stage assay
2. two-stage assay
3. chromogenic substrate assay
 Metode Pemeriksaan FVIII

One-stage Chromogenic
Two-stage
substrate

-Fase I
-Berdasarkan reagen (FV, CaCl₂, -Prinsip mirip fase I
kemampuan plasma fosfolipid, serum) + two-stage method.
pasien dalam plasma standar/plasma Setelah terbentuk
mengoreksi penderita (FVIII)  Fxa Fxa, Fxa diukur
perpanjangan APTT - Fase II menggunakan
dari plasma ditambahkan plasma substrat
def.FVIII substrat (FII & kromogenik
fibrinogen)  terbentuk spesifik.
bekuan
Kecepatan terbentuknya
bekuan tergantung
jumlah Fxa, Fxa
tergantung FVIII.

21
 Metode One-Stage Assay

Memerlukan plasma defisien FVIII, reagen APTT,

plasma standar, plasma normal.
Alat yang dipakai koagulometer
Interpretasi hasil menggunakan kurva standar
dengan kertas grafik semilogaritmic atau double
logaritmic.

22
Pemeriksaan FVIII
1. Plasma kontrol dan plasma pasien dibuat
pengenceran 1:10, 1:20, 1:40 dengan lar.dapar
2. Ambil 100 µL plasma yg telah diencerkan + 100
µL plasma defisien FVIII + 100 µL reagen APTT
 inkubasi pada 37⁰C selama 5’
3. Tambahkan 100 µL CaCl₂ yang telah diinkubasi
pada 37⁰C
4. Catat lama waktu terbentuk bekuan
5. Hasil dari plasma pasien maupun kontrol diplot
pada kurva standar.

23
 24
Interpretasi pengukuran kadar FVIII²⁰
 5. Pengukuran kadar inhibitor FVIII atau FIX

 Inhibitor FVIII diperiksa dengan mencampur plasma

pasien dengan plasma normal dengan perbandingan
yang sama + FVIII  inkubasi. Bila plasma sampel
mengandung inhibitor, FVIII akan cepat dinetralkan.
 Satuan: BU inhibitor FVIII yang menginaktifkan
setengah dari jumlah awal kadar FVIII dalam normal
pooled plasma
 Metode yang sering dipakai:
 metode Bethesda
 modifikasi Nijmegen.
• Metode pemeriksan inhibitor FIX sama dengan inhibitor
FVIII
 Bethesda vs Nijmegen Assays
Classical Bethesda Assay Nijmegen-Bethesda Assay

Normal Patient Buffered FVIII

Patient Imidazole
Pooled Plasma Normal Deficient
Plasma Buffer
Plasma Plasma Plasma
pH 7,4
pH 7.4

Test Control Test

50/50 Mix
50/50 Mix Control
Mixture Mixture mixture
Incubate mixture
Incubate
2hr 37o C 2hr 37o C

Factor VIII activity assay

Factor VIII activity assay

Calculate inhibitor activity (BU/ml)

Calculate inhibitor activity (NBU/ml)

Slide concept courtesy of Drs HW Verbruggen and Piet Meijer, ECAT Foundation
26
 100 100
75 2 BU = amount of
Residual Activity (%)
70 inhibitor that
61 inactivates 75%
50 of FVIII in NPP
40
32
1 BU = 28
25
amount of
inhibitor that
inactivates
50% of FVIII
in NPP
10
0 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50

Bethesda Units (BU)

Grafik semilogaritmik untuk menghitung Bethesda Unit

Ringkasan
• Hemofilia: kelainan perdarahan kongenital yang terjadi oleh
karena adanya penurunan atau tidak adanya faktor VIII atau
faktor IX secara fungsional.
• Pemeriksaan laboratorium terhadap kecurigaan hemofilia
pada:
• Bayi laki-laki riwayat hemofilia (+) gejala (-) atau gejala (+)
• Remaja atau dewasa asimtomatik yang mengalami perdarahan
yang berlebihan pada saat trauma
• Individu asimtomatik yang mengalami pemanjangan APTT.
• Diagnosis lab penderita hemofilia:
• pemeriksaan penyaring: (clotting time (CT), PT, APTT)
• Mixing test
• Differential APTT
• Pemeriksaan FVIII, FIX,
• Pemeriksaan inhibitor FVIII dan inhibitor FIX.