PEMERIKSAAN MIKROSKOPIS

DAN CARA PEWARNAAN

IDENTIFIKASI BAKTERIOLOGIS
SPECIMEN
BAKTERI

Preparat
langsung

Botol/med.
transpor

Mikroskopis

Isolasi

MAKROMOLEKUL
Ag

Ab

DNA

MIKROSKOP
JENIS-JENIS MIKROSKOP
1. Mikroskop Cahaya
2. Mikroskop lapangan gelap (Dark field
microscope)
3. Mikroskop fluoresens (Flourescence
microscope)
4. Mikroskop elektron

1. Mikroskop Cahaya

Lensa: okuler, obyektif,

tubus
meja preparat,
diafragma, mengatur sinar
kondensor
sumber Cahaya : listrik atau matahari
kaca cembung : foluskan cahaya.

2. Mikroskop lapangan gelap

(Dark field microscope)
Melihat pergerakan bakteri.
Alternatif mikroskop cahaya :
kondensornya diturunkan srendah
mungkin
diafragma dikecilkan sekecil mungkin.
Dilakukan dlm kamar gelap

3. Mikroskop fluoresens
(Flourescence microscope)
Preparat fluoresens,
Tes imuno-fluoresens.
Sumber Cahaya: sinar ultra-violet.
Dilakukan dlm kamar gelap

4. Mikroskop elektron

Melihat benda lebih kecil dari

bakteri: virus dll
Melihat struktur sel bakteri dll
Pembesaran >> tinggi dari
mikroskop biasa/cahaya.

PEMBUATAN PREPARAT
Diperlukan: prep basah
1. Kaca benda atau
kaca obyek atau kaca
khusus
2. Kaca penutup
3. Sengkelit
4. Suspensi bakteri dlm
NaCl 0.9% atau
specimen cair
5. Vaselin

Diperlukan: preparat
hapus
1. Kaca benda
2. Specimen atau
suspensi bakteri
3. Sengkelit
4. Lampu spiritus atau
Bunsen

PREPARAT BASAH
a. Tetes gantung

1. Kaca penutup diatas meja

2. Satu-dua tetes specimen cair di tengah kaca
3.
4.
5.

penutup
Vaselin pada keempat sudut kaca benda
Letakkan kaca benda dengan cekungannya
menghadap ke bawah.
Lihat di bawah mikroskop lapangan gelap.

PREPARAT BASAH
b. Praparat basah ditutup kaca

penutup
1. Teteskan specimen cair di atas
kaca benda
2. Tutuplah dengan kaca penutup
3. Mikroskop pembesaran 10 kali 10 - 45
kali.
4. Untuk lebih jelas: diafragma ditutup
dan kondensor diturunkan

Cara buat preparat u/

pewarnaan
1. Ambil specimen dgn ujung sengkelit,

sapukan merata pd perm. kaca benda

bersih
2. Keringkan udara terbuka/chy mthr
3. Fiksasi dgn nyala api 3 kali, gunanya; u/
melekatkan pd kaca benda, u/
memudahkan zat warna masuk &
berikatan dgn sitoplasma, mematikan
bakteri pd specimen.

PREPARAT HAPUS

Pembuatan Preparat Hapus

Ambil specimen dengan sengkelit sapukan pd

kaca benda
Keringkan preparat: udara terbuka atau pada
udara
Fiksasi preparat: liwatkan kali pada nyala api.

Manfaat fiksasi preparat:

Merekatkan preparat pada kaca benda,

Memudahkan zat warna masuk dan berikatan dgn
sitoplasma,
Mematikan bakteri pada specimen.

Pewarnaan sederhana
Bahan:karbol fuchin 10% a/ Mt Blue.
Cara:
1. Buat preparat kering & fiksasi
2. Letakkan kaca benda di atas rak
3. Tungi dgn zat warna; kf a/ Mt Blue
4. Biarkan 1 menit
5. Buang & bilas & keringkan dgn kertas saring
6. Lihat di mikroskop 10x100
Hasil: hanya morfologi & cara berklp bakteri &
warna sesuai zat warna yg digunakan

A. PEWARNAAN SERDERHANA
Bahan pewarnaan Cara mengerjakan
yang dibutuhkan: 1. Buat preparat,
Larutan karbol

fuchsin 10% (air

fuchsin)
atau larutan methylen
blue.

2.
3.
4.
5.

keringkan dan fiksasi

Letakkan di atas rak
preparat
Tuangi zat warna 1
menit.
Buang zat warnanya,
bilas & keringkan.
Mikroskop: 10 X 100.

Hasil pewarnaan sederhana

Pewarnaan negatif
Bahan : cairan luka & tinta gambar
Cara:
1.Letakkan 2 sengkelit cairan luka pd salah satu ujung
kaca benda
2. Letakkan tinta cina 1 tetes didekatnya pelan campur
keduanya
3. Kaca benda 45o tarik ke blkg & dorong cepat ke depan
dgn rata
4. Keringkan & fiksasi nyala api 3 kali
5. Mikroskop 10x100
Hasil: morfologi & cara berklp bakteri ruang kosong dgn
latar blkg hitam

B. PEWARNAAN NEGATIF
(Morfologi, besar)

Bahan yang dibutuhkan

Cairan luka
Tinta gambar
Cara mengerjakan
Letakkan cairan luka pada
ujung kaca benda pertama.
Letakkan tinta cina dekat
specimen campur
Letakkan kacabenda kedua
45o di didepan campuran
tarik ke belakang dorong
ke depan
Keringkan & fiksasi
Mikroskop pembesaran 10
100

Hasil Pewarnaan Negatif

Pewarnaan burri-gins
Bahan: bakteri kapsul dlm nacl, tinta cina a/ air
fuchin.
Cara:
1. Buat p. negatif dr bakteri berkapsul.
2. Keringkan & fiksasi
3. Warnai dgn air fuchin
4. Biarkan 1 mnt & bilas air
5. Keringkan kertas saring lihat mikroskop 10x100
Hasil: dilhat kapsul ruang kosong, bakteri warna
merah muda dan latar blkg hitam

C. PEWARNAAN BURRY-GINS
(Kapsul)
Bahan yang diperlukan

1. Suspensi bakteri

dalam NaCl 0,9%.

2. Tinta cina
3. Larutan air

Cara mengerjakan
1. Buat pewarnaan negatif
2. Keringkan dan fiksasi.
3. Letakkan pada rak

4.

fuchsin

5.

pewarnaan, dan tuangi

air fuchsin.
Biarkan satu menit
buang zat warna bilas
& keringkan
Mikroskop pembesaran
10 100.

Hasil Pewarnaan Burry-Gins

Pewarnaan gram
Bahan: kristal violet 0.5%, lugol, alkohol 96%, air fuchin a/
saframin (kontras)
Cara:
1. Preparat tipis rata dr specimen pd kaca benda keringkan &
fiksasi
2. Tuangi kristal violet diamkan 1-2 mnt
3. Cuci air mengalir
4. Tetesi lugol 30 detik
5. Buang lugol & bilas air mengalir
6. Lunturkan alkohol 96% cuci air mengalir
7. Tetesi kontras 2 mnt
8. Buang dan cuci air mengalir
9. Periksa mikropkop
Hasil: gram positif ungu tua dan gram negatif merah muda

D. PEWARNAAN GRAM
Bahan diperlukan
Larutan kristal violet
0,5%.
Larutan lugol
Alkohol 96%
Air fuschsin , atau larutan
safranin

Cara mengerjakan
Buat preparat tipis & rata
dari specimen
Keringkan, fiksasi &
letakkan pd rak

Tuangi larutan kristal

violet: 1-2 menit.
Buang zat warna & cuci.
Tetesi larutan lugol
biarkan 30 detik.
Buang larutan lugol &
bilas
Lunturkan dengan
alkohol 96% & bilas
Tetesi zat warna kontras
2 menit.
Buang zat warna cuci.
& keringkan.
Mikroskop pembesaran
emersi.

Hasil Pewarnaan Gram

Hasil Pewarnaan Gram

Hasil Pewarnaan Gram

Pewarnaan tahan asam

ZN: bahan karbol fuchin, asam alkohol 3% Mt Blue a/ malachite
green 0.5%
Cara:
1. Preparat hapus sputum kering & fiksasi
2. Tuangi karbol fuchin
3. Panasi sp menguap dinginkan & panasi lagi 3 kali dlm 10
mnt
4. Cuci air mengalir
5. Lunturkan asam alkohol 3% (H2SO4 1%u/ lepra)
6. Cuci air mengalir
7. Zat kontras mt blue a/ mal green 1 mnt
8. Cuci air mengalir
9. Kering dgn kertas isap lihat dgn oil emersi
Hasil : BTA batang merah, negatif BTA biru latar blkg biru

E. PEWARNAAN TAHAN ASAM

E.1. Pewarnaan Ziehl-Neelsen
Bahan yang dibutuhkan

Lautan karbol fuchsin

Asam alcohol 3 %
Larutan methylen blue
atau malachite green
0,5%.

Cara mengerajakan
1.
2.

Buat preparat sputum,

keringkan dan fiksasi.
Letakkan pada rak dan
tuangi larutan karbol
fuchsin

3. Panasi menguap, dinginkan

dan panasi. (3 kali:10 menit).
4. Cuci dengan air mengalir.
5. Lunturkan: n asam alcohol
3% atau H2SO4 1% (lepra).
6. Bilas & Beri zat warna
kontras: larutan methylen
blue 0,5%: 1
7. Bilas & keringkan .
8. Mikroskop lensa emersi.

E. PEWARNAAN TAHAN ASAM

E.2. Pewarnaan Tanzil ( Modifikasi Kinjoun)
Bahan yang dibutuhkan
Larutan karbol fuchsin
Kinjoun
Larutan Gabbet (alcohol,
H2SO4 & methyelen
blue).

Cara mengerjakan
1. Buat preparat sputum,
keringkan dan fiksasi.

2. Letakkan pd rak
pewarnaan dan tuangi
larutan Kinyoun: 3-5
Buang zat warna dan
bilas
3. Lunturkan: alkohol asam
4. Bilas dan keringkan .
5. Tuangi larutan Methylen
blue: 3 menit
6. Bilas dan keringkan
7. Mikroskop: pembesaran
emersi

Hasil Pewarnaan Tahan Asam

Pewarnaan tahan asam02

Tanzil (mod. Kinyon): bahan karbol fuchin kinyon, lar.
gabbet(alkohol, H2SO4 & mt Blue)
Cara:
1. Preparat hapus sputum kering & fiksasi
2. Tuangi kinyoun 3-5 mnt
3. Cuci air mengalir
4. Lunturkan asam alkohol 3% (H2SO4 1%u/ lepra)
5. Cuci air mengalir & keringkan kertas isap
6. Zat kontras mt blue 3 mnt
7. Cuci air mengalir
8. Kering dgn kertas isap lihat dgn oil emersi
Hasil : BTA batang merah, negatif BTA biru latar blkg biru
Prinsip : tak ada pemanasan

Perbedaan Tanzil & Z-N

Tanzil (Kinyoun) Ziehl-Neelsen
Cara

Mudah

Sukar

Bahan

Sedikit

Banyak

Waktu

Cepat

Lama

Tidak awet

Awet

Hasil

Pewarnaan spora
Bahan: mal green, saframin 0.5% a/ air
fuchin, bakteri berspora dlm nacl 0.9%
Cara:
1. Preparat hapus tipis rata keringkan
2. Tuangi mal green panasi sp uap 5 mnt
3. Cuci air mengalir
4. Zat kontras saframin a/ air fuchin
5. Cuci air mengalir keringkan
Hasil: spora hijau dan basil vegetatif merah

F. PEWARNAAN SPORA
(Pewarnaan malachite green)
Bahan yang dibutuhkan
Larutan malachite
green
Larutan safranin
0,5% atau air
fuchsin.
Suspensi bakteri
bersopra dlm NaCl
0,9%.

Cara mengerjakan
1. Buat preparat tipis, keringkan
2.
3.
4.
5.
6.

dan fiksasi.
Tuangi larutan malachite
green, dan panasi perlahan
spi menguap: 5 menit
Bilas
Tuangi zat warna kontras.
Bilas dan keringkan
Mikroskop pembesaran
emersi

Hasil Pewarnaan Spora

Pewarnaan Neisser
Gunanya: melihat butir volutin dr corynebacterium
diphtheriae
Bahan:larutan neisser A,B,C
Cara:
1. Preparat hapus dr biakan c. difteri pd medium loffler
keringkan & fiksasi
2. Campr 2 bgn Neisser A & 1 bgn Neisser B ke preparat
15 detik
3. Bilas air mengalir
4. Beri Neisser C (kontras) 30 dtk
5. Bilas & keringkan
Hasil: Granula intraseluler biru gelap & bgn organisme lain
kuning kecoklatan

G. PEWARNAAN NEISSER
(Butir volutin C. diphtheriae)
Bahan yang
dibutuhkan

Larutan Neisser A
Larutan Neisser B
Larutan Neisser C

Cara mengerjakan
1. Buat preparat hapus
2.

biakan C. diphtheriae
Keringkan dan fiksasi.

3. Campurkan 2 bgn
Neisser A + 1 bgn
Neisser B, tuangkan
pd preparat, biarkan 15
detik.
4. Segera bilas
5. Beri larutan Neisser C :
30 detik.
6. Bilas dan keringkan
7. Mikroskop pembesaran
emersi.

Hasil Pewarnaan Neisser