PRAKTIKUM III

PEMBUATAN MEDIA KULTUR JARINGAN TANAMAN

Dasar Teori

Salah satu penentu kesuksesan dalam kegiatan kultur jaringan adalah pilihan
media yang digunakan karena teknik kultur jaringan menekankan adanya
lingkungan yang cocok agar eksplan dapat tumbuh dan berkembang. Dalam
kultur jaringan, bahan tanaman yang digunakan merupakan bagian kecil dari
tanaman yang tidak merupakan suatu sistem yang lengkap sehingga memerlukan
nutrisi dalam media yang mampu mendukung pertumbuhan optimalnya.
Media tanam dalam kultur jaringan adalah tempat untuk tumbuh eksplan
(bahan tanam). Media tanam tersebut dapat berupa larutan (cair) atau padat.
Penggunaan media cair adalah untuk keperluan suspensi sel, yaitu untuk
memperbanyak kalus yang sudah terbentuk, untuk isolasi, dan untuk fusi
protoplas, sedangkan media padat digunakan untuk mendapatkan kalus (induksi
kalus) dan medium diferensiasi yang berguna untuk menumbuhkan akar serta
tunas sehingga kalus dapat tumbuh menjadi planlet (tanaman kecil).
Media dasar yang paling banyak digunakan adalah media Murashige dan
Skoog (MS) karena dapat digunakan untuk mendukung kultur jaringan banyak
jenis tanaman dan berbagai tujuan kultur. Masih terdapat media dasar lain yang
digunakan sesuai tujuan kultur yang lebih spesifik, seperti Woody Plant Medium
(WPM), Nitsch & Nitsch, White, Gamborg (B5), Vacin & Went (VW), N6, dan
Schenk & Hildebrandt (SH). Keistimewaan media MS adalah kandungan nitrat,
ammonium, dan kaliumnya yang tinggi dan jumlah hara anorganik lainnya yang
layak untuk memenuhi kebutuhan banyak jenis sel tanaman dalam kultur jaringan.
Dalam media kultur jaringan mengandung bahan-bahan esensial dan
komponen pengoptimal. Bahan esensial terdiri atas garam-garam anorganik,
sumber karbon dan energi, vitamin dan zat pengatur tumbuh (ZPT) tanaman.
Komponen lain yang berperan untuk optimalisasi pertumbuhan di antaranya
adalah asam amino, senyawa organik kompleks dan senyawa antioksidan.
Beberapa garam anorganik yang diperlukan tanaman dalam jumlah takaran

8
banyak (milimolar) dikenal sebagai unsur makro, yaitu unsur N, K, S (anion), P,
Ca dan Mg (kation). Nutrisi esensial yang kebutuhannya dalam jumlah kecil
(mikromolar) disebut sebagai unsur mikro. Unsur ini terdiri atas unsur Fe, Mn,
Zn, B, Cu dan Mo.
Sumber karbon dan energi yang standar digunakan adalah sukrosa atau
glukosa. Fruktosa juga dapat digunakan tetapi efektivitasnya kurang. Begitu pula
dengan laktosa, maltosa dan galaktosa. Pada umumnya sukrosa digunakan pada
konsentrasi 2 – 3%. Penggunaan sukrosa di atas 3% dapat digunakan untuk
tujuan tertentu dalam kultur dan dapat menyebabkan terjadinya penebalan dinding
sel.
Vitamin juga menjadi salah satu senyawa yang ditambahkan dalam media
dasar. Senyawa organik ini berperan sebagai koenzim yang berperan dalam
berbagai metabolisme penting. Beberapa jenis vitamin yang sering digunakan
dalam media kultur jaringan adalah tiamin (vitamin B1), piridoksin (vitamin B6)
dan asam nikotinat (niasin/vitamin B3).
Pada media dasar biasanya ditambahkan zat pengatur tumbuh (ZPT), yaitu
senyawa organik bukan hara yang dalam jumlah sedikit dapat mendukung
(promote), menghambat (inhibit), dan merubah proses fisiologis tumbuhan. ZPT
dalam tanaman terdiri dari beberapa kelompok, yaitu auksin, sitokinin, giberelin,
etilen, asam absisat, poliamin, brassinosteroid, jasmonat, salisilat dan retardan
dengan ciri khas dan pengaruh berlainan terhadap proses fisiologis.
Asam amino merupakan sumber N-organik bagi tanaman yang lebih mudah
diserap daripada N-anorganik dan berperan penting dalam pertumbuhan dan
diferensiasi kalus, seperti glutamine dan glisin. Sedangkan senyawa organik
kompleks yang sering digunakan dalam kultur jaringan antara lain casein
hydrolisate, ekstrak ragi, ekstrak buah seperti tomat, pisang dan kentang serta air
kelapa.
Dalam kultur jaringan juga terkadang diberikan senyawa antioksidan yang
dapat mengabsorbsi persenyawaan toksik yang terdapat dalam media sehingga
menghambat pertumbuhan tanaman. Persenyawaan tersebut merupakan senyawa
fenolik dari jaringan yang terluka pada saat inisiasi yang mengakibatkan
terjadinya browning. Selain itu juga disebabkan adanya senyawa 5-hydroxymethyl

9
furfural yang terbentuk dari gula yang berada dalam larutan asam lemah dan
mengalami pemanasan dengan tekanan tinggi. Anti oksidan yang sering
digunakan dalam kultur jaringan, seperti polyvinyl pyrolidone (PVP), arang aktif
dan vitamin C.
Bentuk fisik media tanam dapat berupa larutan (cair) dan padat dengan
penambahan bahan pemadat. Bahan pemadat yang sering digunakan dalam kultur
jaringan adalah agar karena memiliki keuntungan, yaitu dapat membeku pada
temperatur ±40 oC, tidak dicerna oleh enzim tanaman dan tidak bereaksi dengan
persenyawaan penyusun media. Agar merupakan campuran polisakarida yang
diperoleh dari beberapa spesies alga. Kekerasan media dipengaruhi oleh jenis
agar yang digunakan, pH media dan penambahan arang aktif di mana pada
konsentrasi 0,8-1%, arang aktif dapat menghambat pembekuan agar. Pada
umumnya, konsentrasi agar yang diberikan antara 0,7-0,8 %. Konsentrasi agar
yang terlalu tinggi dapat mengurangi difusi persenyawaan dari dan ke arah
eksplan sehingga absorbsi hara dan ZPT berkurang sedangkan zat penghambat
tumbuh (inhibitor) tetap berkumpul di sekitar eksplan. Selain agar, gelrite juga
banyak digunakan karena dapat membentuk gel yang lebih bening dan dengan
konsentrasi yang lebih rendah daripada agar (0,2-0,3 %). Gelrite merupakan
polisakarida dari bakteri Pseudomonas sp.
Faktor penting lain yang juga harus diperhatikan adalah pH media yang
harus diatur sedemikian rupa sehingga tidak mengganggu fungsi membran sel dan
pH dari sitoplasma. Derajat keasaman (pH) adalah nilai yang menyatakan kadar
dari ion H+ dan OH- dalam larutan. Pengaturan pH harus mempertimbangkan
faktor kelarutan garam-garam penyusun media, pengambilan (uptake) hara dan
ZPT serta efisiensi pembekuan agar karena agar akan sulit membeku pada pH
yang terlalu rendah.
Sel-sel tanaman yang dikembangkan dengan teknik kultur jaringan
mempunyai toleransi pH yang relatif sempit dengan titik optimal antara pH 5-6 di
mana pH optimal biasanya 5,8. Pengukuran pH dapat dilakukan dengan
menggunakan pH-meter atau kertas lakmus dan pengaturan pH dilakukan dengan
menggunakan KOH atau NaOH apabila media terlalu asam atau HCl jika media
terlalu basa. Pada umumnya terdapat penurunan pH setelah disterilkan dalam

10
autoklaf. Oleh sebab itu, dilakukan penambahan pH antara 0,2-0,3 sebelum
sterilisasi atau pengaturan pH dilakukan setelah sterilisasi.
Selain media dasar, dalam kultur jaringan juga menggunakan media
prekondisi yang umumnya digunakan sebagai media setelah eksplorasi sterilisasi
eksplan. Hal ini dilakukan untuk menguji tingkat sterilitas dari eksplan yang telah
disterilisasi. Apabila prosedur sterilisasi yang dilakukan telah terbukti memiliki
tingkat sterilistas yang tinggi maka eksplan dapat dipindah tanam ke media
perlakuan untuk inisiasi pertumbuhan yang disesuaikan dengan tujuan kultur.
Media prekondisi umumnya menggunakan pupuk daun mengandung beberapa
unsur hara yang dapat mendukung pertumbuhan eksplan di awal pertumbuhan.
Selain pupuk daun, pada media tetap diberikan gula, vitamin dan myo-inositol
sehingga eksplan dapat memberikan respon positif terhadap kondisi kultur.

Tujuan

Praktikum ini bertujuan untuk melatih keterampilan mahasiswa dalam

membuat media tanam dalam kultur jaringan tanaman.

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah aquades, larutan stok
dari hara makro, hara mikro, ZPT, vitamin, myo-inositol, gula dan agar. Alat yang
digunakan adalah neraca analitik, erlenmeyer, labu ukur, pipet, botol kultur, pH-
meter/kertas lakmus, alumunium foil, karet gelang, hot plate & magnetic stirrer
dan otoklaf.

Prosedur Kerja

Tahapan yang dilakukan dalam pembuatan media tanam volume 1000 mL

dalam kultur jaringan adalah sebagai berikut.
1. Pipet larutan stok hara, vitamin, myo-inositol dan ZPT (BAP 2 ppm + NAA 1
ppm).

11
2. Timbang gula sebanyak 30 g dan agar 7-8 g.
3. Masukkan masing-masing bahan (kecuali agar) ke dalam erlenmeyer volume
1000 mL. Aduk dengan magnetic stirrer hingga larut sempurna.
4. Selanjutnya tambahkan ke dalam erlenmeyer tersebut aquades sampai hampir
mencapai 1000 mL.
5. Ukur pH media dengan menambahkan larutan HCl 0,1 N atau KOH 0,1 N
hingga mencapai 5,9-6,0. Kemudian tera larutan media tersebut hingga
volume 1000 mL di dalam labu ukur.
6. Tuang kembali larutan media ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan agar
(untuk media padat). Kemudian panaskan serta aduk pada hot plate &
magnetic stirrer hingga mendidih.
7. Setelah itu, segera tuang media ke dalam botol kultur steril sebanyak ±25 mL
per botol dan tutup dengan alumunium foil lalu ikat menggunakan karet
gelang.
8. Selanjutnya sterilkan media dengan otoklaf pada suhu 121 oC dan tekanan
17,5 psi selama 20 menit.
9. Terakhir, simpan media yang telah steril di ruang kultur pada suhu ±20 oC.
Skema pembuatan media MS dapat dilihat pada Gambar 1.

12
 Stok Makro Nutrien
Stok Fe-NaEDTA

Stok Mikro Nutrien Stok Myo-Inositol

Erlenmeyer
1000 mL
1 Stok Vitamin
Sukrosa

Stok ZPT

Tambahkan aquades sampai

volume mendekati 1000 mL

Ukur pH 5,7–5,8, bila pH kurang tambahkan KOH

1 N bila pH lebih tambahkan HCl 1 N

Tambahkan aquades sampai

volume tepat 1000 mL

Masukkan agar-agar, lalu masak

sambil diaduk sampai mendidih

Tuang larutan ke dalam botol-botol kultur lalu tutup rapat dengan

penutup botol atau dengan alumunium foil

Sterilkan media dengan autoklaf

Simpan media di ruang inkubasi

Tugas

Setiap kelompok ditugaskan mencari jurnal terkait jenis media dasar selain
media MS. Berdasarkan jurnal tersebut, uraikan bagaimana fungsi dan pengaruh
media tersebut terhadap pertumbuhan eksplan.

13