PENUNTUN PRAKTIKUM

MIKROTEKNIK

Oleh :
NUNUNG HARIJATI, SERAFINAH INDRIYANI,
ARIS SOEWONDO

LABORATORIUM FISIOLOGI, KULTUR JARINGAN DAN MIKROTEHNIK TUMBUHAN

JUR.BIOLOGI-FMIPA
UNIBRAW
2020

i
 KATA PENGANTAR

Mengingat bahwa keterampilan membuat preparat merupakan kemampuan yang

seharusnya dimiliki oleh mahasiswa yang belajar di bidang biologi. Untuk itu buku pentunjuk
praktikum disusun untuk membantu mahasiswa membuat preparat mikrotehnik. Walaupun
telah diusahakan penyusunan buku ini semaksimal mungkin berdasarkan pengalaman dan
referensi yang terpercaya, buku petunjuk ini masih banyak kekurangannya. Oleh karena itu
kami team penyusun dengan tangan terbuka menerima kritik dan saran yang membangun dari
rekan sejawat yang tertarik dengan mikrotehnik.
Pada edisi tahun ini ada penambahan topic yaitu pembuatan preparat kayu, selain itu
pembuatan preparat segar tetap dipertahankan.

Malang, 30 September 2020

Team penyusun

ii
 TATA TERTIB PRAKTIKUM

A. Sebelum Praktikum
1. Praktikum mikroteknik dilaksanakan via zoom.
2. Mahasiswa harus standby 10 menit SEBELUM praktikum dimulai (diharuskan mencari
tempat dengan sinyal yang stabil selama praktikum berlangsung).
3. TIKET MASUK BAB I, II, III (Flowchart) diserahkan kepada asisten yang bertugas
(H-1 praktikum) melalui google form yang akan dibagikan oleh asisten yang bertugas.
B. Selama dan Sesudah Praktikum
1. Test (Pre test atau pos test) yang diadakan sebelum atau sesudah praktikum HARUS
mempunyai nilai minimal 65 untuk setiap materi yang diikuti. Mahasiswa yang
nilainya <65 sebanyak 3 kali berturut-turut, tidak diperkenankan mengikuti
praktikum pada minggu berikutnya sebelum nilainya diperbaiki.
2. Test (Pre test atau pos test) diadakan melalui google form yang akan disediakan oleh
asisten yang bertugas.
3. Keterlambatan pengumpulan pre tes atau pos tes akan dikenakan sanksi minus 5 setiap
1 menit dan berlaku kelipatan.
4. Nilai untuk perbaikan test hanya sebesar 80 % dari nilai sebenarnya yang diperoleh.
5. Wajib menyalakan kamera selama praktikum berlangsung, jika ada kendala maka harus
lapor ke asisten yang bertugas.
6. Memakai pakaian yang sopan selama praktikum berlangsung.
7. Email yang digunakan untuk pengumpulan Tiket masuk, Pretest/posttest, Absensi,
Laporan adalah email UB (@student.ub.ac.id) silahkan buka https://gapura.ub.ac.id
untuk log in email UB.

C. Laporan Praktikum
1. Laporan diketik A4, mirror margin 3,2,2,2, Times New Roman 12, spasi 1.
2. Daftar pustaka minimal tahun 2005 dengan ketentuan minimal 10 daftar pustaka
(7 berbahasa Inggris dan 3 berbahasa Indonesia)
3. Laporan praktikum yang sudah dilengkapi dengan hasil dan pembahasan serta
kesimpulan dan daftar pustaka, dikumpulkan H+5 setelah praktikum dalam bentuk
PDF
4. Pengumpulan laporan menggunakan google form yang akan disediakan asisten yang
bertugas. (Link google form akan dibagikan asisten setelah praktikum selesai).
5. Tidak diperkenankan melakukan plagiasi dalam pengerjaan laporan. Apabila
melakukan plagiasi akan dikenakan sanksi berupa potongan nilai 50%.
6. Mahasiswa yang tidak mengumpulkan laporan praktikum sampai tiga kali (kumulatif)
praktikumnya dianggap GUGUR.

D. Tidak Dapat Mengikuti Praktikum

1. Mahasiswa yang dengan terpaksa tidak dapat mengikuti praktikum yang sudah
dijadwalkan HARUS melapor ke koordinator asisten dan juga menyertakan surat
izin, supaya mendapatkan ijin untuk mengikuti susulan
2. Mahasiswa yang tidak mengikuti praktikum sampai TIGA KALI tanpa keterangan
(kumulatif), praktikumnya dianggap GUGUR.
E. Ujian Praktikum
1. Ujian praktikum dilakukan setelah semua acara praktikum selesai
F. Mahasiswa dilarang:
1.Makan, minum, merokok selama praktikum.
2.Mematikan kamera selama praktikum berlangsung

iii
 JADWAL / TOPIK PRAKTIKUM SEMESTER GANJIL 2019/2020
KELAS A(13.00-15.40) dan C (15.45-18.20)
SETIAP HARI JUMAT, DI LABORATORIUM FISIOLOGI, KULTUR JARINGAN DAN MIKROTEHNIK
TUMBUHAN

No Tanggal TOPIK

1 14 Oktober 2020 Penjelasan pelaksanaan praktikum

Material Safety Data Sheet (MSDS) dan Tanda Bahaya
2 21 Oktober 2020
Bahan Kimia

3 28 Oktober 2020 Pembuatan preparat tidak permanen (segar)

4 November
4 Pembuatan preparat whole mount Tumbuhan
2020
11 November
5 Mitosis akar bawang merah dan daun muda
2020
18 November Pembuatan preparat jaringan tumbuhan dengan
6
2020 metode paraffin
25 November Pembuatan preparat jaringan hewan dengan metode
7
2020 paraffin
2 Desember Pembuatan preparat apus & Pembuatan preparat whole
8
2020 mount Paramaecium sp.
9 Desember
9 UJIAN AKHIR PRAKTIKUM
2020

iv
 JADWAL / TOPIK PRAKTIKUM SEMESTER GANJIL 2019/2020
KELAS B (14.50-17.30)
SETIAP HARI JUMAT, DI LABORATORIUM FISIOLOGI, KULTUR JARINGAN DAN MIKROTEHNIK
TUMBUHAN

No Tanggal TOPIK

1 15 Oktober 2020 Penjelasan pelaksanaan praktikum

Material Safety Data Sheet (MSDS) dan Tanda Bahaya
2 22 Oktober 2020
Bahan Kimia

3 29 Oktober 2020 Pembuatan preparat tidak permanen (segar)

5 November
4 Pembuatan preparat whole mount Tumbuhan
2020
12 November
5 Mitosis akar bawang merah dan daun muda
2020
19 November Pembuatan preparat jaringan tumbuhan dengan
6
2020 metode paraffin
26 November Pembuatan preparat jaringan hewan dengan metode
7
2020 paraffin
3 Desember Pembuatan preparat apus & Pembuatan preparat whole
8
2020 mount Paramaecium sp.
10 Desember
9 UJIAN AKHIR PRAKTIKUM
2020

PENILAIAN LAPORAN PRAKTIKUM (Maksimal 85)

PENILAIAN KEAKTIFAN 15 (Selama praktikum berlangsung)

Cover
Latar Belakang (6)
Rumusan Masalah (1)
Tujuan (1)
Manfaat (2)
Dasar Teori (10)
Metode (10)
Hasil dan Pembahasan (45)
Kesimpulan dan Saran (5)
Daftar Pustaka (3)
Lampiran (2)

v
Asisten:
 Siti Zainiyah
 Tria Ayu Lestari
 Iis Fatmawati
 Khoirun Nisa
 Hamka Mahayudin Fikri
 Kiki Riska Novelia
 Wirian Febry Arisda
 Maulida Hikmaranti
 Kavana Hafil Kusuma
 Triyvo Sukrisma
 Rizka Vamelia S N
 Devi Holilah

vi
 Daftar Isi

Kata pengantar ……………………………………………………………………...…. ii

Tata tertib …………………………………………………………………………….. iii
Jadwal Praktikum ……………………………………………………………………... iv
Latihan 1. Material Safety Data Sheet (MSDS) dan Tanda Bahaya Bahan Kimia 1
1.1 Keterangan dasar ……………………………………………………………… 1
1.2 Tujuan praktikum ……………………………………………………………... 2
1.3 Bahan dan alat ………………………………………………………………… 2
1.4 Cara kerja ……………………………………………………………………... 2
Latihan 2. Pembuatan Preparat Tidak Permanen (Segar) 3
2.1 Keterangan Dasar ……………………………………………………………... 3
2.2 Tujuan praktikum ……………………………………………………………... 3
2.3 Bahan dan alat ………………………………………………………………… 3
2.4 Cara kerja ……………………………………………………………………... 3
2.5 Pertanyaan/Tugas ……………………………………………………………... 4
Lampiran ………………………………………………………………………….. 5
Latihan 3. Whole Mount 6
3.1 Keterangan Dasar …………………………………………………………….. 6
3.2 Tujuan praktikum …………………………………………………………….. 6
3.3 Bahan dan alat ……………………………………………………………… 6
3.4 Cara kerja ……………………………………………………………………... 6
3.5 Pertanyaan/Tugas ……………………………………………………………... 7
Latihan 4. Pembuatan Preparat Kromosom dengan metoda ‘Squash’ Pada 8
Tumbuhan
4.1 Keterangan Dasar …………………………………………………………….. 8
4.2Tujuan praktikum ……………………………………………………………… 9
4.3 Bahan dan alat ……………………………………………………………….... 9
4.4 Cara kerja ……………………………………………………………………... 9
4.5 Pertanyaan/Tugas ……………………………………………………………... 10
Lampiran ………………………………………………………………………….. 10
Latihan 5. Pembuatan Preparat Jaringan Tumbuhan Dengan Metode Paraffin 12
5.1 Keterangan Dasar …………………………………………………………….. 12
5.2 Tujuan praktikum …………………………………………………………….. 13
5.3 Bahan dan alat ………………………………………………………………... 13
5.4 Cara kerja …………………………………………………………………….. 13
5.5 Pertanyaan/Tugas …………………………………………………………….. 15
Lampiran …………………………………………………………………………. 16
Latihan 6.Pembuatan Preparat Jaringan Hewan Dengan Metode Paraffin 19
6.1 Keterangan Dasar ……………………………………………………………... 18
6.2 Tujuan praktikum ……………………………………………………………... 19
6.3 Bahan dan alat ……………………………………………………………….... 19
6.4 Cara kerja ……………………………………………………………………... 19
6.5 Pertanyaan/Tugas ……………………………………………………………... 22
Lampiran ………………………………………………………………………….. 23

vii
Latihan 7. Pembuatan Preparat Apus (Smear Preparation) 24
7.1 Keterangan Dasar ……………………………………………………………... 24
7.2 Tujuan praktikum ……………………………………………………………... 24
7.3 Bahan dan alat ……………………………………………………………….... 23
7.4 Cara kerja ……………………………………………………………………... 25
7.5 Pertanyaan/Tugas ……………………………………………………………... 25
Latihan 8. Pembuatan Preparat Whole Hewan 26
8.1 Keterangan Dasar ……………………………………………………………... 26
8.2 Tujuan praktikum ……………………………………………………………... 26
8.3 Bahan dan alat ……………………………………………………………….... 26
8.4 Cara kerja ……………………………………………………………………... 26
8.5 Pertanyaan/Tugas ……………………………………………………………... 27

viii
 Latihan 1

Material Safety Data Sheet (MSDS) dan Tanda Bahaya

Bahan Kimia

1.1 Keterangan Dasar

Lembar data keselamatan bahan (MSDS) yang juga disebut lembar data keselamatan
(SDS) adalah dokumen yang berisi informasi tentang potensi bahaya (kesehatan, kebakaran,
reaktivitas dan lingkungan) bahan kimia dan bagaimana bahan-bahan tersebutdapat berdampak
pada kesehatan dan keselamatan di tempat kerja. MSDS dapat diperoleh dari perusahaan yang
memproduksi bahan atau internet dengan mengetik nama zat atau bahan sebagai kata kunci.
Tujuan penyediaan MSDS adalah untuk memberikan informasi tentang penyimpanan bahan
yang tepat, pertolongan pertama, respon tumpahan, pembuangan yang aman, toksisitas, tingkat
kemudahan terbakar, dan informasi tambahan yang berguna.
Dalam lingkup bahan berbahaya, MSDS juga mengandung simbol yang mewakili jenis
dan tingkat bahaya tertentu. Simbol adalah jalan pintas untuk meningkatkan kesadaran tentang
bahaya suatu zat. Umumnya dua style simbol diterapkan dalam MSDS, National Fire
Protection Association (NFPA) dan Hazardous Materials Identification System. NFPA
mempunyai format berlian dan HMIS mempunyai format persegi panjang . Setiap warna dari
masing-masing format menunjukkan tingkat bahaya yang berbeda.
Biru = Bahaya Kesehatan
Merah= Bahaya Kebakaran
Kuning= Bahaya Reaktivitas
Putih= Bahaya khusus atau alat pelindung personal (personal protective equipment,
PPE)
Tanda bahaya suatu bahan selain dikenali dari MSDS juga dapat dilihat dari symbol yang
diberikan. Simbol yang dimaksud misalkan bentuk api menggambarkan kalau bahan tersebut
mudah terbakar, tengkorak menggambarkan kalau bahan bersifat toksik. Simbol yang berupa
gambar dapat di jumpai pada botol atau kotak pengemas, bahkan mobil yang digunakan untuk
pengakut diberi symbol.

1
1.2 Tujuan praktikum
1. Praktikan dapat membaca MSDS dari bahan dalam katagori memerlukan perhatian
lebih
2. Praktikan dapat membaca symbol-simbol yang ada di botol dan kemasan bahan dalam
katagori tidak ‘aman’

1.3 Bahan dan alat

MSDS dan botol dari asam Klorida, asam perklorat, ammonium hidroksida, ethidium
bromida

1.4 Cara kerja

1. Praktikan men-download bahan yang ditugaskan
2. Praktikan membuat mencatat bahaya dari bahan yang dibagikan, serta perlindungan yang
harus digunakan, serta tindakan yang akan dilakukan jika terjadi kecelakaan.
3. Praktikan mengenali tanda-tanda bahaya pada container bahan
4. Praktikan mempresentasikan MSDS bahan yang ditugaskan.

2
 Latihan 2

Pembuatan Preparat Tidak Permanen (Segar)

2.1 Keterangan Dasar.
Dalam pengamatan struktur tanaman, terkadang diperlukan penyediaan preparat yang
cepat untuk tujuan tertentu, misalnya untuk melihat area kerusakan jaringan. Banyak penelitian
yang memerlukan preparat segar sebagai pembuktian suatu perlakuan misalnya untuk melihat
struktur jaringan somatic embrio hasil modifikasi ZPT pada kultur jaringan.
Keperluan penyediaan preparat segar juga bertujuan untuk menyediakan preparat
peraga yang digunakan sebagai alat bantu pengajaran yang life time nya singkat. Dengan
singkatnya preparasi dapat menghemat waktu dan biaya karena menggunakan bahan kimia
yang tidak kompleks. Dengan pewarnaan sederhana bisa digunakan untuk membedakan
bagian-bagian tanaman. Pewarna yang umum digunakan untuk preparat segar adalah safranin
dan fast green

2.2 Tujuan praktikum.

1. Praktikan dapat membuat irisan segar bagian kelenjar minyak dari tanaman dengan
hasil irisan sempurna
2. Praktikan dapat mendiskripsikan anatomi kelenjar minyak dari beberapa jenis
tanaman

2.3 Bahan dan alat.

Mikrotom geser, kuas, pinset ujung lancip, slide dan obyek glass, tissue, silet baru, cork bore,
gabus ketela pohon atau wortel ukuran besar, tanaman yang mengandung kelenjar minyak
(serai, kemangi, atau kayu manis), Gliserin 50%, safranin 0.1%

2.4 Cara kerja

1. Buat silinder dari umbi wortel menggunakan cork bore
2. Potong bagian tanaman yang mengandung kelenjar minyak dengan ukuran 0.5-1 cm
3. Sisipkan specimen tersebut ke belahan gabus/wortel
4. Siapkan mikrotom geser dengang meng-‘set’ di bibir meja atau tempat lainnya
5. Masukkan silinder wortel +specimen ke holder mikrotom geser .
6. Potong specimen setebal 100 m atau setipis-tipisnya dengan hati-hati

3
 7. Dengan kuas ambil potongan tersebut dan letakkan di gelas arloji atau cawan petri
yang sudah diisi safranin 0.1%
8. Pilih irisan yang paling tipis dengan kuas atau pinset ujung lancip
9. Pindahkan irisan tersebut ke gelas obyek , tetesi akuades atau gliserin 50 %.
10. Tutup dengan gelas penutup dan amati di bawah mikroskop

2.5 Pertanyaan/Tugas

1. Deskripsikan struktur anatomi preparat saudara!

4
Lampiran
PEMBUATAN PREPARAT SEMIPERMANEN
wortel dibentuk silinder menggunakan cork borer

bagian tengah wortel/gabus dibelah menggunakan silet

tanaman dipotong 1 cm dan daun 1x1 cm2

spesimen disisipkan ke dalam wortel yang telah dibelah

spesimen dimasukkan ke dalam mikrotom

spesimen diiris menggunakan mikrotom

hasil irisan diambil menggunakan kuas

irisan diletakkan ke cawan petri berisi air

irisan direndam ke dalam larutn safranin 0,1 % selama 2-3 menit

irisan diletakkan diatas slide glass

safranin yang berlebih diserap dengan tisu

irisan diberi gliserin 50 %

ditutup dengan cover glass

diamati menggunakan mikroskop dengan perbesaran 100 x

5
 Latihan 3
Whole Mount

3.1 Keterangan Dasar.

Whole mount merupakan salah satu metode untuk mempelajari struktur vegetatif maupun
reproductif tanaman tanpa sectioning. Tentu saja organ yang dilihat berukuran kecil dalam
kondisi utuh atau jika ukurannya besar dilakukan perapian (trimming). Sori paku, daun dengan
trikoma, daun dengan stomata atau individu lumut merupakan organ atau jaringan atau target
yang menarik untuk whole mount. Jadi dengan whole mount didapatkan lebih komprehensif
nature dari organ dibandingkan dari sectioning.
Pada Famili Araceae, biasanya dicirikan oleh adanya kristal-kristal calcium oxalate.
Kristal-kristal tersebut mempunyai bentuk yang bermacam, demikian juga warnanya. Biasanya
warna kristal mempunyai rentang antara hitam ke coklat. Mengingat family Araceae umumnya
berdaun lebar maka untuk di buat whole mount harus dirapikan terlebih dahulu dengan cara
memotong-motongnya ke ukuran 1x1 cm2

3.2 Tujuan praktikum.

1. Praktikan dapat membuat preparat whole mount individu utuh
2. Praktikan dapat membuat preparat whole mount organ utuh
3. Praktikan dapat membuat preparat whole mount potongan organ (daun)

3.3 Bahan dan alat

Individu lumut atau individu lainnya yang berukuran kecil, bunga ukuran kecil, daun
kecil, daun Porang, daun beras kutah, daun talas, daun pistia, daun salvinia, 5% NaOH,
50 % dan 30% pemutih komersial, 30% dan 50% ethanol. 50% glycerin. Pinset, kuas,
silet, tusuk gigi, gelas obyek, gelas penutup, tissue, pipet tetes.

3.4 Cara kerja

1. Masukkan spesimen yang sudah bersih ke larutan NaOH 5%, inkubasi pada 37oC selama
24 jam
2. Buang Larutan NaOH, kemudian ganti dengan pemutih komersial 50%-80% (tergantung
dari nature bahan). Rendam di larutan pemutih komersial selama  30 menit. Catatan:
sink harap dialiri tap water selama ± 5 menit untuk menghilangkan residu NaOH
3. Cuci dengan tap water berkali-kali, jika jaringan fragile, mencucinya dengan
menggunakan pipet ketika memindahkan air

6
 4. Lakukan dehidrasi menggunakan alcohol 30 % dan 50% @15 min.
5. Pindahkan obyek/specimen ke gelas obyek menggunakan pinset atau kuas yang
sebelumnya sudah ditetesi gliserin.
6. Atur hati-hati obyek menggunakan tusuk gigi
7. Tetesi obyek dengan gliserin, lalu tutup dengan gelas penutup. Hati-hati ketika menutup,
hindari terbentuknya rongga udara.
8. Amati, ambil foto dan deskripsikan gambar yang anda dapat.
Catatan
Tiap kelompok diharapkan menyiapkan 4 botol flakon;
tiap kelompok hanya mengerjakan satu obyek;
untuk daun lebar dipotong 1x1 cm2

3.5 Pertanyaan/Tugas
1. Apa tujuan menggunakan NaOH?
2. Adakah senyawa alkali lain yang bisa digunakan?
3. Apa tujuan menggunakan larutan pemutih komersial?
4. Mengapa pada akhir tahap clearing tidak digunakan xilol?
5. Andaikan digunakan xilol setelah dilakukan dehidrasi, apakah masih sesuai menggunakan
gliserin untuk mounting?

7
 Latihan 4

Pembuatan Preparat Kromoson dengan Metode Squash

Pada Tumbuhan
4.1 Keterangan dasar
Sel anak hasil pebelahan dapat berupa 2n kromosom atau n kromosom. Dua n kromosom
diperoleh dari pembelahan mitosis, sedangkan satu n kromosom dari pembelahan meiosis.
Pembelahan mitosis terjadi pada bagian tubuh tanaman yang aktiv membelah, misalnya ujung
batang, ujung akar, daun muda, kalus, protoplast dan sebagainya. Sementara itu pembelahan
meiosis umumnya terjadi pada sel germinal misalnya sel-sel yang terdapat di antera yang
membentuk serbuk sari. Pembelahan sel umumnya terjadi pada pagi hari antara pukul 8-9 pagi,
walaupun pada malam hari juga dapat terjadi pembelahan. Pembuatan preparat mitosis maupun
meiosis dapat dikerjakan menggunakan metoda squash. Seperti diketahui Penggunaan metode
yang tepat sangat penting dalam pembuatan preparat kromosom agar diperoleh preparat dengan
pewarnaan kromosom yang jelas dan pemisahan kromosom yang baik(Gambar 1).
Keberhasilan pembuatan preparat kromosom tersebut memudahkan dalam mempelajari
kariotipe dan penghitungan jumlah kromosom. Kemudahan penghitungan jumlah kromosom
sangat dibutuhkan untuk analisis tingkat ploidi tanaman, baik dari akar, kalus, maupun bagian
tumbuhan lainnya (Owen dkk., 1993).

Gambar 1. Tahapan mitosis hasil pengamatan di bawah mikroskop dan ilustrasi

modeling mitosis

8
 Dalam aplikasi metode squash ada tambahan langkah yang melibatkan agen kimia atau
fisika yang diberikan sebelum bahan difiksasi atau pretreatment. Beberapa bahan yang dapat
digunakan untuk pretreatmnet antara lain α-bromonaphthalene, p-dichloro-benzene, dan 2 mM
8-hidroksiquinolin (Owen, dkk., 1993). Selain itu, untuk pretreatmnet dapat dilakukan dengan
pemberian perlakuan es pada suhu 00C selama 24 jam dan 0.05% kolkisin pada suhu 260C
selama 3 jam (Mirzaghaderi, 2010). Lama perendaman dalam larutan pretreatment tergantung
bahan tanaman yang digunakan. Pada praktikum ini akan digunakanan akar bawang
merah/putih dan daun muda tanaman yang ada sekitar kampus

4.2 Tujuan praktikum.

1. Praktikan dapat membuat preparat mitosis akar brambang/bawang dengan metode
squash
2. Praktikan dapat membuat preparat mitosis dari daun muda

4.3 Bahan dan alat.

Akar bawang merah/ putih, daun muda, alkohol 70%, asam asetat glasila 45%, HCl 1N, Aceto
orcein 2%, aquades, dan entelan/ kutek bening.Pinset, tissue, cawan petri, hot plate, silet, gelas
objek, gelas penutup, dan mikroskop

6.4 Cara kerja .

1. Semaikan bawang merah/putih di air, setelah muncul akarnya kira-kira 0.5-2 cm, cabut
akar tersebut.Potong akar dari ujung sekitar 0.3 cm (antara pk 8-9 AM) atau ujung akar
yang tampak keruh
2. Rendam akar/ daun muda dalam alkohol 70% hingga waktu praktikum*
3. Pindahkan akar ke asam asetat glasila 45%
4. Hidolisis akardaun dengan larutan HCl 1N pada suhu 650C selama 1-2 menit.
5. Ambil akar dan daun mudamenggunakan pinset dan letakkan ke dalam cawan petri/
petridish yang telah berisi Aceto orcein 2% selama 20-25 menit.
6. Akar dan daun yang sudah terwarnai di atas gelas objek. Potong ujung akar/bagian daun
yang kuat menyerap kemudian ditutup dengan gelas penutup serta di-squash atau ketok
perlaha-lahan dengan pangkal pensil
7. Preparat akar bawang putih/merah atau daun mudadiamati menggunakan mikroskop
cahaya (binokuler) Olympus CX 21pada perbesaran 400x.
8. Foto fase interfase, profase, metafase, anafase dan telofase.
*) sejak pemotongan jam9 AM sudah direndam dalam 45% AAG

9
5.5 Pertanyaan/tugas .
1. Apa saja fiksatif yang biasa digunakan untuk menfiksasi akar bawang
2. Mengapa perlu pelunakan dinding sel?
3. Apakah hanya HCL 1N yang bisa digunakan untuk melunakkan dinding sel?
4. Sebutkan setidaknya 3 pewarna yang digunakan untuk mewarnai kromosom!
5. Apa keuntungan melakukan pretreatment!

=======================================================
Lampiran pembuatan larutan

Komposisi dan pembuatan bahan pengamatan kromosom

1. Larutan fikastif
Untuk pembuatan 1 ml larutan fiksatif, campurkan 0.75 ml etanol absolut dengan 0.25 ml
asam asetat glasial (AAG). Fiksatif harus baru dalam setiap pemakaian.

2. Larutan 2 mM 8-hydroxyquinolin
Untuk pembuatan 100 ml 8-hydroxyquinolin 2mM, timbang hidroksiquinolin sebanyak
0.029 gram. Kemudian tambahkan dengan 0.2 ml etanol absolut dan 97 ml aquades.

3. Larutan HCl 1 N
Untuk pembuatan 10 ml HCl 1N, larutkan 1 ml HCl pekat ke dalam 9 ml aquades.

4. Larutan Carnoy
Untuk pembuatan 100 ml larutan Carnoy, campurkan 60 ml etanol absolut, 10 ml asam
asetat glasial (AAG), dan 30 ml Chloroform.

5. Pewarna Aceto Orcein

Untuk pembuatan 100 ml pewarna Aceto orcein, masukkan 45 ml asam asetat glasial (AAG)
ke dalam erlenmeyer 100 ml dan panaskan di atas hot plate hingga mendidih. Tambahkan 1
gram Aceto orcein ke dalam erlenmeyer yang berisi AAG mendidih sedikit demi sedikit
secara hati-hati agar mudah larut dan tidak mengendap. Setelah Aceto orcein larut, turunkan
erlenmeyer berisi larutan pewarna dari hot plate dan biarkan pada suhu ruang hingga dingin.
Setelah larutan pewarna berada pada suhu ruang, tambahkan larutan pewarna dengan 55 ml
aquades. Saring larutan pewarna tersebut dengan kertas filter. Penyaringan bisa dilakukan
beberapa kali hingga menghasilkan pewarnaan yang baik pada preparat kromosom. Simpan
larutan pewarna yang sudah difiltrasi ke dalam botol gelap pada suhu ruang.

10
Lampiran Flow chart
Potong ujung akar 0.5-1 cm jam 8-9 pagi

Rendam asam asetat 45% , 3 menit

Pindah ke alkohol 70% minimal 30 menit

Pindah ke HCl 1N suhu 60oC selama 1 menit

Pindan & rendam aceto orcein, 20-25 menit suhu ruang

Pindahkan ke obyek glass, Potong akar, sisakan ujung akar

yang paling gelap (bayak menyerap warna)

Tutup denga cover glass, pencet (squash) hingga menyebar

Amati menggunakan mikoskop

‘seal’ dengan cutex tranparan

11
 Latihan 5

Pembuatan Preparat Jaringan Tumbuhan Dengan

Metode Paraffin
5.1 Keterangan Dasar

Metode paraffin merupakan salah satu cara dalam pembuatan sediaan dengan menggunakan
paraffin sebagai media embedding (penanaman). Embedding ini memudahkan dalam membuat
irisan yang sangat tipis (10 µm) dengan menggunakan mikrotom. Kebaikan lain adalah
memudahkan pembuatan sediaan seri dan prosesnya relatif lebih cepat dibandingkan metode
lain untuk mempelajari jaringan. Preparat yang dihasilkan bersifat permanen artinya tidak
mudah rusak dan bisa tahan lama. Umur preparat, jika pembuatan bagus, bisa mencapai 20
tahun. Syarat mutlak yang harus dipenuhi adalah prerat tidak boleh mengandung air untuk
menghindari serangan mikroba
Mengingat bahwa dalam paraffin yang terinfiltrasi ke jaringan dimaksudkan untuk
menahan tekanan pisau mikrotom selama pengirisan, maka diharapkan parafin dapatmenisi
setiap bagian sela dan jaringan tanaman. Oleh karena itu adanya penghalang yang memblok
infiltrasi, misalkan gas O2, CO2 atau gas lainnya, harus dihilangkan. Kegagalan pengirisan
seringkali terjadi karena tidak menyatunya parafin yang ada dijaringan dengan parafin yang
melingkupi jaringan.
Untuk pembuatan sediaan dengan metode paraffin, secara umum tahapan yang harus
dilakukan adalah sebagai berikut:
1. Fiksasi
2. Pencucian
3. Dehidrasi
4. Penjernihan
5. Infiltrasi
6. Penyelubungan (embedding)
7. Pengirisan (sectioning)
8. Penempelan (affixing)
9. Pewarnaan (staining)
10. Penutupan (mounting)

12
5.2 Tujuan Praktikum

1. Praktikan dapat membuat preparat dengan baik dan benar

2. Praktikan dapat mengetahui prinsip dasar pengirisan spesimen

5.3 Bahan dan alat:

Spesimen, Fiksatif, alcohol, xylen, TBA, paraffin yang sudah dicairkan di 58oC, campuran
TBA dan paraffin cair 1:1, karton, lampu spiritus, pinset, silet, slide glass, cover slip, beaker
glass. Pipet pastur, kuas, pinset, pewarna Mayer Hemalum
Bahan yang disiapkan : Alkohol : 70% - 85% - 95% - absolute
Alkohol : 20% - 40% - 60% - 80% - 95% - Absolut
Alkohol : xilol = 3 : 1 – 1 : 1 – 1 : 3
TBA (dalam alcohol 100%): 30% - 60% - 90% - 100%
TBA : Paraffin = 1 : 1
Metode :
Parafffin, Pewarnaan Tunggal

5.4 Cara kerja

1. Fiksasi
Potong obyek yang diinginkan (akan dibantu asisten) lalu fiksasi dalam fikasatif*) dan letakkan
di eksikator yang sudah dipasang selang vacuum. Hilangkan udara yang ada dijaringan hingga
jaringan tanpa mengandung gas dengan ditandai turunnya jaringan ke dasar vial. Sebagai
penanda gunakan jaringan yang banyak mengandung udara, daun misalnya.
2. Pencucian dan dehidrasi
Larutan fiksatif dibuang, kemudian ganti dengan alcohol berturut-turut 70-80-95-100%
masing-masing selama 20 menit, cuci dengan alcohol 100% lalu ganti dengan alcohol 100
yang baru dan biarkan di tempat dingin (4-5oC) overnight.
3. Penjernihan
Alkohol dibuang keesokan harinya, diganti dengan TBA 30 % - 60 % - 90 % (dalam alcohol
100%) masing-masing selama 20 menit, cuci dengan TBA100% lalu ganti dengan TBA 100%
yang lain untuk 20 minut.
4. Infiltrasi
Larutan TBA 100% diganti dengan campuran TBA:paraffin cair (1:1) simpan di oven 58oC
overnight keesokan harinya ganti dengan paraffin murni yang sudah dicairkan, simpan di 58oC,
ulang penggantian 3x lagi dengan paraffin cair masing-masing selama 12 jam. Infiltrasi

13
semuanya dilakukan di 58oC dalam oven/incubator (akan ditunjukkan oleh asisten cara
menggatinya).
Catatan. Agar paraffin dan TBA dapat campur, maka paraffin harus dicairkan sebelumnya.
Biasa 24 sebelum pencampran paraffin sudah dipanaskan dalam OVEN

5. Penyelubungan
Siapkan kotak karton ukuran ± 2 x 2 x 1.5 cm3 (akan ditunjukkan cara membuatnya) atau
container plastik. Dengan menggunakan pipet Pastur yang sudah dipotong bagian yang
menyempit, pipet obyek dengan cepat dan segera letakkan di kotak karton, tambahkan paraffin
cair hingga kotak penuh. Kemudian biarkan blok di temperature kamar hingga mengeras.
Untuk pemakaian pipet selanjutnya, lewatkan di api terlebih dahulu untuk mecairkan paraffin
yang menempel di dinding pipet.
6. Pengirisan
Rapikan blok (trimming) dan bentuk blok tersebut persegi panjang dengan sisi-sisi yang
saling sejajar. Set mikrotom dengan ketebalan 10 µm (untuk akar dan batang) atau 15 µm
(untuk daun). Ambil potongan seri dengan kuas/pinset, letakkan pada slide gas yang sudah
diberi beberapa tetes air. ATAU masukkan paraffin ribbon ke nampan atau baskom berisi air
untuk mengecek apakah obyek sudah teriris atau belum. Jika sudah nambak teriris ambil obyek
dengan cara berikut :

Jika memilih melettak ribbon langsung ke slide, sedot air setelah slide diletakkan
dipermukaan air agar ribbon melekat ke permukaan slide.
Catatan: slide glass sebelumnya lapisi dahulu dengan Mayer albumin. Keringkan slide yang
yang sudah berlapis sangat tipis Mayer albumin dalam oven suhu 35oC. Diletakkan dalam
oven bertujuan menghindari debu dan untuk mendaptkan jaminan suhu yang diinginkan
tercapai.
Panaskan slide + spesimen di dalam oven yang bersuhu suam-suam kuku (35oC) sampai
spesimen melekat erat. Untuk dapat merelat erat setidaknya diperlukan waktu 24 jam.
7. Pewarnaan.
a. Setelah pita-pita paraffin melekat erat, lakukan dewaxing (pelarutan paraffin), yaitu
dengan meletakkan slide ke container slide dan memasukkannya ke container yang
berisi xilol selama 30 menit. Ulang lagi jika paraffin belum hilang dengan

14
 menggunakan xilol yang lain (jangan yang sudah dipakai sebelumnya) juga selama
30 memit
b. Pindah ke container lain yang berisi xilol: alcohol (1:1) selama 5 menit
c. Pindahkan ke alcohol murni selama 2 menit
d. Pindahkan ke alcohol seri konsentrasi turun : 95-80-60-40-20% masing-masing
selama 2 menit diikuti dengan air I dan air II masing-masing 2 menit.
e. Pindahkan ke larutan Mayer Hemalum selama 1 jam -overnight
f. Cuci kelebihan safranin dengan air mengalir, bersihkan Mayer akbumin yang
mengikat warna dengan tissue (akan ditunjukkan oleh asisten)
g. Pindahkan ke air I dan II masing-masing 2 menit
h. Transfer ke alcohol 50 dan 70 % yang sudah diasamkan (100 ml ditambah HCl 1
tetes) masing-masing 10 detik-1 menit, kemudian lanjutkan kealkohol 90 % juga
selama 10 detik-1 menit.
i. Pindahkan slide ke alcohol 90 % (2 menit) dan alcohol murni (2 menit)
j. Pindahkan slide ke campuran xilol:etanol (1:1) selama 2 menit
k. Pindahkan ke xilol I dan xilol II masing-masing 2 menit
l. Tetesi dengan Enthelan dan tutup dengan coverslip.

KETENTUAN UMUM
1.Satu kelompok hanya mengiris satu organ
2. hanya satu kelompok yang memnggunakan gelatin 0.01% yang dicampur di ‘kolam’ paraffin
ribbon’

5.5 Pertanyaan
1. Mengapa harus digunakan pinset ujung runcing untuk mengambil parrafin ribbon dari pisau
mikrotom
2. Mengapa harus mensyaratkan sangat tipis ketika melapisi slide glass dengan Mayer
Albumin?
3. Mengapa harus dibiarkan over night dalam alchol absolut pada tahan akhir dehidrasi?
4. Apakah hanya Mayer albumin yang bisa digunakan sebagai perekat ribbon ke slide glass?
Jelaskan!
5. Apakah syarat suatu larutan sebagai mounting agent?

15
6. Mengapa suhu yang digunakan untuk merekatkan ribbon ke slide glass harus suam-suam
kuku (bukan suhu tinggi)?
==============================================================
Lampiran
LARUTAN FIKSATIF YANG DIGUNAKAN:
Glutaral dehide-formaldehid
1% glutaraldehid
3% paraformaldehid
50mM Buffer fosfat (fosfat dari garam Na, pH 7.5)
50mM NaCl

Cara membuat :
Untuk membuat 40 ml fiksatif
Siapkan air hangat (65oC) sebanyak 14 ml, tambah 0.8 g paraformaldehid, kocok kuat-kuat.
Tambahkkan 3 tetes NaOH 1N. Kocok kuat-kuat hingga paraformaldehid larut.Dinginkan pada
temperatur ruang.Tambahkan buffer fosfat 5 ml (dari stock 0.2M) dan 200µl NaCl (dari stock
5M), tambahkan glutaraldehid. Kocok hingga homogen
Cacodylate
20 mM cacodylate (BM 214.02)
4% formaldehyde
50mM Tris-HCl (pH7.5)

Cara membuat
Untuk membuat 10 ml larutan fisatif:
Siapkan 8.5ml air, tambahkan 0.04 g caccodylate, 1 ml formaldehid (37%), tambahkan 500 µl
Tris-HCl (dari stock 1M).

16
Lampiran Flowchart

Flowchar pembuatan preparat permanen tumbuhan

Potong sampel sekecik mungkin mis. Daun 3x4

Tuang fiksatif, masukkan dalam desikator dan Untuk remove gas yang terjerap
divakum hingga daun tenggelam didasar vial jaringan

Buang fiksatif dan ganti berturut dg EtOH 70- Dehidrasi

80-95-100%a 20 menit, cuci dh ETOH 100%,
simpan dalam EtOH 100% overnight 4oC

Buang EtOH, ganti dg TBA 30 % - 60 % - 90 % Clearing

(dlm EtOH 100%) a 20 menit.
Cuci dg TBA 100%, ganti TBA 100% 20 min

Ganti dg TBA : paraffin = 1:1 o/n Infiltrasi

Ganti paraffin 3x a 12jam (9-12 jam)

Paraffin cair- jaringan-paraffin cair embedding

Iris blok dengan ketebalan 7-15 mikron Sectioning

Rekatkan pita ke slide glas yg sebelumnya sdh Affixing*)hanya untuk 1

di-coating dengan Mayer Albumin kelompok

Xilol I, Xilol II a 30 min Deparaffinise dan staining

Xilol : EtOH 100% (1:1) 5min

EtOH 100% 2 min

EtOH 95-80-60-40-20% 2 min

Air I, air II a2 min

Mayer Hemalum 1 jam

Cuci di air mengalir

Air I, air II a2 min

EtOH 50-70-90% a 1 min

EtOH 90%, EtOH 100% a 2 min

EtOH : Xilol (1:1) 2 min

17
 Xilol I, Xilol II a 10 menit

Tetesi ethelan

Tutup dengan cover slip

*) potongan pita praffin dimasukkan kolam hangat suhu 45-48oC yang mengandung
0.03 % gelatin

18
 Latihan 6

Pembuatan Preparat Jaringan Hewan Dengan Metode

Paraffin
6.1 Keterangan Dasar
Cara kerja pembuatan preparat dengan metode paraffin melalui urutan sebagai berikut
1. Narkose 8. Embedding
2. Sectio 9. Sectioning
3. Labelling 10. Affixing
4. Fiksasi 11. Staining
5. Dehydrasi 12. Mounting
6. Clearing/dealkoholisasi 13. Labelling
7. Impregnasi/Infiltrasi 14. Pemeriksaan mikroskopis
6.2 Tujuan praktikum
1. Praktikan dapat membuat preparat hewan dengan menggunakan metode paraffin
2. Praktikan dapat mengetahui prinsip dasar pembuatan pereparat permanen hewan

6.3 Bahan dan alat:

Spesimen, Fiksatif (Bouin formol atau Paraformaldehide 4%), alcohol, xylen/xylol, paraffin,
pewarna Hematoxylin – Eosin (HE), Mayer albumin, Enthelan, Coplin Jar, karton, lampu
spiritus, pinset, silet, slide glass, cover slip, beaker glass. Pipet pastur, kuas, pinset, pinset
Seri alcohol I : 30 %, 40 %, 50 %, 60 % dan 70 %
Seri alcohol II : 80 %, 90 %, 96 % dan alkohol absolute
Pembagian specimen : Akan ditentukan oleh asisten
Keterangan:
Semua organ diambil dari seekor mencit.

6.4 Cara kerja

1. Narkose
Dalam pembuatan preparat dengan metode paraffin biasanya hewan yang digunakan adalah
Vertebrata. Untuk itu sebelum digunakan untuk pembuatan preparat dengan metode paraffin
dari organ hewan tersebut, maka hewan yang bersangkutan harus dimatikan dahulu. Bahan
kimia yang biasa digunakan untuk mematikan hewan dan aman adalah Chloroform. Walaupun
ada penelitian-penelitian tertentu yang sebaiknya tidak menggunakan bahan kimia tersebut
untuh mematikan hewannya. Misalnya : penelitian endokrinologik, sebaiknya tidak
menggunakan chloroform untuk mematikan hewan yang digunakan untuk penelitian, karena
ditakutkan mempengaruhi hasil penelitiannya.
2. Sectio
Jika menggunakan Mammalia sebagai bahan untuk dibuat preparat, maka diharapkan
jangan sampai bulu dan kotoran-kotoran menempel pada alat/organ yang akan dibuat preparat.
Irisan organ kira-kira 3 – 5 mm dan luas ± 1 cm2, sehingga penetrasi fiksatif terjamin sampai
menyeluruh bagian organ.
3. Labelling
Flakon tempat organ yang akan di fiksasi diberi label sesuai dengan jenis organnya.

19
4. Fiksasi
Organ-organ yang telah dilabel harus segera dimasukkan ke dalam larutan fiksatif, karena
autolysis post mortale akan memberi hasil preparat yang tidak baik/jelek. Biasanya digunakan
larutan Bouin formol sebagai fiksatif atau 4% paraformaldehyde. Cairan ini mengandung asam
pikrat yang sangat berbahaya, untuk itu hendaklah hati-hati di dalam menggunakannya.
Lama perendaman di dalam fiksatif tergantung tebal tipis dan macam jaringan organnya
serta fiksatifnya. Untuk itu lama perendaman di dalam fiksatif bias 1 – 24 jam.
5. Dehidrasi
Tujuan dehidrasi adalah untuk mengganti molekul air dengan molekul alkohol, sehingga
sesuai untuk prosedur-prosedur berikutnya. Pelaksanaannya ialah dengan membiarkan preparat
itu untuk dimasukkan ke dalam larutan alcohol dengan prosentase yang berturut-turut semakin
tinggi. Jika menggunakan fiksatif Bouin formol, maka dehydrasinya dapat langsung dari
alkohol dengan konsentrasi 70 % sesuai dengan pelarut Bouin formol. Kemudian berturut-turut
ke dalam alkohol 80 %, 90 %, 96 % dan alkohol absolute. Pada masing-masing konsentrasi
alkohol sebaiknya diulang 3 kali dan hasilnya akan lebih baik apabila pada setiap konsentrasi
alkohol juga dilakukan pengocokan. Pada larutan alkohol 70 % organ dapat disimpan lebih
lama karena tidak aakan takut membusuk dan rusak.
6. Clearing (Dealkoholisasi)
Untuk memungkinkan paraffin dapat masuk ke dalam sel, haruslah alcohol di dalam organ
diganti dengan zat yang mudaah mengusir alcohol, tetapi kemudian harus bisa diusir oleh
paraffin.Yang dapat digunakan sebagai clearing agent ialah : Aceton; Benzol, Toluol dan
Xylol. Apabila organ telah terlihat transparan, maka clearing bias dihentikan, atau clearing
paling lama dilakukan selama 24 jam. Hasil dari clearing sangat tergantung dari proses
sebelumnya yaitu dehydrasi.
7. Impregnasi /Infiltrasio
Sebaiknya perlakuan ini dilakukan di dalam oven/incubator dengan temperatur ± 550 C atau
600 C. Di dalam proses ini sebaiknya digunakan jenis paraffin dengan titik lebur yang rendah,
misalnya : 480 – 500 C atau 500 – 520 C. Fungsi dari infiltrasi ini adalah untuk mengisi rongga-
rongga jaringan/organ dengan paraffin, agar nanti kalau dipotong/diiris tidak rusak. Sebelum
masuk ke paraffin murni, lebih baik dimasukkan ke dalam campuran Xylol : paraffin = 1 : 1
terlebih dahulu. Untuk setiap larutan memerlukan waktu masing-masing 15 menit atau
tergantung juga pada tebalnya jaringan/organ.Di dalam proses ini digunakan
paraffin : xylol (1 : 1), paraffin I dan paraffin II. (paraffin dengan titik lebur rendah 480 – 500
C atau 500 – 520 C).
8. Embedding
Disini organ/jaringan hasil infiltrasi dimasukkan ke dalam massa paraffin dengan titik didih
560 – 580 C dalam bentuk blok yang dituang di dalam kotak kertas atau gabungan dari dua
lempeng logam. Posisi organ sesuai dengan tujuan pemotongan organ tersebut akan dipotong
secara membujur atau melintang. Usahakan selama embedding berlangsung tidak ada
gelembung udara yang menempel pada organ yang akan diiris. Cara menghilangkan
gelembung udara adalah dengan memasukkan spatel yang telah dipanaskan dengan lampu
Bunsen. Setiap blok preparat harus diberi label.
9. Sectioning
Irislah blok paraffin dengan scalpel, sehingga permukaan blok paraffin yang akan diiris
dengan mikrotom berbentuk segi empat. Irislah sedemikian rupa, sehingga preparat akan
terletak tepat berada di tengah blok.Lengketkan blok tersebut pada holder kayu atau logam
sehingga melekat erat. Pasanglah holder dengan blok preparat tadi pada rotary microtome.
Persiapkanlah.:
- Pasanglah pisau mikrotom pada tempatnya dengan kemiringan 45o dan eratkan
pemasangannya agar jangan sampai goyang atau berubah posisinya.

20
 - Aturlah ketebalan irisan preparat yang dikehendaki, dengan mengatur ukuran
ketebalan irisan yang ada pada mikrotom. Biasanya untuk jaringan hewan ketebalan
irisan antara 5 – 8 µm.
- Usahakan hasil pemotongan dapat membentuk pita, agar apabila dibutuhkan untuk
membuat preparat seri anda dapat mendapatkan seluruh bagian preparat secara
lengkap.
- Siapkan bak berisi air yang dipanaskan pada hot-plate pada temperature 37 0 C
untuk meletakkan slide preparat yang sudah terpotong, dengan harapan slide
preparat hasil pengirisan sudah dapat merentang di dalam bak air ini.
-
10. Affixing
Adalah penempelan hasil pengirisan preparat (coupes) pada kaca benda (object glass).
Pastikan bahwa object glass yang anda pakai telah bebas lemak dengan membersihkannya
memakai alcohol.
Affixing dilakukan dengan cara :
- Object glass digosok dengan cairan Meyer’s albumin dan diratakan dengan jari.
Usahakan diratakannya sampai tipis, agar cairan Meyer’s albumin tidak terlihat
membekas pada saat preparat diwarnai. Lalu ditetesi dengan aquadest.
- Letakkan beberapa coupes di atas aquadest dan kemudian ditempatkan di atas hot-plate
pada temperature 370 C – 450 C dan biarkan sampai preparat kering.
-
11. Staining.
Pewarnaan dilakukan setelah preparat dideparaffinasi dengan merendam preparat pada
Xylol selama 10 – 15 menit. Paraffin tidak boleh ada sedikitpun tersisa pada coupes, karena
hal ini akan mempengaruhi hasil pewarnaan.
Pewarnaan bisa tunggal dan bisa juga progressive (double atau triple). Sebelum coupes
diwarnai, maka harus diketahui sifat-sifat dari zat warna yang akan digunakan (Aquosa atau
alkoholik).
Contoh : Apabila akan diwarnai dengan Hematoxylin – Eosin (HE), maka dari Xylol
coupes harus dibawa ke media aquadest terlebih dahulu dengan mencelupkan coupes menurun
dari Xylol sampai ke aquadest melalui alkohol absolute, alk. 96 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %,
40 %, 30 % dan aquadest karena zat warna hematoxylin bersifat aquaosa. Perlu diperhatikan
bahwa setelah dari Xylol jangan langsung dimasukkan ke alkohol absolute, tetapi harus
di hisap dahulu dengan kertas hisap/tissue agar preparat tidak berkabut. Kejadian ini
akan berpengaruh terhadap pewarnaan.
- Masukkan coupes ke dalam larutan Hematoxylin selama 3-7 detik.
- Cucilah dengan air mengalir selama 10 menit (semakin lama disini warna hematoxylin
akan semakin gelap).
- Celup ke aquadest, alk. 30 %, 40 %, 50 %, 60 % dan 70 % (karena zat warna Eosin Y
palarutnya alk. 70 %), masing-masing beberapa detik saja.
- Masukkan coupes ke dalam Eosin Y selama 1 – 2 menit.
- Celupkan ke alk. 70 %, 80 %, 90 %, 96 %, alk. Absolute dan dihisap dahulu dengan
kertas hisap/tissue sebelum dimasukkan ke Xylol.
- Masukan ke dalam Xylol ± 10 menit.
-
12. Mounting
Adalah memberi perekat transparent dengan indek bias sama dengan indek bias kaca benda
dan kaca penutup. Perekat itu disebut “montant”.
- Coupes/slide siap ditutup dengan Canada balsam atau Enthelan dan ditutup dengan
gelas penutup (deck glass).

21
 - Aletakkan coupes/slide preparat di atas hot-plate agar cepat kering.
- Usahakan pada saat penutupan dengan deck glass agar tidak ada gelembung udara.

Selain dengan pewarnaan HE (hematoxylin-eosin) juga bisa dilakukan dengan pewarnaan

yang lain, misalnya : Mayer’s Hemalum-Eosin, Mallory Triple Stain (Mallory Acid Fuchsin),
Mallory-Azan dsb. Perlu diingat bahwa prosedur pewarnaan harus disesuaikan dengan
sifat zat warna yang akan dipakai.
13. Labelling
Adalah pemberian label dari preparat yang kita buat. Sebaiknya data lengkap preparat yang
dibuat itu tertera pada label yang dibuat, misalnya : Nama alat/jaringan, tebal irisan, arah
potongan, pewarnaan, tanggal dibuat dan nama pemilik/pembuatnya.

6.5 Pertanyaan/tugas
1. Jelaskan kesulitan-kesulitan yang adan hadapi selama membuat preparat hewan
2. Apakah aspirasi diperlukan selama proses fiksasi? Jelaskan!

22
Lampiran
2. FLOW CHART PEMBUATAN PREPARAT PERMANEN HEWAN

Organ 1x1 cm 2 or 3-5 mm dalam fiksatif (Bouin formol ) fiksasi

jam

Alkohol 70-80-90-95% a 30 min; EtOH abs I 1 jam dehidrasi

EtOH abs II over night

Xylol : EtOH ( 1:1) 30 min xylol 1 dan xylol2 a 1 jam. clearing

X:P (3:1) - x:P (1:1) – X:P (1:3) a 60’ Pra -infiltrasi

Paraffin 2x cair 56-58oC a over-night infiltrasi

Paraffin cair- jaringan-paraffin cair embedding

Block dingin direkatkan di holder, potong 5-8 mikron, pita sectioning

direntang dlm air hangat 37 oC*)satu kelompok

Pita direkat di atas obyek glass, dioven 37-40oC Affixing

Rendam dlm xylol 1, 2,3 a 5 min Deparaffinasi

alkohol absolute 1, 2, alk. 96 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 Staining

%, 30 % dan aquadest a 2-3 min

Rendam Hematoxylin 5-10 min, air mengalir 3-5 min

Aquades 2-3 mint, etanol 30-50-60-70% a 2-3 menit, diiikuti

dalam eosin selama 1-2 menit

Lanjt ke EtOH 70-80-90-90-95 % a 2-3 menit

EtOH abs I dan II, a 2-3 menit

Xilol I dan II, a 10 menit

Tetesi dg Canada balsam atau enthelan kemudian tutup Mounting

dengan cover slide

*) satu kelompok menggunakan kolam air hangat yang sebelumnya mengandung gelatin
0.03%

23
 Latihan 7

Pembuatan Preparat Apus

(Smear Preparation)
7.1 Keterangan dasar
Zat warna yang digunakan ialah Giemsa, larutan cat buatan pabrik yang dijual di
Apotek. Teoritis zat warna ini “dapat” kita buat sendiri, tetapi hasilnya biasanya kurang
memuaskan..
- Encerkan zat warna ini dengan aquadest menjadi larutan 3 %, dengan cara 50
cc aquadest + 1,5 cc zat warna Giemsa.
- Sediaan apus yang telah dikeringkan di udara, difixir dahulu dengan methyl
alcohol selama 3 – 5 menit atau alcohol absolute selama 30 menit atau juga
alcohol ether selama 30 menit.
- Waranailah sediaan apus dengan zat warna Giemsa tersebut selama 30 – 45
menit (Di sini makin lama intensitasnya makin menjadi tua.
- Gamabarlah butir-butir darah tersebut, kalau perlu gunakan gambar
pembanding dari Texbook of Histology.
- Bilaman medulla osseum yang diapuskan, juga harus digambar stadia
perkembangan sel-sel butir darah baik erythrocyte, leucocyte, thrombocyte,
maupun yang terlihat di dalam preparat.

7.2 Tujuan Praktikum

Praktikan dapat membuat preparat smear darah dengan baik

7.3 Bahan yang digunakan

1. Darah (Homo, Kelinci, Aves)

Persiapan alat-alat dan khemikalia :
1. Gelas obyek bersih dan bebas lemak.
2. Jarum Franke atau canule steril (bebas hama), sebelum dipakai harus dibersihkan
dengan alkohol 70 %.
3. Stainning jar (bejana untuk mewarnai)
4. Pipet tetes.

24
 5. Kertas pengfhisap.
6. Kapas.
7. Zat pewarna : Giemsa atau May-Grunwald.
8. Akuades yang telah dididihkan ± 100 0C.
7.4 Cara kerja :
1. Ambil darah dari jari tangan nomor 2, 3 atau 4, dan jari yang akan diambil darahnya
harus digosok dengan alkohol 70 % pada bagian jari yang akan ditusuk.
2. Tetes-tetes pertama (2 – 3) dihapus dengan kertas penghisap, baru tetes berikutnya
diteteskan pada gelas obyek sedemikian rupa sehingga merupakan lingkaran
dengan diameter ± 2 – 3 mm.
3. Letakkan gelas obyek yang lain pada sisi/tepinya yang pendek di muka tetesa darah
tersebut, lalu tariklah ke belakang sedikit sampai menyentuh lingkaran darah
tersebut sehingga timbul kapiler yang menyebabkan darah merata ke kiri dan ke
kanan tepi gelas obyek pertama. Sudut di antara ke dua gelas obyek sebaiknya ± 45
0
. Bilamana sudut terlalu besar atau terlalu kecil, maka film darah akan terlalu
tebal/tipis. Tetesan darah hendaknya diletakkan pada bagian agak ke ujung dari
gelas obyek pertama.
4. Doronglah gelas obyek ke dua maju, dengan kekuatan dan kecepatan yang sama
supaya mendapatkan film darah yang tipis dan sama rata.
( Cara kerja di atas lihat pada Gambar).
B
± 45o

Gambar 1 Gambar 2

± 45o

7.5 Pertanyaan

Apakah untuk meratakan darah bisa digunakan alat lain sebagai pengganti gelas
obyek? Jelaskan!

25
 latihan 8
Pembuatan Preparat Whole Mount Paramaecium sp.
8.1 Keterangan Dasar
Pengertian Wholemount merupakan metode pembuatan preparat yang nantinya akan
diamati dengan/tanpa mikroskop tanpa didahului adanya proses pemotongan secara
mikroskopis (dengan mikrotom). Pada metode ini, preparat yang diamati adalah preparat yang
utuh baik itu berupa sel, jaringan maupun individu. Adapun gambar yang dihasilkan dari
preparat wholemount ini terlihat dalam wujud utuhnya seperti ketika organisme tersebut masih
hidup.

8.2 Tujuan
Untuk membuat preparat Paramaecium sp. secara utuh dan untuk memudahkan mengamati
bentuk sel dan organel-organel sel Paramaecium sp.

8.3 Alat dan Bahan

Alat:. Object glass,Deck glass, Mikroskop, Kamera digital
Bahan:
1. Kultur Paramaecium sp. pada rendaman jerami.
2. Larutan fiksatif FAA
3. Pewarna acetocarmine
4. Pewarna Fastgreen
5. Akuades
6. Alkohol 30 %, Alkohol 50 %, Alkohol 70 %, Alkohol 95 %, dan Alkohol 100 %
7. Campuran larutan alkohol dan xilol dengan perbandingan 3 : 1; 1:1; 1 : 3
8. Xilol murni
9. Entellan
8.4. Cara Kerja
1. Siapkan object glass yang telah dibersihkan.2.
2. Mengolesi object glass tersebut dengan perekat Meyer albuminsampai rata dan dibiarkan
sampai kering.
3. Teteskan kultur murni Paramaecium sp., biarkan airnya sebagian menguap namun jangan
sampai kering. Agar Paramaecium sp.tidak mengalami plasmolisis.

26
 4. Paramaecium sp. difiksasi dengan FAA dan ditunggu sampai kering.
5. Ditetesi dengan pewarna acetocarmine selama 5 – 10 menit.
6. Dicuci dengan akuades selama 2 (dua) menit.
7. Dilakukan dehidratasi dengan alkohol bertingkat, yaitu alkohol 30%, 50%, 70%, 95%,
dan alkohol absolut (100%), masing-masing selama 2 (dua) menit.
8. Dimasukkan ke dalam alkohol-xilol bertingkat, yaitu dengan perbandingan alkohol : xilol
sebesar (3:1), (1:1), (1:3) selama 2 (dua) menit.
9. Dimasukkan ke dalam xilol murni dua kali, masing-masing selama 2 (dua) menit.
10. Direkatkan dengan entellan dan ditutup dengan deck glass. Caranya yaitu dengan cara
meneteskan beberapa tetes entellan pada object glass, lalu perlahan-lahan diletakkan
deck glass pada object glass dengan membentuk sudut lancip (± 45 0C), lalu perlahan-
lahan melepaskan deck glass agar tidak muncul gelembung udara.
11. Setelah entellan kering, dilakukan pengamatan di bawah mikroskop pada perbesaran 100 x,
400 x dan dipotret.

8.5 Pertanyaan/tugas
Jelaskan bagian-bagian tubuh paramaecium ketika focus mikroskop ada dipermukaan atas
tubuh Paramecium, ketika focus dirunkan ke bagian lebih dalam, dan ketika fkus sampai tubuh
bagian bawah.

PUSTAKA :

Humason, G.L., 1966. Animal Tissue Techniques. San Francisco. W.H. Freeman and Company.

27