SNI 2782-1998 Metode Pengujian Susu Segar
SNI 2782-1998 Metode Pengujian Susu Segar
SNI 01-2782-
1998/Rev.1992
SNI 01-2782-1998/Rev.1992
Standar ini merupakan Revisi SNI 01-2782-1992 mengenai Cara Uji Susu Segar
untuk menyempurnakan standar serta metoda pengujian susu segar sehingga
diperoleh adanya keseragaman dalam keakuratan, ketelitian, spesifisitas dan
sensitifitas hasil serta keberulangan yang stabil.
Standar ini disusun sebagai hasil pembahasan Rapat-rapat Teknis, Prakonsensus dan
terakhir dirumuskan dalam Rapat Konsensus Nasional.
1 Ruang lingkup
Standar ini menetapkan metoda untuk mengukur berat jenis (B.J) susu segar.
2 Prinsip
Benda padat yang dicelupkan ke dalam suatu cairan akan mendapatkan tekanan ke
atas seberat volume cairan yang dipindahkan. Berat jenis diukur di antara suhu 20 -
300C kemudian disesuaikan pada :
27,50 76 cm Hg.
BJ.
27,50
3 Pereaksi
Tidak diperlukan.
4 Peralatan
a) Satu Laktodensimeter yang ditera pada suhu 27,5oC (harus ditera ulang tiap
tahun)
d) Termometer.
1 dari 82
5 Prosedur pengujian
5.2 Homogenkan susu dengan sempurna (dituangkan dari gelas piala satu ke
gelas piala lainnya), kemudian dengan hati-hati dituangkan kedalam tabung tanpa
menimbulkan buih.
5.4 Baca skala yang ditunjukkan dan angka yang terbaca menunjukkan angka
ke-2 dan ke-3 dibelakang koma, sedangkan desimal ke-4 dikira-kira.
Contoh :
Bila skala yang terbaca adalah 28, maka angka yang didapat adalah 1,0280
5.6 Temperatur susu diukur dengan ketelitian 0,5oC dan tandon Hg dari
termometer haruslah berada di dalam susu pada waktu pengukuran dilakukan.
6 Hasil Uji
6.1 Untuk laktodensimeter yang ditera pada 27,50C, bila temperatur susu
adalah 29oC sedangkan skala rata-rata adalah 28 maka yang dicatat adalah :
290 C
BJ. 76 cm Hg = 1,0280
0
27,5 C
6.2 Untuk setiap kelebihan atau kekurangan suhu sebesar 10C dilakukan
penyesuaian berat jenis sebesar koefisien muai susu setiap derajat Celcius yakni
0,0002
27,50
BJ. 76 cm Hg =
0
27,5
= 1,0280 + (29 - 27,5) x 0,0002
2 dari 82
= 1,0280 + 0,0003
= 1,0283.
6.3. Bila laktodensimeter yang digunakan ditera pada 150C, maka perhitungan harus
disesuaikan sebagai berikut:
27,50
BJ. 76 cm Hg = 1,0280
0
15
0
27,5
BJ. 76 cm Hg = 1,0280 + (29-27,5) x
0,0002
150
= 1,0280 + 0,003
= 1,0283
27,50 0
BJ. 76 cm Hg = 1,0283 x BJ air pada 15 C
27,50 BJ air pada 27,50C
0
27,5
BJ. 76 cm Hg = 1,0280 + (29-27,5) x
0,0002
150
= 1,0280 + 0,003
= 1,0283
6.4 Tabel 1 memperlihatkan berat jenis dan volume air pada beberapa suhu.
3 dari 82
Tabel 1
(0C) (0C)
24 0,997321 1,0027
4 dari 82
Pengukuran kadar lemak dengan metoda Gerber
1 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metoda pemeriksaan rutin penentuan kadar lemak susu
penuh, susu yang sebagian lemaknya diambil, susu yang tidak dihomogenisasi dan
susu yang dihomogenisasi menggunakan metoda Gerber.
2 Definisi
Metoda Gerber adalah prosedur empiris untuk menentukan nilai kadar lemak susu
dalam satuan gram lemak per 100 ml susu.
3 Prinsip
Asam sulfat pekat merombak dan melarutkan kasein dan protein lainnya, sehingga
menyebabkan hilangnya bentuk dispersi lemak. Pemisahan lemak dipercepat dengan
penambahan amil alkohol yang akan mencairkan lemak dengan panas yang
ditimbulkannya. Dengan sentrifugasi akan menyebabkan lemak terkumpul dibagian
skala dari butirometer.
4 Pereaksi
a) Asam sulfat (H2SO4) 90 - 91% (BJ pada 200 C = 1.818 + 0,003 g/ml)
Penampakan: tidak berwarna atau lebih terang dari warna kuning pucat serta tidak
mengandung endapan.
5 Peralatan
5 dari 82
d) Pipet otomat 1 ml + 0,05 ml (amil alkohol).
e) Pipet otomat 10 ml (asam sulfat pekat), dapat juga digunakan pipet biasa
yang dilengkapi bola karet (untuk penghisap) pada ujungnya.
6 Prosedur
6.1 Metoda ini berlaku untuk 3 jenis susu: susu penuh, susu yang sebagian
lemaknya diambil dan susu yang tidak dihomogenisasi.
6.1.2 Tambahkan 10,75 ml contoh susu dan 1 ml amil alkohol. Urutan dari
pemasukan bahan ke dalam butirometer harus runtut seperti cara di atas.
6.1.4 Setelah terbentuk warna ungu tua sampai kecoklatan (terbentuk karamel),
masukkan butirometer ke dalam sentrifus dan disentrifusi pada 1200 rpm selama 5
menit.
6.1.5 Kemudian masukkan butirometer ke dalam penangas air dengan suhu 650 C
selama 5 menit.
6.1.6 Setelah itu, bacalah skala yang tertera pada butirometer. Skala tersebut
menunjukkan kadar lemak.
6.2.1 Cara pengerjaan contoh sama dengan di atas, hanya setelah pembacaan
skala, butirometer kembali disentrifusi dan dimasukkan ke dalam penangas air (650
C), lalu skala dibaca kembali.
6.2.3 Apabila perbedaan hasil pembacaan skala antara 2 dan 3, antara 3 dan 4
lebih dari 0.05%, maka pengukuran ini dianggap salah.
7 Hasil Uji
6 dari 82
Kadar lemak adalah angka yang ditunjukkan oleh skala dinyatakan dalam persen.
1 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metoda untuk perhitungan kadar bahan kering tanpa lemak
dalam susu segar dengan cepat.
2 Prinsip
Untuk tujuan ini diperlukan persentase kadar lemak dan berat jenis susu.
BJ
BKTL = BK - L
7 dari 82
3 Prosedur
3.1 Setelah angka kadar lemak, dan BJ didapatkan, maka angka-angka tersebut
dimasukkan ke dalam rumus, kemudian dihitung secara biasa, atau
4 Hasil Uji
Hasil uji Kadar Bahan Kering Tanpa Lemak susu dinyatakan dalam persen (%).
8 dari 82
Tabel 2
Lemak 1,31 L Lemak 1,31 L Lemak 1,31 L Lemak 1,31 L Lemak 1,31 L
1,0 1,31 2,5 3,28 4,0 5,24 5,4 7,07 6,8 8,91
1,1 1,44 2,6 3,41 4,1 5,37 5,5 7,21 6,9 9,04
1,2 1,57 2,7 3,54 4,2 5,50 5,6 7,34 7,0 9,17
1,3 1,70 2,8 3,67 4,3 5,64 5,7 7,47 7,1 9,30
1,4 1,83 2,9 3,80 4,4 5,76 5,8 7,60 7,2 9,43
1,5 1,97 3,0 3,93 4,5 5,90 5,9 7,73 7,3 9,56
1,6 2,10 3,1 4,06 4,6 6,03 6,0 7,86 7,4 9,69
1,7 2,23 3,2 4,19 4,7 6,16 6,1 8,00 7,5 9,83
1,8 2,36 3,3 4,32 4,8 6,29 6,2 8,12 7,6 9,96
1,9 2,49 3,4 4,45 4,9 6,42 6,3 8,25 7,7 10,09
2,0 2,62 3,5 4,59 5,0 6,55 6,4 8,38 7,8 10,22
2,1 2,75 3,6 4,72 5,1 6,68 6,5 8,51 7,9 10,35
2,2 2,88 3,7 4,85 5,2 6,81 6,6 8,65 8,0 10,48
9 dari 82
Tabel 3
Penyesuaian untuk BJ
1 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metoda untuk perhitungan kadar BKTL pada susu segar,
krim, buttermilk dan susu kental tawar (tanpa gula).
2 Prinsip
Sejumlah contoh susu dikeringkan pada suhu yang tetap (konstan) sampai berat
kering yang konstan tercapai. Berat setelah pengeringan adalah berat bahan kering.
10 dari 82
3 Peralatan
b) Oven
c) Eksikator
d) Cawan dari bahan anti karat (alumunium, nikel, gelas) yang dilengkapi
dengan tutup, mempunyai dasar rata, tinggi sekitar 3 cm dengan garis tengah 6-8 cm.
e) Penangas air
4 Prosedur
4.1 Keringkan cawan dan tutupnya dalam oven dengan suhu 102 + 20C
selama 30 menit.
4.2 Setelah itu masukkan cawan beserta tutupnya ke dalam eksikator sampai
suhunya sama dengan suhu kamar, kemudian timbang (G1).
4.3 Masukkan 3 ml contoh susu ke dalam cawan dan timbang kembali beserta
tutupnya (G2).
4.4 Letakkan cawan di atas penangas air (mendidih) selama 30 menit. Untuk
mencegah terbentuknya kulit, teteskan etanol sebanyak 5 - 10 tetes.
4.5 Masukkan kembali cawan ke dalam oven (suhu 102 + 20C) selama 1 jam
dan letakkan tutup cawan disamping cawan.
4.6 Tutup kembali cawan dan masukkan ke dalam eksikator dan biarkan hingga
suhu cawan sama dengan suhu kamar.
4.8 Masukkan kembali cawan ke dalam oven selama 1 jam dan setelah itu
masukkan kembali ke dalam eksikator hingga suhunya sama dengan suhu kamar,
kemudian timbang lagi (G3.2.).
4.9 Lakukan prosedur tersebut sampai tercapai berat konstan (G3.1=G3.2) atau
selisih hasil pengukuran sebelum dan sesudahnya tidak melebihi 0,5 mg.
11 dari 82
5 Cara Perhitungan
G2 - G1
6 Hasil Uji
12 dari 82
Uji protein menurut Kjeldahl
1 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metoda penentuan kadar protein susu segar dengan metoda
Kjeldahl.
2 Prinsip
Pemanasan contoh susu dalam asam sulfat pekat mengakibatkan terjadinya destruksi
protein menjadi unsur-unsurnya. Untuk mempercepat proses destruksi tersebut
sering ditambahkan kalium sulfat bersamaan dengan cupri sulfat (sebagai indikator)
sehingga gugusan N (organik) akan berubah menjadi gugusan amonium sulfat.
3 Pereaksi
f) Asam borat 4% (40 gram asam borat dilarutkan dalam 1.000 ml aquades)
g) Larutan indikator Kjeldahl (2 gram methyl red dan 1 gram methylen blue
dilarutkan dalam 1.000 ml etanol 96%).
4 Peralatan
13 dari 82
a) Labu Kjeldahl 500 ml
e) Alat pelengkap lain untuk analisa protein (pemanas, alat destilasi, sumbat
penghubung)
f) Pendingin Liebig
5 Prosedur
5.1 Masukkan ke dalam labu Kjeldahl 5 gram contoh susu, batu didih, 10 gram
K2SO4 dan 0,25 gram CuSO4. Kemudian tambahkan 20 ml H2SO4 dan campur
dengan baik.
5.2. Panaskan hingga tidak ada uap, teruskan pemanasan sampai mendidih dan
sekali-sekali labu diputar.
5.3. Setelah cairan dalam labu terlihat jernih dan tak berwarna, teruskan
pemanasan selama 90 menit, kemudian didinginkan.
5.4 Setelah mencapai suhu kamar, tambahkan 150 ml aquades serta beberapa
butir batu gelas, campur dan biarkan hingga dingin.
5.7. Pasanglah labu Kjeldahl dengan segera pada alat destilasi. Panaskan labu
Kjeldahl, mula-mula secara perlahan-lahan sampai dua lapisan cairan tercampur,
kemudian panaskan dengan cepat sampai mendidih. Atur panasnya sampai terjadi
proses destilasi (waktu pemanasan minimum 20 menit).
14 dari 82
5.8. Menjelang berakhirnya proses destilasi letakkan erlenmeyer pada
tempat yang lebih rendah sehingga ujung pipa tidak menyentuh larutan asam borat
lagi.
5.9. Dinginkan hasil destilasi (destilat) dan jaga agar larutan asam borat tidak turut
panas.
6 Cara Penghitungan
1,4 x N x (A - B) x 6,38
Kandungan protein (%) =
C
7 Hasil Uji
15 dari 82
Uji warna, bau, rasa dan kekentalan
1 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metoda uji warna, bau, rasa dan kekentalan pada susu segar
secara organoleptik.
2 Definisi
Uji organoleptik adalah pengujian warna, bau, rasa dan kekentalan suatu produk
makanan dengan menggunakan indera manusia sebagai alat utama untuk mengetahui
kelainan-kelainan pada produk makanan tersebut.
3 Prinsip
Susu dapat berubah warna, bau, rasa, dan kekentalannya oleh sebab-sebab di
bawah ini:
3.1 Warna
3.1.1 Menjadi kebiruan bila ditambah dengan air ataupun dikurangi lemaknya.
3.1.2 Menjadi kemerahan bila mengandung darah dari sapi yang menderita
mastitis.
3.2 Bau
3.3 Rasa
3.3.3 Susu memiliki rasa sabun disebabkan oleh Bacillus lactis saponacei.
3.3.4 Susu memiliki rasa tengik disebabkan oleh kuman-kuman asam mentega.
16 dari 82
3.4 Kekentalan
Susu akan berlendir bila terkontaminasi oleh kuman-kuman kokki yang berasal dari
air, sisa makanan atau dari alat-alat susu.
4 Pereaksi
Tidak diperlukan.
5 Peralatan
a) Tabung reaksi
6 Prosedur
6.1.2 Dengan latar belakang putih amati kelainan pada warna susu.
6.2.1 Masukkan ke dalam tabung reaksi kurang lebih 5 ml susu, atau dapat pula
dipakai susu dalam tabung yang telah diuji warnanya pada butir 5.1. di atas,
kemudian dicium baunya.
6.3.2 Tuangkan sejumlah susu di telapak tangan kemudian dicicipi dan rasakan
adanya perubahan rasa susu.
17 dari 82
6.4.1 Masukkan kurang lebih 5 ml susu ke dalam tabung reaksi.
6.4.3 Pada saat menegakkan tabung kembali perhatikan bagian susu yang
membasahi dinding terhadap kecepatan turunnya susu serta adanya butiran, lendir
dan sebagainya.
7 Hasil uji
Susu dianggap baik bila tidak dijumpai perubahan atau penyimpangan dalam warna,
bau, rasa maupun kekentalannya.
18 dari 82
Uji titrasi keasaman Soxhlet Henkel
1 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metoda pengukuran derajat asam susu dengan cara titrasi.
2 Definisi
Yang dimaksud dengan derajat asam Soxhlet Henkel adalah jumlah ml NaOH 0,25
N yang diperlukan untuk menetralisasi asam yang berada dalam 100 ml susu dengan
phenolphthalein sebagai indikator.
3 Pereaksi
c). Larutan Cobalt Sulfat (5 gram CoSO4. 7H2O, dilarutkan dalam aquadest
sampai 100 ml) sebagai zat warna standar (kontrol) untuk memastikan bahwa reaksi
pengikatan asam dalam susu oleh NaOH telah mencapai titik netral.
4 Peralatan
c) Pipet berskala.
5 Prosedur
5.3. Salah satu dari labu erlenmeyer tersebut dititrasi dengan larutan 0,25 N
NaOH hingga terbentuk warna merah muda yang tetap bila dikocok.
19 dari 82
5.4. Sebagai warna pembanding, susu di dalam labu erlenmeyer kedua ditambah
dengan 1 ml larutan cobalt sulfat (CoSO4. 7H2O). Warna standar ini hanya dapat
dipakai maksimum 3 jam. Setelah 3 jam harus diganti yang baru.
6 Cara Penghitungan
Derajat Soxhlet (0SH) adalah jumlah 0,25 N NaOH yang digunakan dikalikan nilai
dua. Misalnya dalam titrasi diperlukan 3,5 cc 0,25 N NaOH untuk menetralkan 50
ml susu, maka derajat keasamannya adalah:
3,5 x 100 ml = 70 SH
50ml
7 Hasil Uji
Hasil uji titrasi keasaman susu segar dinyatakan dalam derajat Soxhlet (0SH).
20 dari 82
Uji alkohol
1 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metoda untuk memeriksa dengan cepat derajat keasaman
susu segar.
2 Prinsip
Kestabilan sifat koloidal protein-protein susu tergantung pada selubung air yang
menyelimutinya. Hal ini terutama pada kasein. Bila susu dicampur dengan alkohol
yang mempunyai sifat dehidrasi maka protein tersebut akan terkoagulasi sehingga
susu tersebut akan pecah. Semakin tinggi derajat keasaman susu yang diperiksa,
maka akan semakin rendah jumlah alkohol dengan kepekatan tertentu yang
diperlukan untuk memecahkan susu dengan volume yang sama. Percobaan mulai
positif pada derajat asam 8 - 90 SH.
3 Pereaksi
4 Peralatan
a) Tabung reaksi.
5 Prosedur
5.3. Amati terhadap adanya gumpalan dan atau pemisahan bagian-bagian protein
susu.
21 dari 82
6 Hasil uji
22 dari 82
Uji katalase
1 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metoda untuk menentukan adanya sel-sel radang (leukosit),
kuman dan adanya bahan organis seperti santan di dalam susu segar.
2 Prinsip
Di dalam susu terdapat enzim katalase yang dibentuk oleh sel-sel leukosit, kuman-
kuman, reruntuhan sel ambing dan zat organis yang membebaskan oksigen (O2) dari
larutan peroksidanya (H2O2).
3 Pereaksi
4 Peralatan
a) Pipet steril 5 , 10 ml
b) Tabung katalase
5 Prosedur
5.4. Sumbat tabung dengan kapas, kemudian masukkan ke dalam inkubator 370
C.
23 dari 82
5.5. Tetapkan volume gas O2 yang terkumpul di dalam puncak tabung setelah 3
jam.
6 Hasil Uji
Angka katalase adalah jumlah cc gas oksigen yang terkumpul di dalam puncak
tabung. Angka katalase maksimum adalah 3,0.
24 dari 82
Penentuan titik beku
1 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metoda penentuan titik beku susu segar untuk mengetahui
kemungkinan adanya pemalsuan susu dengan air.
2 Prinsip
Kenaikan atau penurunan titik beku susu adalah selisih antara titik beku air dengan
standar titik beku susu. Kenaikan titik beku menyatakan adanya indikasi
penambahan air, sedangkan penurunan titik beku menyatakan adanya indikasi
penambahan susu bubuk atau tepung.
4 Pereaksi
4.1. Cairan pendingin dengan suhu kira-kira -40 C yang terbuat dari 2 gr NaCl
yang telah ditumbuk halus di dalam 200 cc air dan kemudian dimasukkan
kedalamnya 400 gr es.
5 Peralatan
f) Batang pengaduk terbuat dari logam yang tidak bereaksi terhadap susu,
berdiameter antara 1 - 1,5 mm.
25 dari 82
6 Prosedur
6.2 Pada lubang pertama masukkan/tanamkan kristal es dan aduk cairan dengan
alat pengaduk, sedang lubang yang satu lagi dimasukkan thermometer Beckmann
dengan ujungnya tepat berada di pertengahan cairan.
6.3 Masukkan tabung ini ke dalam cairan pendingin berisolasi dengan suhu -2
sampai -60 C sambil diaduk terus secara teratur dan perlahan-lahan sampai suhu
dalam tabung mencapai 10 C dibawah titik beku air.
6.6 Ke dalam cairan pendingin dimasukkan kristal es murni kecil dan diaduk
secara merata. Penaikan tiang raksa harus diperhatikan hingga kira-kira selama 1
menit tiang raksa tidak bergerak lagi.
6.7 Bila hal ini sudah tercapai, ketuk thermometer perlahan-lahan dan tingginya
tiang air raksa diperiksa dengan loupe hingga 0,0010 C. Bila es yang terbentuk sudah
meleleh lagi, ulangi lagi cara kerja ini dengan catatan perbedaannya tidak boleh lebih
dari 0,0050 C.
6.8 Dengan cara yang serupa dilakukan perlakuan terhadap 30 cc susu. Akan
tetapi cairan hanya didinginkan sampai 1,50 C dibawah titik beku air dan yang
dimasukkan/ditanamkan adalah sepotong kecil susu beku. Perbedaan antara dua kali
penentuan tidak boleh lebih dari 0,0050 C.
6.9 Bila menggunakan thermometer yang tidak ditera lebih dahulu, hendaknya
dengan thermometer ini kita menentukan titik beku larutan 10 gr NaCl murni dalam 1
liter air, dimana titik ini harus -0,6030 C.
7 Hasil uji
26 dari 82
Hasil uji titik beku susu dinyatakan dalam derajat Celcius (0 C). Titik beku susu yang
memenuhi syarat mutu adalah -0,5200 C sampai -0,5600 C.
27 dari 82
Pengukuran angka refraksi metoda Ackermann
1 Ruang Lingkup
2 Prinsip
Angka refraksi ditetapkan dari serum kalsium khlorida (CaCl2) susu yang
disesuaikan pada suhu 27,5o C, dan dihitung angka refraksinya.
3 Pereaksi
Serum CaCl2 20% (20 gr CaCl2 dilarutkan dalam 100 ml aquades) dengan BJ =
1,1375.
Bila larutan CaCl2 diencerkan dengan aquades (1:10) pada suhu 17,50C, maka
refraktometer harus menunjukkan angka 26.
4 Peralatan
b) Penangas air
c) Corong
d) Kertas saring
5 Prosedur
28 dari 82
5.2. Tambahkan 0,25 ml larutan CaCl2 20%.
5.3. Labu Erlenmeyer disumbat dengan sumbat yang dilengkapi gelas untuk
menghindari kehilangan cairan akibat penguapan.
5.4. Letakkan labu Erlenmeyer dalam penangas air (mendidih) selama 15 menit.
5.8. Celupkan refraktometer ke dalam cuvet dan baca skala yang tertera. Setelah
itu ukur suhu serum tersebut dengan termometer.
5.9. Koreksi suhu serum yang didapat ke 27,50 C yang merupakan rata-rata suhu
kamar di Indonesia (Tabel 4).
6 Cara pengukuran
6.1 Jika pada suhu 30o C didapatkan angka 18,0, maka kalau dikembalikan
pada 27,5o C akan menjadi : 18,0 + 0,75 = 18,75.
6.2 Jika pada suhu 20o C didapatkan angka 45,0, maka kalau dikembalikan
pada 27,5o C akan menjadi : 45,0 - 2,55 = 42,45.
29 dari 82
Tabel 4
30 dari 82
Uji reduktase
1 Ruang Lingkup
2 Prinsip
Di dalam susu segar terdapat enzim reduktase yang dibentuk oleh kuman yang
mereduksi zat warna indikator menjadi larutan yang tidak berwarna.
3 Pereaksi
c) Campur dengan baik dan simpan dalam temperatur 4-80 C dan terlindung
dari cahaya. Larutan ini dapat bertahan selama 4 minggu.
4 Peralatan
c) Labu erlenmeyer.
d) Inkubator atau penangas air dengan suhu 37o C yang terlindung dari cahaya.
5 Prosedur
31 dari 82
5.1. Masukkan ke dalam tabung reduktase steril 1 ml larutan biru metilen.
5.3. Tutup tabung tersebut dengan sumbat, lalu campurkan biru metilen dengan
contoh susu dengan cara membolak-balikkan tabung (+ 3 kali) sampai warna biru
tersebar merata.
5.4. Masukkan tabung ke dalam penangas air (37 + 10 C) selama 4 - 4,5 jam.
Letakkan penangas air di tempat yang terlindung dari cahaya. Bila menggunakan
inkubator, masukkan dulu tabung dalam penangas air (37 + 10 C) selama 5 menit
untuk menghangatkan baru dimasukkan ke dalam inkubator.
Pembacaan hasil dapat dimulai minimal setelah 2/3 dari warna sudah berubah
menjadi putih. Sebaiknya reaksi ditunggu sampai seluruh warna biru hilang.
7 Hasil Uji
Hasil uji dinyatakan dalam satuan waktu, dimana waktu reduksi (angka reduktase)
menunjukkan waktu yang dibutuhkan sejak saat memasukkan tabung kedalam
inkubator/penangas air bersuhu 37o C sampai seluruh warna biru hilang.
32 dari 82
Tabel 5
33 dari 82
Metoda 02 : Uji resazurin
1 Pereaksi
1.1 Masukkan 1 ampul resazurin (Fa. Retorte) ke dalam labu erlenmeyer steril.
1.2 Larutkan dengan air panas, kemudian dengan aquades bersuhu 600 C.
Setiap ampul dapat dilarutkan dengan 250, 500 atau 1000 ml.
1.3 Larutan disimpan dalam tempat yang terlindung dari cahaya. Pembuatan
larutan jangan lebih dari 3 jam sebelum pemeriksaan dilaksanakan.
2 Peralatan
Sterilisasi tabung tidak boleh lebih dari 48 jam sebelum uji dilaksanakan.
Sterilisasi sumbat karet dilakukan dalam autoklaf selama 10 menit atau dalam air
mendidih selama 0,5 jam.
c) Pipet steril 1, 10 ml
3 Prosedur
3.1 Masukkan 1 ml zat warna dalam tabung reduktasi steril dan tambahkan 10
ml susu.
3.2 Tutuplah tabung dengan sumbat karet dan dibolak-balik minimal 3 kali.
3.3 Masukkan tabung ke dalam penangas air (37 + 10 C) selama 1 jam. Bila
akan menggunakan inkubator, maka tabung terlebih dahulu harus dimasukkan ke
dalam penangas air (37 + 10 C) selama 5 menit kemudian dimasukkan ke dalam
inkubator selama 55 menit.
34 dari 82
3.4 Pembacaan dapat dilakukan 1 jam setelah tabung reduktase tadi dikeluarkan
dari penangas air atau inkubator dan sebelum pembacaan dimulai hendaknya tabung
dimiringkan atau dibalikkan dahulu 1 kali.
4 Hasil uji
Cocokkan warna yang terbentuk dengan standar warna yang tersedia setelah lewat
waktu yang ditetapkan.
35 dari 82
Uji sedimen
1 Ruang Lingkup
2 Prinsip
Kadar sedimen susu ditentukan dengan cara memusingkan susu dengan kecepatan
tinggi.
3 Pereaksi
Tidak diperlukan
4 Peralatan
5 Prosedur
5.1 Susu yang belum disaring dipanaskan hingga 60o C selama 5 menit.
5.2 Isi tabung Tromsdorf dengan susu yang telah dipanaskan tadi sampai garis
10 ml.
5.3 Susu tersebut disentrifusi selama 10 menit dengan putaran 3000 rpm/ menit.
5.5 Letakkan tabung terbalik diatas rak untuk beberapa waktu kemudian kadar
sedimen dibaca.
6 Hasil Uji
36 dari 82
Pengujian cemaran mikroba
1 Pendahuluan
Pengujian cemaran mikroba dalam susu segar adalah bertujuan sebagai indikator
sanitasi dalam roses produksi atau penanganan susu serta sebagai indikator
kesehatan dan keamanan susu.
Berbagai macam uji mikrobiologi dapat dilakukan, meliputi uji kuantitatif mikroba
untuk menentukan kualitas, uji kualitatif bakteri patogen untuk menentukan tingkat
keamanannya, serta uji bakteri indikator untuk menentukan tingkat sanitasi susu
tersebut.
2 Ruang Lingkup
3 Peralatan Umum
Catatan: Seluruh peralatan yang mengalami kontak langsung dengan contoh susu
yang diuji, pelarut maupun media biakan harus steril.
a) Pipet yang disumbat dengan kapas dengan ukuran 1 ml, 5 ml atau 10 ml.
b) Cawan petri, terbuat dari gelas atau plastik, berdiameter 90 - 100 mm.
d) Labu erlenmeyer.
e) Inkubator.
f) Pembakar Bunsen.
g) Penangas air.
37 dari 82
k) Ose.
l) Timbangan
1 Prinsip
Angka lempeng total (Total Plate Count) dimaksudkan untuk menunjukkan jumlah
mikroorganisma yang terdapat dalam susu dengan metoda hitungan cawan.
Jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel
mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat
langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop.
2 Media
3 Prosedur
Umum : selama pengerjaan penuangan, beberapa hal yang perlu diperhatikan adalah
sebagai berikut:
a) Jaga agar tutup cawan tetap berada pada tempatnya kecuali pada saat akan
menambahkan larutan contoh atau media PCA tutup cawan jangan dibuka terlalu
lebar untuk menghindari kontaminasi dari luar.
b) Jarak waktu antara memipet larutan contoh hingga penuangan media PCA
ke cawan petri dilakukan dalam waktu tidak lebih dari 10 menit.
38 dari 82
3.1 Pemupukan dan penuangan media pada cawan
3.1.3 Letakkan labu erlenmeyer secara berderet dan masing-masing diberi tanda
1:10, 1:100, 1:1.000, dan seterusnya serta 1 (satu) labu erlenmeyer lainnya dengan
tanda K (Kontrol).
3.1.4 Deretkan pula cawan petri di depan labu erlenmeyer seperti dimaksud pada
butir 3.1.3 disesuaikan dengan pengencerannya. Untuk meningkatkan ketepatan
pengujian, sebaiknya pemupukan dilakukan secara duplo. Dengan mengetahui
sejarah contoh susu serta berdasarkan pengalaman, maka cemaran mikroba dalam
susu dapat diperkirakan jumlahnya secara kasar, sehingga pemupukan pada cawan
petri dapat diambil dari 3 atau 4 konsentrasi tertentu yang berurutan.
3.1.5 Bila diharapkan jumlah cemaran susu adalah 105, maka contoh susu
dikocok dengan shaker/pengocok mekanis dan dengan menggunakan pipet steril
pindahkan 0,1 ml ke dalam cawan petri bertanda 10-1 dan sebanyak 1 ml ke dalam
Buffered Peptone Water 0,1% dalam labu erlenmeyer I bertanda 1 : 10.
3.1.6 Kocok labu erlenmeyer (I) ini dengan shaker/pengocok mekanis, kemudian
dengan pipet steril dipindahkan 0,1 ml ke dalam cawan petri bertanda 10-2, dan 1
ml ke dalam labu Erlenmeyer II bertanda 1:100.
3.1.8 Dengan pipet steril, pindahkan 1 ml Buffered Peptone Water dari labu
Erlenmeyer bertanda K ke dalam cawan petri bertanda K.
3.1.9 Sementara itu tabung reaksi yang berisi 12 - 15 ml PCA dipanaskan dalam
penangas air sampai mencair, kemudian didinginkan sampai suhunya mencapai 40 -
50oC.
3.1.11 Supaya larutan contoh dan media PCA dapat tercampur dengan baik, maka
lakukan gerakan searah gerakan jarum jam yang dilanjutkan dengan gerakan
berlawanan dengan arah jarum jam, atau dengan gerakan seperti angka delapan,
masing-masing sebanyak 5 kali. Selama pencampuran, jaga jangan sampai tutup
39 dari 82
cawan terkena campuran larutan contoh dan media tersebut. Biarkan cawan-cawan
tersebut pada posisi horisontal sampai mengeras.
3.2. Inkubasi
3.2.1 Segera setelah media mengeras, cawan-cawan petri tersebut dibalik hingga
posisi tutupnya berada di bawah, dan masukkan ke dalam inkubator 35oC selama
48 jam
3.2.2 Cawan-cawan harus diatur sedemikian rupa sehingga inkubator tidak terlalu
penuh, dan tidak ada cawan yang menyentuh dinding inkubator. Cawan boleh diatur
bersusun yang tingginya tidak lebih dari 6 cawan.
4 Penghitungan koloni
4.1 Pilihlah cawan yang ditumbuhi oleh koloni yang jumlahnya antara 25 - 250.
Bila cawan dari tingkat pengenceran berbeda memiliki jumlah koloni pada kisaran
tersebut di atas, maka pilihlah cawan dengan koloni yang lebih banyak.
4.2 Gunakanlah tally counter untuk menghitung koloni, dan berilah tanda koloni
yang sudah dihitung untuk menghindari penghitungan ulang.
4.3 Bila ada koloni yang menyebar, maka dihitung sebagai satu koloni. Akan
tetapi bila lebih dari 25% koloni yang tumbuh pada suatu cawan adalah koloni yang
menyebar, maka cawan tersebut tidak perlu dihitung.
5 Interpretasi Hasil/Perhitungan
Jumlah koloni per ml susu dihitung dengan mengalikan jumlah rata-rata koloni dari
pengenceran yang dipilih dengan kebalikan dari faktor pengenceran
Contoh:
= 10-4 x 1,0
= 10-4
40 dari 82
Jumlah koloni = Jumlah koloni x 1/faktor pengenceran per cawan
= 6.2 x 105
6 Pelaporan
6.1 Untuk melaporkan hasil analisa mikrobiologi digunakan suatu standar yang
disebut Standard Plate Count (SPC) dengan satuan colony-forming units (CFU)
per mililiter atau per gram, dan hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka,
yaitu angka pertama di depan koma dan angka kedua di belakang koma. Jika angka
yang ketiga sama dengan atau lebih besar dari 5, maka dilakukan pembulatan satu
angka lebih tinggi dari angka kedua.
6.2 Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan angka
kurang dari 25 koloni, maka hanya jumlah koloni pada pengenceran terendah yang
dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 25 dikalikan dengan besarnya
pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda kurung.
6.3 Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan lebih
dari 250 koloni, maka hanya jumlah koloni pada pengenceran tertinggi yang dihitung,
misalnya dengan cara menghitung jumlahnya pada 1/4 bagian cawan petri, kemudian
hasilnya dikalikan empat. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 250 dikalikan
dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan
dalam tanda kurung.
41 dari 82
Jumlah koloni per SPC Keterangan
pengenceran
6.4 Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per pengenceran, maka data yang
diambil harus dari kedua cawan tersebut, tidak boleh hanya dari salah satunya,
meskipun salah satu dari cawan duplo tersebut.
7 Hasil Uji
Jumlah koloni yang diperoleh dinyatakan dengan Colony Forming Units (CFU) per
ml.
1 Prinsip
Kristal violet dan garam empedu yang ada di media akan menghambat bakteri Gram
positif lainnya sehingga hanya organisme coliform yang tumbuh. Selama
pertumbuhannya, coliform akan mengubah laktosa menjadi asam dan perubahan ini
akan dideteksi oleh indikator neutral red yang akan berubah warnanya menjadi
merah. Selain itu keadaan asam akan menyebabkan presipitasi asam empedu.
42 dari 82
2 Media, pereaksi dan kuman uji
f) EC broth
i) MR-VP broth
l) Reagen Kovac
3 Peralatan
4 Prosedur
4.1.2 Masukkan 0,1 ml atau 1,0 ml contoh ke dalam cawan petri steril. Pengujian
sebaiknya dilakukan secara duplo. Kemudian tuangkan 10 - 15 ml media VRBA
(suhu antara 45 - 480C). Supaya larutan contoh dan media agar dapat tercampur
43 dari 82
dengan baik, maka putarlah cawan dengan gerakan searah gerakan jarum jam yang
dilanjutkan dengan gerakan berlawanan dengan arah jarum jam, atau dengan gerakan
seperti angka delapan, masing-masing sebanyak 5 kali. Selama pencampuran, jaga
jangan sampai tutup cawan terkena campuran larutan contoh dan media tersebut.
4.1.3 Setelah memadat tuangkan kembali 3-4 ml VRBA cair (overlay) di atas
permukaan agar.
4.1.4 Segera setelah media mengeras, cawan-cawan petri tersebut dibalik hingga
posisi tutupnya berada di bawah, dan masukkan ke dalam inkubator 350C selama
18-24 jam.
4.1.5 Cawan-cawan harus diatur sedemikian rupa sehingga inkubator tidak terlalu
penuh, dan tidak ada cawan yang menyentuh dinding inkubator. Cawan boleh diatur
bersusun yang tingginya tidak lebih dari 6 cawan.
4.1.6 Hitung semua koloni berwarna merah keunguan yang dikelilingi zona merah
(diameter koloni pada umumnya 0,5 mm atau lebih). Pilihlah cawan yang ditumbuhi
oleh koloni yang jumlahnya antara 25 - 250. Bila cawan dari tingkat pengenceran
berbeda memiliki jumlah koloni pada kisaran tersebut di atas, maka pilihlah cawan
dengan koloni yang lebih banyak. Gunakanlah tally counter untuk menghitung
koloni, dan berilah tanda koloni yang sudah dihitung untuk menghindari penghitungan
ulang.
4.1.7 Hasil yang diperoleh adalah jumlah presumtif coliform per ml/gram contoh.
Untuk mendapatkan jumlah coliform sebenarnya perlu dilanjutkan ke uji konfirmasi
coliform.
4.2.1 Pilihlah koloni-koloni yang mewakili semua jenis koloni yang tumbuh.
Ambillah 10 koloni dengan ose steril, dan pindahkan masing-masing ke dalam 10 ml
BGLBB steril dalam tabung-tabung reaksi yang telah dilengkapi dengan tabung
durham.
4.2.2 Inkubasikan tabung-tabung reaksi tersebut pada suhu 350C selama 24-48
jam, amati terbentuknya gas dalam tabung durham sebagai reaksi positif.
4.2.3 Hitunglah tabung yang berisi gas. Untuk meyakinkan pertumbuhan coliform,
buatlah preparat ulas dari tabung positif yang diwarnai pewarnaan Gram.
44 dari 82
4.3 Interpretasi Hasil
Jumlah coliform per ml/gram = % tabung positif x jumlah (seluruh) koloni dalam
cawan petri x faktor pengenceran cawan petri tersebut.
4.4 Uji konfirmasi Escherichia coli dengan metoda the Most Probable
Number (MPN)
4.4.1 Siapkan beberapa seri (seri 3 atau 5) tabung yang berisi EC broth yang
dilengkapi dengan tabung Durham.
4.4.2 Pilihlah tabung BGLB positif sedikitnya dari tiga pengenceran yang
berurutan. Goyangkan secara hati-hati tabung positif tersebut dan dengan ose steril
pindahkan suspensi ke masing-masing seri tabung reaksi berisi EC broth, disesuaikan
dengan pengencerannya.
4.4.3 Inkubasikan tabung rekasi tersebut pada suhu 45,50C selama 48 jam. Amati
terbentuknya gas sebagai reaksi positif setelah diinkubasikan selama 24 jam. Bila
belum terbentuk gas, inkubasi dilanjutkan dan amati reaksi positif pada 48 jam.
4.4.4 Jumlah tabung yang positif dari masing-masing seri dicocokkan dengan tabel
statistik untuk mengetahui jumlah fecal coliform, dan dinyatakan dengan MPN per
unit sampel.
4.4.5 Dengan ose steril pindahkan suspensi dari masing-masing tabung positif ke
Levine's eosin-methylen blue (L-EMB) agar dan goreskan ke permukaan agar
beberapa kali agar dapat diperoleh koloni tunggal. Inkubasikan cawan pada suhu
350C selama 18-24 jam dan amati adanya koloni berwarna gelap dan datar dengan
atau tanpa warna metal.
4.4.6 Pindahkan 2 koloni yang dicurigai dari tiap cawan L-EMB ke agar miring
PCA untuk pengujian morfologi dan biokimia, kemudian inkubasikanh pada suhu
350C selama 18-24 jam.
45 dari 82
4.4.7 Lakukan pewarnaan Gram, amati adanya bakteri coccus atau cocoid, Gram
negatif. Uji konfirmasi E. coli dilanjutkan ke uji biokimia IMViC (Indol-Voges
Proskauer-Methyl red-Citrat) sebagai berikut:
a) Produksi Indole.
Inokulasi tabung berisi tryptone broth dan inkubasikan pada suhu 350C selama 24
jam. Tambahkan 0,2 - 0,3 reagent Kovacs untuk menguji adanya pembentukan
indole yang ditunjukkan dengan adanya warna merah yang jelas di bagian atas.
b) Voges-Proskauer.
Inokulasi tabung berisi MRVP broth dan inkubasikan pada suhu 350C selama 48
jam. Pindahkan 1 ml suspensi ke dalam tabung berukuran 13 x 100 mm. Tambahkan
0,6 larutan alpha-naphthol dan 0,2 ml KOH 40%, kemudian kocok. Setelah itu
tambahkan beberapa kristal kreatin, kocok lagi dan diamkan selama 2 jam. Uji
positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna pink eosin.
c) Methyl red.
Setelah test VP, inkubasikan lagi tabung MRVP pada suhu 350C selama 48 jam.
Tambahkan 5 tetes larutan methyl red ke masing-masing tabung. Positif test
ditunjukkan dengan adanya warna merah yang jelas. Sedangkan reaksi negatif
ditunjukkan dengan adanya warna kuning.
d) Citrate.
Inokulasi secara ringan tabung yang berisi Koser citrate broth; hindari adanya
kekeruhan yang dapat terdeteksi dengan jelas. Inkubasikan pada suhu 350C selama
9 jam. Adanya kekeruhan yang jelas menunjukkan reaksi positif.
Inokulasi tabung berisi LST broth dan inkubasikan pada suhu 350C selama 48 jam.
Reaksi positif ditunjukkan dengan berpindahnya media dari tabung bagian dalam atau
timbulnya busa setelah dilakukan agitasi secara halus.
f) Interpretasi.
Semua kultur yang 1) memfermentasikan laktosa dengan produksi gas pada suhu
350C dalam 48 jam, 2) muncul sebagai bakteri coccus, Gram negatif, dan 3)
mempunyai pola ++-- (biotipe 1) atau -+-- (biotipe 2) pada uji IMViC dinyatakan
sebagai E. coli. Hitung MPN E. coli berdasarkan tabung-tabung EC yang
mengandung E. coli yang berasal dari 3 konsentrasi yang berurutan.
46 dari 82
03. Penghitungan Staphylococcus aureus dengan metoda hitungan cawan
Metoda ini digunakan untuk menghitung jumlah S. aureus lebih besar dari 100 sel S.
aureus per ml/gram contoh. Metoda yang biasa digunakan adalah metoda
sebar/permukaan.
1 Prinsip
Manitol akan diubah oleh Staphylococcus yang tumbuh menjadi asam dan susuana
asam ini akan mengubah indikator phenol red menjadi kuning. Tellurite yang ada
akan menjadi tellurite yang berwarna hitam.
2 Media, pereaksi
3 Prosedur
47 dari 82
3.2 Inkubasi
3.2.2 Cawan-cawan harus diatur sedemikian rupa sehingga inkubator tidak terlalu
penuh, dan tidak ada cawan yang menyentuh dinding inkubator. Cawan boleh diatur
bersusun yang tingginya tidak lebih dari 6 cawan.
3.3.1 Pilihlah cawan yang ditumbuhi oleh koloni tipikal S. aureus yang jumlahnya
antara 20 - 200 koloni. Bila cawan dari tingkat pengenceran berbeda memiliki
jumlah koloni pada kisaran tersebut di atas, maka pilihlah cawan dengan koloni yang
lebih banyak. Koloni khas S. aureus adalah bulat, licin halus, cembung, basah dan
berdiameter 2-3 mm jika koloni tidak padat, berwarna abu-abu sampai hitam pekat,
dikelilingi zona opak, dengan atau tanpa zona luar yang jelas.
3.3.2 Gunakanlah tally counter untuk menghitung tipikal koloni, dan berilah tanda
koloni yang sudah dihitung untuk menghindari penghitungan ulang. Bila ditemukan
adanya beberapa jenis koloni, hitung dan catat jenis koloni. Uji konfirmasi dapat
dilakukan dengan uji koagulase, clumping faktor dan pewarnaan Gram.
3.4.1 Pindahkan koloni yang diduga S. aureus ke dalam tabung berisi 0,2-0,3 ml
BHI broth dan larutkan dengan seksama.
3.4.3 Bila reaksi koagulase dari kultur yang diduga tidak dapat dipastikan berasal
dari S. aureus, maka inokulasikan kultur tersebut pada kultur yang sudah diketahui
positif dilanjutkan pada kultur yang sudah diketahui negatif S. aureus.
3.4.4 Lakukan pewarnaan Gram terhadap semua kultur yang diduga S. aureus
dan periksa di bawah mikroskop.
48 dari 82
4 Interpretasi Hasil/Perhitungan
Jumlah S. aureus per ml susu dihitung dengan mengalikan jumlah rata-rata koloni
dari pengenceran yang dipilih dengan kebalikan dari faktor pengenceran
04 Pengujian Salmonellae
1 Prinsip
49 dari 82
3 Prosedur
3.1.1 Masukkan 25 ml contoh susu ke dalam 225 ml BPW dan campur hingga
benar-benar merata, kemudian inkubasikan pada suhu 370 C selama 24 jam.
3.1.2 Sebagai kontrol, inokulasi BPW dalam 2 tabung reaksi dengan masing-
masing kuman uji dan inkubasikan pada suhu 370 C selama 24 jam.
3.3.2 Pada XLD agar, koloni Salmonellae berbentuk bulat dan berwarna hitam
mengkilat, sedangkan pada media BS koloni Salmonellae berwarna hitam.
3.3.3 Pilihlah tiga koloni tipikal Salmonellae dari tiap cawan dan inokulasikan
masing-masing koloni ke tabung reaksi berisi 2,5 ml larutan pepton 1% kemudian
inkubasikan pada suhu 370 C selama 4 jam atau hingga terjadi adanya kekeruhan.
3.4.1 Dengan ose steril inokulasikan suspensi dari masing-masing tabung reaksi
berisi larutan pepton ke Lysine-Decarboxylase broth (sebagai kontrol), ONPG
broth dan media agar CLED.
50 dari 82
warna menjadi kuning, pada media ONPG terjadi reaksi negatif ditunjukkan dengan
tidak adanya perubahan warna.
51 dari 82
Penghitungan jumlah sel radang
Metoda langsung
1 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metoda langsung penghitungan jumlah sel radang dalam susu
segar dengan menggunakan metoda Breed.
2 Prinsip
Untuk menetapkan jumlah sel radang dalam susu, maka dihitung jumlah sel radang
dalam 0,01 ml susu yang disebarkan di atas gelas objek hingga mencapai luas 1 cm2
dan kemudian diwarnai.
3 Pereaksi
4 Peralatan
c) Bunsen
d) Mikroskop
e) Ose siku
5 Prosedur
52 dari 82
5.1 Siapkan sebuah gelas objek yang telah dibersihkan dan bebas dari lemak,
kemudian diberi tanda yang menunjukkan asal contoh susu.
5.2 Letakkan gelas objek tersebut di atas kertas yang sudah berisi gambar kotak
seluas 1 cm2.
5.3 Pipet sejumlah 0,01 ml contoh susu dengan pipet Breed ke daerah yang
dibatasi kotak, dan dengan bantuan ose siku contoh susu tadi disebarkan sehingga
menutupi seluruh gambar kotak (luas 1 cm2).
5.7 Hitung jumlah sel radang dalam 20 lapangan pandang, kemudian dirata-
ratakan.
6 Cara Perhitungan
Diketahui pada bidang 1 cm2 disebarkan 0,01 ml susu, maka jumlah sel radang pada
luas lapang penglihatan adalah:
π r2 X 0,01 ml
100
53 dari 82
7 Hasil Uji
54 dari 82
Pengujian residu antibiotik
Pendahuluan
Pada dasarnya cara pengujian residu antibiotika dibedakan antara uji skrining dan uji
konfirmasi. Tujuan dilakukannya skrining residu antibiotika pada susu segar adalah
untuk mengetahui kemungkinan adanya residu antibiotika dalam susu secara kualitatif
atau semi kuantitatif. Dengan demikian dengan cara ini hanya dapat diketahui
ada/tidak adanya suatu residu antibiotika serta golongan dari antibiotika yang
ditemukan dari contoh susu yang diperiksa, sedangkan untuk mengetahui jenis dan
konsentrasi residu antibiotika secara pasti harus dilanjutkan dengan uji konfirmasi.
Metoda -1
1 Ruang Lingkup
Standar ini menetapkan metode untuk skrining residu antibiotika pada air susu
dengan batas kepekaan adalah antara konsentrasi 0.04 µg/ml sampai 1 µg/ml
tergantung dari jenis antibiotika, sedangkan angka perolehan kembali antara 75% -
95%.
2 Prinsip
Sampel susu dihomogenisasi. Tetesi kertas cakram dengan sampel susu, lalu
letakkan kertas cakram tersebut di atas permukaan media agar yang telah dicampur
dengan biakan bakteri uji dan diinkubasikan pada suhu 370 C selama 16-18 jam.
Contoh susu dinyatakan positif mengandung residu antibiotika bila terbentuk zone
hambatan di sekitar kertas cakram.
3 Bahan
55 dari 82
b) Larutan dapar fosfat pH 7,0 ± 0,1 dan pH 8,0 ± 0,1.
c) Kuman uji :
g) Kurva baku
4 Peralatan
d) Kertas cakram steril berdiameter 8-10 mm, silinder cakram 0,3 ml.
e) Ultra turax.
f) Sentrifus.
g) Mikro pipet.
5 Prosedur
56 dari 82
disterilisasi dengan memasukkannya ke dalam otoklaf pada suhu 1210C, 15 psi
selama 15 menit.
5.2.1 Dapar fosfat pH 7.0± 0.1: Campuran 6,4 gr kalium dihidrogen fosfat, 18,9
gr dinatrium hidrogen fosfat dalam 1.000 ml air suling, otoklaf pada suhu 1210C, 15
psi selama 15 menit
5.2.2 Dapar fosfat pH 8.0±0.1: Campuran 13,3 gr kalium dihidrogen fosfat dan
6,2 gr kalium hidroksida dalam 1.000 ml air suling, otoklaf pada suhu 1210C, 15 psi
selama 15 menit.
5.5.1 Cairkan media agar (NV-4, NV-8, MX) dengan pemanasan pada suhu
1000 C, kemudian dinginkan dan simpan dalam penangas air bersuhu 560 C.
57 dari 82
5.5.2 Inokulasikan 1% kuman uji Bacillus subtilis pada media agar NV-4,
Micrococcus luteus pada media NV-8 dan Bacillus cereus pada media MX dan
campur secara seksama sehingga kuman uji dan media dapat tercampur rata.
Tuangkan sebanyak 7 ml masing-masing kultur media tersebut ke dalam cawan petri
steril dan biarkan menjadi beku.
5.6.2 Tambahkan masing-masing larutan baku kerja dari tiap konsentrasi ke dalam
susu (hitung konsentrasi akhir dalam susu).
5.6.4 Ambil kertas cakram steril dengan pinset steril dan letakkan masing-masing 4
buah kertas cakram di atas permukaan media agar.
5.6.6 Buat kurva semilogaritmik dari rata-rata diameter zona hambatan yang
terbentuk dengan konsentrasi antibiotika. Respon point (RP) diambil darimasing-
masing antibiotika dengan zona hambatan berdiameter antara 1,2 -1,5 mm.
5.7.2 Letakkan kertas cakram steril di atas permukaan kultur media. Tiap cawan
petri kultur media berisi 4 buah kertas cakram. Dengan menggunakan pipet steril,
tetesi kertas cakram steril dengan contoh susu.
5.7.3 Inkubasikan pada suhu 37o C selama 16-18 jam. Ukur diameter zona
hambatan dengan kaliper atau jangka sorong.
58 dari 82
Sampel susu dinyatakan positif mengandung residu apabila terbentuk zona hambatan
di sekitar kertas cakram, minimal 1 mm lebih besar dari diameter kertas cakram.
Metode -2
1 Ruang lingkup
Standar ini menetapkan metoda skrining residu antibiotika dari susu segar, terutama
residu antibiotika golongan penisilin dan golongan tetrasiklin. Batas kepekaan antara
0,1 µg/ml sampai 20 µg/ml tergantung jenis antibiotika.
2 Prinsip
3 Bahan Media
a) Skim Milk: Larutkan 100 gr skim milk dalam 1.000 ml air dengan suhu
0
45-50 C, bagikan ke dalam tabung-tabung reaksi 50 ml, tutup dan otoklaf selama
20 menit pada suhu 1150 C, simpan dalam lemari pendingin hingga saat akan
digunakan.
59 dari 82
d) Media agar difusi : Larutkan masing-masing 5 gr tryptone, 2,5 gr yeast
extract dehydrated, 1 gr dextrose dan 12,18 gr agar dalam 1.000 ml air, ukur agar
pH 7,0. Otoklaf dengan suhu 1210 C selama 15 menit.
2) Larutan baku penisilin dalam air susu: Encerkan stok baku penisilin dengan
air susu sampai konsentrasi 0.006 µg/ml, setara dengan 0,01 IU/ml.
4 Peralatan
c) Glass beads 5 mm
d) Inkubator 37-65 oC
g) Otoklaf
i) Wire-loop
l) Vortex - mixer
5 Prosedur
60 dari 82
5.1.1 Aktivasi ulang biakan (Reactivation culture).
Dengan menggunakan wire loop, tambahkan biakan dalam bentuk freeze dried ke
dalam 3 tabung nutrient broth yang masing-masing berisi 10 ml, inkubasikan pada
suhu 550 C selama 16 jam.
Inokulasikan biakan yang telah diaktivasi ulang tadi ke atas permukaan media,
inkubasikan pada suhu 550 C selama 48 jam. Simpan di lemari pendingin (0 - 50 C).
5.2.1 Inokulasikan biakan uji ke dalam 5 bagian media agar pada suhu 550 C.
Pindahkan 6 ml media agar ke dalam cawan petri, dinginkan.
5.2.2 Persiapan kultur media agar dilakukan pada hari akan dilakukan uji.
5.3.2 Celupkan kertas cakram ke dalam contoh susu, letakkan di atas permukaan
media agar. Inkubasikan pada suhu 550 C selama 2 jam 30 menit, amati zona
hambatan yang terbentuk.
5.3.3 Proses yang sama lakukan terhadap kontrol negatif dan kontrol posistif (Air
susu standar tidak dipanaskan ).
5.4 Penetapan
Diameter zona hambatan yang terbentuk tidak boleh kurang dari 12 mm untuk
konsentrasi 0.01 IU/ml.
61 dari 82
6 Cara menyatakan hasil
Contoh susu dinyatakan positif mengandung residu, bila rata-rata diameter zona
hambatan tidak kurang dari 12 mm.
Metoda -3
1 Ruang lingkup
2 Prinsip
3 Pereaksi
c) Fenolftalein.
d) Piridin, fluoresamina.
62 dari 82
g) Larutan dapar pH 8,3 : Larutkan 19 gr asam borat dan 19,75 gr kalium
klorida dalam 800 ml air. Tepatkan pH dengan larutan natrium hidroksida pekat dan
himpitkan hingga volume 1.000 ml.
i) Gas nitrogen.
4) Larutan baku kerja nitrofuran : Buat seri pengenceran dengan metanol dari
larutan stok baku hingga konsentrasi 0,5 ug/ml.
Catatan: Golongan nitrofuran sangat sensitif terhadap sinar, sehingga harus dihindari
kontak langsung dengan sinar. Oleh karena itu semua larutan baku harus
dipersiapkan dalam botol berwarna coklat. Seandainya dipergunakan botol
berwarna putih, maka botol itu harus dibungkus dengan alumunium foil.
63 dari 82
4 Peralatan
g) Sentrifus berpendingin.
i) Oven.
j) Vortex-mixer.
5 Prosedur
5.1.2 Tambah 0,25 ml etil asetat, campur selama 1 menit diatas vortex / mixer.
Tambah secara perlahan-lahan 1,75 ml etil asetat, sonikasi selama 10 menit.
5.1.3 Sentrifus 3500 rpm selama 10 menit, buang sedimen dan tambahkan 15 ml
heksana pada fase etil asetat. Sentrifuse 3500 rpm selama 10 menit. pindahkan fase
etil asetat ke dalam tabung 5 ml dan buang sedimen.
5.1.4 Alirkan fasa etil asetat-heksana kedalam Catridge Seppak Sil. Cuci
cartridge dengan 2 ml campuran etil asetat dan heksana (3:1). Cuci kembali dengan
2 ml campuran 95 bagian asetonitril dan 5 bagian metanol.
5.1.5 Elusi cartridge dengan 2 ml campuran aseton dan heksana (2:1). Tampung
eluat pada labu pemekat (labu evaporator)
5.2 Penetapan
64 dari 82
Totolkan 10 µl ekstraks dengan syringe pada KLT. Teteskan juga setiap larutan
baku kerja pada lempeng yang sama. Keringkan pada suhu kamar. Masukkan ke
dalam larutan pengembang dalam bejana kromatograf yang telah dipersiapkan
sebelumnya. Biarkan larutan pengembang naik hingga sekitar 2 cm dari sisi atas
lempeng. Keringkan lempeng pada suhu kamar.
Semprot lempeng dengan piridin, amati di bawah lampu UV 366 nm. Adanya
nitrofuran akan terlihat sebagai bercak atau noda berwarna kuning dengan latar
belakang warna ungu. Pada konsentrasi rendah, noda akan terlihat berwarna biru.
Bandingkan dengan noda dari larutan baku kerja. Waktu tambat (retention
time/RF) dari golongan nitrofuran sekitar 0,2.
6.2.1 Masukkan lempeng tersebut di atas ke dalam oven selama 10 menit untuk
menghilangkan piridin, lalu dinginkan.
6.2.2 Setelah itu semprot dengan larutan stannum klorida hingga lempeng berwarna
abu-abu. Biarkan 15 menit dalam ruang gelap, kemudian masukkan ke dalam oven
selama 15 menit pada suhu 1100C, dinginkan.
6.2.3 Secara hati-hati semprot dengan larutan natrium hidroksida hingga lempeng
berwarna sedikit merah muda.
6.2.4 Semprot dengan larutan dapar borat hingga lempeng sedikit keabu-abuan.
Keringkan dalam oven, dinginkan.
Pendahuluan
65 dari 82
Identifikasi dan kuantifikasi residu antibiotika dilakukan untuk mengetahui adanya
residu secara kualitatif maupun kuantitatif. Secara kualitatif dapat mengetahui jenis
residu antibiotika dan secara kuantitatif dapat diketahui tingkat kandungan
(konsentrasi) residu antibiotika dengan menggunakan standar pembanding.
A Residu Khloramfenikol
1 Ruang lingkup
Metode ini digunakan untuk identifikasi dan kuantifikasi residu kloramfenikol dalam
air susu dengan batas kepekaan 0,01 mg/kg.
2 Prinsip
3 Pereaksi
a) Asam asetat 0,2 M: larutkan 11,5 ml asam asetat glasial dalam 1 liter air.
e). Eluen untuk kolom silika : campuran khloroform dan metanol (9:1).
g) Larutan baku kerja: buat seri pengenceran larutan stok baku sampai
konsentrasi 1 µg/ml.
66 dari 82
4 Peralatan
c) Homogeniser
g) Labu pisah.
5 Prosedur
5.1.1 Timbang 10 gram cuplikan, masukan ke dalam tabung sentrifus 100 ml,
tambah 100 ml etil asetat dan homogenisasi. Sentrifus 300 rpm selama 10 menit.
5.1.3 Keringkan dan larutkan ekstraks dengan 50 ml larutan asam asetat 0,2 M
Pindahkan ke dalam labu pisah 300 ml. Ekstraksi dengan 100 ml n-heksana. Buang
lapisan n-heksana.
5.1.5 Keringkan dengan rotavapor di atas penangas air, larutkan ekstraks dalam
0,5 ml fase gerak dan saring.
5.2 Penetapan
67 dari 82
5.2.1 Suntikkan 50 µl ke dalam KCKT yang dilengkapi dengan kolom analitik C-
18, menggunakan fase gerak campuran asetonitril dan air (3:7), laju aliran 1
ml/menit, detektor UV 270 nm.
5.2.2 Amati waktu tambat dan puncak atau area kromatogram cuplikan dan
larutan baku.
6.2.1 Dengan membandingkan tinggi puncak atau luas area di bawah puncak dari
larutan ekstrak cuplikan dengan larutan baku standar.
b) Buat kurva kalibrasi atau persamaan linear dari tinggi puncak atau luas area
di bawah puncak terhadap konsentrasi pada kertas semilogaritma.
c) Hitung konsentrasi cuplikan dari tinggi puncak cuplikan atau luas area di
bawah puncak ke dalam kurva kalibrasi atau persamaan yang diperoleh.
Catatan :
Tinggi puncak atau luas area di bawah puncak dalam kromatogram dapat diukur
secara otomatis dengan mempergunakan integrator/komputer atau secara manual.
1 Ruang lingkup
68 dari 82
Standar ini menetapkan metoda untuk identifikasi dan kuantifikasi residu tetrasiklin
dalam susu dengan batas kepekaan 0,01 - 0,05 mg/kg.
2 Prinsip
Cuplikan diekstraksi, dipisahkan dari lemak, protein dan air. Ekstrak yang diperoleh
dianalisa menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dengan UV
detektor pada panjang gelombang 350 nm.
3 Pereaksi
b) Asetonitril
c) Hexana
d) Etylacetat
h) Larutan baku kerja: buat seri pengenceran larutan stok baku hingga
konsentrasi 10 µg/ml
i) Fase gerak untuk KCKT yaitu campuran metanol, asetonitril dan asam
oksalat 0,02 M (1:1:8)
4 Peralatan
69 dari 82
d) Kromatograf Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dengan kolom U Bondapak,
detektor UV
e) Corong
g) Sentrifuse
5 Prosedur
5.1.4 Masukkan filtrat ke dalam labu erlenmeyer 250 ml, tambahkan 15 ml hexana
dan kocok. Buanglah lapisan hexana dan ambillah lapisan air. Lakukan penambahan
hexana sebanyak 2 kali.
5.1.5 Tambahkan 20 ml etilasetat pada lapisan air lalu kocok. Buang lapisan air
dan kumpulkan lapisan etilasetat. Lakukan penambahan etilasetat sebanyak 2 kali.
5.1.6 Tambahkan natrium sulfat anhydrat pada lapisan etilasetat, kemudian saring
dengan kertas saring.
5.1.8 Sentrifus pada kecepatan tinggi (10.000 rpm). Pisahkan larutan yang jernih
dari kotoran.
5.2 Penetapan
70 dari 82
5.2.2 Amati waktu tambat dan puncak atau area kromatogram cuplikan dan
larutan baku.
1 Ruang lingkup
Standar ini menetapkan metoda untuk identifikasi dan kuantifikasi residu penisilin
dalam susu dengan batas kepekaan 0,01 - 0,05 mg/kg.
2 Prinsip
Cuplikan diekstraksi, dipisahkan dari lemak, protein dan air. Ekstrak yang diperoleh
dianalisa menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) dengan UV
detektor pada panjang gelombang 350 nm.
3 Pereaksi
b) Acetonitril
c) NaCl
d) Dichlorometana (CH2Cl2)
71 dari 82
e) Fase gerak untuk KCKT yaitu: KH2PO4 0.01M : Metanol : CH3CN
(50:20:30)
4 Peralatan
d) Corong
e) Glasswool
g) Rotavapor
5 Prosedur
5.7 Kumpulkan fase CH2Cl2 ke dalam labu florentine, kemudian uapkan dengan
rotavapor hingga hampir kering.
72 dari 82
73 dari 82
Uji kebersihan
1 Ruang lingkup
2 Prinsip
Kotoran dan benda asing yang terdapat di dalam susu akan tertinggal di kertas saring
atau saringan yang akan tampak dengan mata telanjang.
3 Perekasi
Tidak diperlukan.
4 Peralatan
b) Labu erlenmeyer.
5 Prosedur
Catatan: untuk pengujian ini diperlukan minimal 500 ml susu dan jumlah ini harus
seragam dalam satu seri pemeriksaaan.
5.1 Atur posisi “botol susu” dengan bagian leher yang dilengkapi kapas
penyaring berada di bawah. Letakkan corong pada dasar botol susu.
74 dari 82
5.2 Tuangkan contoh susu ke dalam “botol susu” secara perlahan-lahan melalui
dinding dengan bantuan corong dan hasil penyaringan tersebut ditampung dalam labu
erlenmeyer.
5.3 Setelah semua susu melalui saringan, saringan diambil dan dikeringkan di
udara atau diinkubasikan kemudian dibandingkan dengan kapas penyaring khusus
yang belum dipakai.
6 Hasil uji
Hasil positif ditunjukkan dengan adanya kotoran yang tersangkut dalam saringan,
dan dapat berupa bulu sapi, rumput, sisa makanan, tinja dan lain-lain.
75 dari 82
Uji pemalsuan
1.2 Prinsip
1.3 Pereaksi
1.4 Peralatan
Tabung reaksi
1.5 Prosedur
1.5.2 Tambahkan 1-4 tetes larutan H2O2 (0,2 - 1 %) dan amati terjadinya
perubahan warna.
76 dari 82
1.6 Hasil uji
Hasil uji dinyatakan dengan hasil positif atau negatif. Hasil positif ditunjukkan dengan
terbentuknya warna biru.
2.2 Prinsip
Uji ini digunakan untuk membuktikan adanya sakarosa. Gula akan terhidrolisa oleh
HCl pekat menjadi 4-hidroksi metil furfural. Furfural dan turunannya akan bereaksi
dengan resorsin membentuk warna merah jambu.
2.3 Pereaksi
a). Resorsin
2.4 Peralatan
a) Cawan porselin
b) Pengaduk kaca
77 dari 82
2.5 Prosedur
2.5.3 Panaskan campuran tersebut sampai mendidih di atas bunsen dengan dialasi
asbes sambil terus diaduk dengan pengaduk gelas.
2.5.4 Angkat cawan porselin dari pemanas dan tunggu selama 5 menit.
Hasil uji dinyatakan dengan hasil positif atau negatif. Hasil positif ditunjukkan dengan
terbentuknya warna merah jambu.
3.2 Prinsip
Dengan penambahan larutan lugol, adanya pati/amilum di dalam contoh susu akan
dibuktikan dengan terbentuknya warna biru.
3.3 Pereaksi
78 dari 82
b) Larutan lugol.
3.4 Peralatan
a) Tabung reaksi
b) Corong
c) Kertas saring
d) Pipet 1 ml, 10 ml
e) Bunsen.
3.5 Prosedur
Hasil uji dinyatakan dengan hasil positif atau negatif. Hasil positif ditunjukkan dengan
terbentuknya warna biru.
4.1.1 Pereaksi
79 dari 82
Cara membuat: campurkan 100 ml HCl (BJ = 1.124 - 1.126 g/ml pada suhu 200C)
dengan 0,2 ml larutan FeCl3 10%.
4.1.2 Peralatan
a) Tabung reaksi
b) Penangas air
c) Pipet.
4.1.3 Prosedur
c) Biarkan mendidih selama 1 menit dan amati perubahan warna yang terjadi.
Hasil uji dinyatakan dengan hasil positif atau negatif. Hasil positif ditunjukkan dengan
terbentuknya warna ungu.
Metoda 01
4.2.1 Pereaksi
Cara membuat : larutkan 2 gram titandioksida dalam 100 ml asam sulfat yang
diperoleh dari pengenceran asam sulfat pekat dengan aquades (1:3).
80 dari 82
4.2.2 Peralatan
b) Tabung reaksi.
4.2.3 Prosedur
Hasil uji positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna kuning hingga merah jingga.
Metoda 02
4.2.1 Pereaksi
c) Larutan formalin.
4.2.2 Peralatan
a) Pipet tetes
b) Tabung reaksi.
c) Penangas air.
4.2.3 Prosedur
a) Masukkan contoh susu dan asam sulfat pekat dengan perbandingan yang
sama ke dalam tabung reaksi.
81 dari 82
b) Tambahkan 1 tetes larutan formalin encer, kocok dan hangatkan pada suhu
600C.
Hasil uji positif ditunjukkan dengan terbentuknya warna biru keunguan atau biru
pada kertas Jodkalium.
4.3 Sublimat
4.3.1 Pereaksi
Amoniak
4.3.2 Peralatan
Labu erlenmeyer
4.3.3 Prosedur
Hasil uji dinyatakan dalam hasil positif atau negatif. Hasil uji positif ditunjukkan
dengan terbentuknya warna abu-abu.
82 dari 82
5 Uji residu desinfektan dalam susu
Standar ini menetapkan metoda pengujian dengan cara biologis adanya residu
quartenarium amonium sulfat (QAS) pada susu segar dengan metoda Kluyver.
5.1.2 Prinsip
5.1.3 Bahan
a) Glukosa
5.1.4 Peralatan
a) Tabung reaksi
b) Inkubator
5.1.3 Prosedur
83 dari 82
a) Tambahkan 2-2,5% glukosa ke dalam contoh susu.
84 dari 82
Uji peroksidase dengan metoda Storch
1 Ruang lingkup
Standar ini menetapkan metoda pengujian enzim peroksidase yang terdapat dalam
susu segar untuk mengetahui adanya indikasi susu telah mengalami pemanasan atau
terjadi penambahan susu yang telah dipanaskan di atas 800C.
2 Prinsip
Enzim peroksidase yang terdapat dalam susu segar/mentah akan terurai dan menjadi
tidak aktif apabila susu tersebut dipanaskan pada suhu 70 - 800C. Enzim akan
membebaskan oksigen dari larutan H2O2 yang akan dibubuhkan ke dalam susu.
Oksigen akan bereaksi dengan zat pemulas dan menyebabkan perubahan warna.
3 Pereaksi
4 Peralatan
Tabung reaksi.
5 Prosedur
85 dari 82
6 Hasil Uji
Hasil uji dinyatakan dengan hasil positif atau negatif. Hasil positif ditunjukkan dengan
terbentuknya warna biru. Sedangkan hasil negatif apabila susu tetap berwarna putih,
menunjukkan adanya indikasi susu telah mengalami pemanasan atau dicampur
dengan susu yang telah dipanaskan di atas suhu 800C.
86 dari 82
Daftar isi
Halaman
Pendahuluan
Daftar isi i
Judul 1
Uji alkohol 21
Uji katalase 23
Uji reduktase 30
Uji sedimen 35
i
01 - Penentuan angka lempeng total pada 350 C 37
04 - Pengujian Salmonellae 48
Metoda langsung 51
Metoda - 1 53
Metoda - 2 57
Metoda - 3 60
A Residu Khloramfenikol 64
C Residu Peniciline 69
Uji kebersihan 71
Uji pemalsuan 73
ii