Isolasi Bahan Alam

YURI PRATIWI UTAMI

 Bahan Alam
Bahan alami yang berasal dari tumbuhan
hewan dan mineral disebut bahan alam.
Banyak bahan alam yang berguna seperti
untuk pewarna, pemanis, pengawet, bahan
obat dan pewangi. Kegunaan dari bahan
alam tersebut mendorong para ahli untuk
mengisolasi dan mempelajari bahan alam
tersebut.
 Bahan alam yang beraneka ragam itu,
pada umumnya dikelompokkan
berdasarkan kesamaan strukturnya atau
jalur biosintesisnya. Beberapa kelompok
bahan alam ialah lipid, protein,
karbohidrat, alkaloid, flavonoid, terpenoid
dan sebagainya.
Target Isolasi
Bahan Alam
 Metode Isolasi
• Pada dasarnya isolasi senyawa kimia dari bahan alam
adalah sebuah usaha bagaimana caranya memisahkan
senyawa yang bercampur sehingga kita dapat
menghasilkan senyawa tunggal yang murni.
• Tumbuhan mengandung ribuan senyawa yang
dikategorikan sebagai metabolit primer dan metabolit
sekunder. Biasanya proses isolasi senyawa dari bahan
alami ini mentargetkan untuk mengisolasi senyawa
metabolit sekunder, karena senyawa metabolit sekunder
diyakini dan telah diteliti dapat memberikan manfaat bagi
kehidupan manusia. Antara lain manfaatnya dalam bidang
kesehatan.
 Metode Isolasi
• Suatu ekstrak yang telah dihasilkan dari
suatu protokol ekstraksi yang sesuai dan
pengujian aktivitas biologi telah dilakukan
dalam bioassay, langkah selanjutnya
adalah fraksinasi ekstrak menggunakan
metode pemisahan sehingga komponen
biologi aktif dapat diisolasi (Heinrich.et.al.,
2004)
 Isolasi
• Isolasi adalah suatu usaha bagaimana
caranya memisahkan senyawa yang
bercampur sehingga kita dapat
menghasilkan senyawa tunggal yang
murni.
• Biasanya proses isolasi senyawa dari
bahan alami mengisolasi senyawa
metabolite sekunder, karena dapat
memberikan manfaat bagi kehidupan
manusia.
• Kandungan senyawa dari tumbuhan untuk
isolasi dapat diarahkan pada suatu
seyawa yang lebih dominan dan salah
satu usaha isolasi senyawa tertentu maka
dapat dimanfaatkan pemilihan pelarut
organik yang akan digunakan untuk pada
isolasi tersebut.
• Dimana pelarut polar akan lebih mudah
melarutkan senyawa polar dan sebaliknya
senyawa non polar akan melarutkan
senyawa non polar (Harborne, 1987).
Isolasi bahan alam dilakukan berdasarkan sifat bahan
alam tersebut, dan dapat digolongkan menjadi :

Isolasi Secara Fisis

Isolasi Bahan Alam

Isolasi Secara
Kimia
 Teknik Pemisahan
Teknik pemisahan memiliki tujuan untuk
memisahkan komponen yang akan ditentukan berada
dalam keadaan murni, tidak tercampur dengan
komponenkomponen lainnya. Ada 2 jenis teknik
pemisahan:
1. Pemisahan kimia adalah suatu teknik pemisahan yang
berdasarkan adanya perbedaan yang besar dari sifat-
sifat fisika komponen dalam campuran yang akan
dipisahkan.
2. Pemisahan fisika adalah suatu teknik pemisahan yang
didasarkan pada perbedaan-perbedaan kecil dari sifat-
sifat fisik antara senyawa-senyawa yang termasuk
dalam satu golongan (Muldja, 1995).
 Isolasi Cara Fisis
• Isolasi cara ini berdasarkan sifat fisik bahan alam,
seperti kelarutan dan tekanan uap. Isolasi berdasarkan
perbedaan kelarutan bahan alam dalam pelarut tertentu
dapat dilakukan dengan pelarut dingin (metode dingin)
atau pelarut panas (metode panas).
• Isolasi dengan pelarut dingin digunakan untuk
mengisolasi bahan alam yang dapat larut dalam
keadaan dingin. Tekniknya dapat dilakukan dengan
merendam sumber bahan alamnya dalam pelarut
tertentu selama beberapa lama (jam atau hari). Untuk
bahan alam yang larut dalam keadaan panas digunakan
teknik isolasi secara kontinyu dengan alat Soxhlet.
• Isolasi berdasarkan penurunan tekanan
uap dilakukan dengan cara destilasi uap.
Cara ini digunakan untuk senyawa yang
tidak larut dalarn air, bertitik didih tinggi,
mudah terurai sebelum titik didihnya dan
mudah menguap.
 Isolasi Cara Kimia
• Isolasi cara ini berdasarkan sifat kimia
atau kereaktifan bahan alam terhadap
pereaksi tertentu. Bahan alam diisolasi
melalui reaksi kimia dan dipisahkan dari
senyawa lain yang tidak bereaksi.
PELUANG PENELITIAN
ISOLASI BAHAN ALAM
Beberapa penemuan obat
dari senyawa alam
 Beberapa penemuan obat
dari senyawa alam

Taxol is an extensively decorated terpenoid, while

Phorbol is less so (hydroxylations).(Core terpenoid of
Taxol is in yellow/bold).
Metode Isolasi Bahan Alam
Ekstraksi

Skrining Fitokimia

Partisi/Fraksinasi

Kromatografi

Pemurnian

Identifikasi Isolat
 Ekstraksi
• Sampel yang berasal dari tanaman
setelah diidentifikasi, kemudian
digolongkan menjadi spesies dan famili,
sampel kemudian dikumpulkan dari bagian
arialnya (daun, batang, kulit kayu pada
batang, kulit batang, dan akar).
• Sampel ini kemudian dikeringkan dengan
cara diangin-anginkan untuk menghindari
penguraian komponen oleh udara atau
mikroba.
• Jika telah dikeringkan, biomassa kemudian
digiling menjadi partikel-partikel kecil
menggunakan blender atau penggilingan.
Proses penggilingan ini penting karena ektraksi
efektif pada partikel kecil, dikarenakan memiliki
luas permukaan yang lebih besar.
• Pemilihan pelarut ekstraksi sangat penting. Jika
tanaman diteliti dari sudut pandang etnobotani,
ektraksi harus mengikuti pemakaiannya secara
tradisional. Kegagalan mengekstraksi biomassa
dapat menyebabkan kehilangan akses untuk
mendapatkan zat aktif.
• Terdapat sejumlah metode ekstraksi, yang paling
sederhana adalah ekstraksi dingin (dalam labu besar
berisi biomassa), dengan cara ini bahan kering hasil
gilingan diekstraksi pada suhu kamar secara berturut-
turut dengan pelarut yang kepolarannya makin tinggi.
Keuntungan utama cara ini adalah merupakan metode
ekstraksi yang mudah karena ekstrak tidak dipanaskan
sehingga kemungkinan kecil bahan alam terurai.
• Penggunaan pelarut dengan peningkatan kepolaran
secara berurutan memungkinkan pemisahan bahan
alam berdasarkan kelarutannya (dan polaritasnya)
dalam ektraksi. Hal ini sangat mempermudah proses
isolasi. Ekstraksi dingin memungkinkan banyak senyawa
terekstraksi, meskipun beberapa senyawa memiliki
kelarutan terbatas dalam pelarut ekstraksi pada suhu
kamar (Heinrich et al, 2009).
• Ekstraksi dianggap selesai bila tetesan
terakhir memberikan reaksi negatif
terhadap senyawa yang diekstraksi. Untuk
mendapatkan larutan ekstrak pekat,
biasanya pelarut ekstrak diuapkan dengan
menggunakan alat rotari evaporator
(Harborne, 1996).

Ekstraksi
 Ekstraksi

Metode Dingin

Ekstraksi Metode Panas

Destilasi
 Partisi
• Metode pemisahan yang mungkin paling sederhana adalah partisi,
yang banyak digunakan sebagai tahap awal pemurnian ekstrak.
• Partisi menggunakan dua pelarut tak bercampur yang ditambahkan
kedalam ekstrak tersebut, hal ini dapat dilakukan secara terus
menerus dengan menggunakan dua pelarut yang tak bercampur
yang kepolarannya meningkat.
• Partisi biasanya dilakukan melalui dua tahap:
1. Air/petroleum eter ringan (heksana) untuk
menghasilkan fraksi nonpolar di lapisan
organik.
2. Air/diklorometan atau air/kloroform atau
air/etil asetat untuk membuat fraksi agak
polar di lapisan organik. Ini merupakan
metode pemisahan yang mudah dan
mengandalkan kelarutan bahan alam dan
bukan interaksi fisik dengan medium lain
(Heinrich et al, 2009).
 Partisi/Fraksinasi

Ekstraksi Cair-Cair
(ECC)
Metode
Partisi/Fraksinasi
Ekstraksi Cair-
Padat
(ECP)
 Kromatografi
• Kromatografi pertama kali dikembangkan oleh
seorang ahli botani Rusia Michael Tswett pada
tahun 1903 untuk memisahkan pigmen berwarna
dalam tanaman dengan cara perkolasi ekstrak
petroleum eter dalam kolom gelas yang berisi
kalsium karbonat (CaCO3).
• Kromatografi merupakan suatu teknik pemisahan
yang menggunakan fase diam (stationary phase)
dan fase gerak (mobile phase). Teknik
kromatografi telah berkembang dan telah
digunakan untuk memisahkan dan
mengkuantifikasi berbagai macam komponen
yang kompleks, baik komponen organik maupun
komponen anorganik.
• Kromatografi dapat dibedakan atas berbagai macam
tergantung pada pengelompokkannya. Berdasarkan
pada mekanisme pemisahannya,
• kromatografi dibedakan menjadi: kromatografi
adsorbsi, kromatografi partisi, kromatografi pasangan
ion, kromatografi penukar ion, kromatografi eksklusi
ukuran.
• Berdasarkan pada alat yang digunakan, kromatografi
dapat dibagi atas: kromatografi kertas, kromatografi
lapis tipis (disebut juga kromatografi planar),
kromatografi cair kinerja tinggi, dan kromatogtrafi gas.
• Bentuk kromatografi yang paling awal adalah
kromatografi kolom yang digunakan untuk pemisahan
sampel dalam jumlah yang besar.
• Pemisahan pada kromatografi planar pada umumnya dihentikan sebelum
semua fase gerak melewati seluruh permukaan fase diam. Solut pada
kedua kromatografi ini dikarakterisasi dengan jarak migrasi solut terhadap
jarak ujung fase geraknya. Nilai faktor retardasi solut (Rf) dapat dihitung
dengan menggunakan perbandingan dalam persamaan:

• Nilai maksimum Rf adalah 1 dan ini dicapai ketika solut mempunyai

perbandingan distribusi (D) dan faktor retensi sama dengan 0 yang berarti
solut bermigrasi dengan kecepatan yang sama dengan fase gerak. Nilai
minimum Rf adalah 0 dan ini teramati jika solut tertahan pada posisi titik
awal di permukaan fase diam.
 Kromatografi Lapis Tipis
• Dalam kromatografi lapis tipis (KLT), adsorben diletakkan tepat
pada satu sisi plat atau kaca atau saluran plastik ataupun
aluminium. Adsorben yang paling sering digunakan adalah
silika gel dan alumina.
• Beberapa mikroliter larutan sampel yang akan dianalisa
ditotolkan pada plat sebagai titik kecil yang tunggal dengan
menggunakan pipa mikrokapilaritas.
• Plat dikembangkan dengan meletakkannya didalam botol
ataupun chamber pengembang yang berisi sejumlah kecil
pelarut. Pelarut akan menaiki plat dengan adanya gaya kapilar,
dan membawa senyawa dari sampel dengan itu. Senyawa
yang berbeda dipisahkan dari dasarnya pada saat interaksi
mereka dengan lapisan adsorben.
• Plat KLT yang biasa digunakan adalah plat dengan
ukuran pori silika 60 Å dan ketebalan lapisan 25 µm
dalam penyangga poliester atau aluminium, beberapa
dengan menggunakan atau tanpa menggunakan
indikator fluorosensi yang sesuai untuk analisa cepat
dari ekstrak kasar tanaman dan digunakan sebagai
dasar dari langkah preparatif.
• Plat biasa dapat digunting dengan menggunakan
gunting atau kertas cutter untuk mengambil ukuran yang
diinginkan. Deteksi noda yang dihasilkan dapat
menggunakan lampu ultraviolet ataupun dengan
menyemprot dengan menggunakan reagen yang sesuai
(Cseke et al, 2006).

KLT
 KROMATOGRAFI KOLOM
• Kolom kromatografi atau tabung untuk pengaliran karena gaya
tarik bumi (gravitasi) atau sistem bertekanan rendah biasanya
terbuat dari kaca yang dilengkapi keran jenis tertentu pada
bagian bawahnya untuk mengatur aliran pelarut.
• Ukuran keseluruhan kolom sungguh beragam, tetapi biasanya
panjangnya sekurang-kurangnya 10 kali garis tengah dalamnya
dan mungkin saja sampai 100 kalinya.
• Ukuran kolom dan banyaknya penjerap yang dipakai ditentukan
oleh bobot campuran sampel yang akan dipisahkan. Untuk
pemisahan normal, bobot sampel biasanya 30:1 ternyata
memadai jika pemisahan tidak terlalu sukar.
• Ukuran partikel penjerap pada kolom biasanya lebih besar
daripada untuk KLT. Walau pun banyak jenis penjerap telah
dipakai untuk kolom, alumina dan silika gel adalah penjerap
yang paling berguna dan mudah didapat.
KROMATOGRAFI KOLOM
• Fraksi kolom yang mengandung
senyawa yang sama (diperiksa
dengan KLT) atau tampaknya
berasal dari satu puncak (memakai
pendeteksian sinambung)
digabungkan, dan pelarutnya
diuapkan, lebih baik dengan
tekanan rendah. Jika pelarut dan
penjerap murni. Maka fraksi-fraksi
pun murni (Gritter dkk, 1991).
Kromatografi
 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
• Sebagian besar pemakaian kromatografi lapis tipis preparatif
hanya dalam jumlah miligram. Kromatografi lapis tipis preparatif
bersama-sama dengan kromatografi kolom terbuka, dijumpai
sebagian besar dalam isolasi bahan alam.
• Penjerap yang paling umum digunakan adalah silika gel dan
dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil maupun
campuran senyawa hidrofil. Ukuran partikel dan porinya kurang
lebih sama dengan ukuran tingkat KLT.
• Cuplikan sebanyak 10-100 mg dapat dipisahkan pada lapisan
silika gel atau aluminium oksida 20 x 20 cm yang tebalnya
1 mm. Pengembangan plat KLTP biasanya dilakukan dalam
bejana kaca yang dapat menampung beberapa plat. Bejana
dijaga tetap jenuh dengan pelarut pengembang dengan
bantuan sehelai kertas saring yang tercelup ke dalam
pengembang.
• Kebanyakan penjerap KLTP mengandung indikator
fluorosensi yang membantu mendeteksi kedudukan pita
yang terpisah sepanjang senyawa yang dipisahkan
menyerap sinar UV.
• Pita yang kedudukannya telah diketahui dikerok dari plat
dengan spatula atau pengerok berbentuk tabung.
Senyawa harus diekstraksi dari penjerap dengan pelarut
yang paling kurang polar yang mungkin (sekitar 5 ml
pelarut untuk 1 g penjerap).
• Harus diperhatikan bahwa semakin lama senyawa
berkontak dengan penjerap makin besar kemungkinan
penguraian (Hostettmann dkk, 1995).

Kromatografi Lapis
Tipis Preparatif
Motede Isolasi Bahan Alam
 Tahapan proses
pemanfaatan tumbuhan obat
Cara Isolasi Bahan Alam
Cara Isolasi
Bahan Alam
Kromatogram Hasil Pemisahan Senyawa Alam
Secara Kromatografi
ISOLASI SENYAWA ALKALOID DARI DAUN
ALPUKAT (PERSEA AMERICANA MILL)
 ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengetahui adanya
senyawa alkaloid yang terkandung dalam daun alpukat (Persea
Americana Mill). Metode penelitian yang digunakan adalah isolasi
senyawa untuk memperoleh isolate murni. Dari 400 gr daun alpukat
dimaserasi dengan pelarut metanol menghasilkan ekstrak metanol
53,41 gr. Hasil kromatografi kolom I menghasilkan 17 fraksi, fraksi
N12 dipilih untuk dipisahkan kembali dengan menggunakan
kromatografi kolom II. Hasil Kromatografi kolom II dari fraksi N12
diperoleh isolate murni fraksi 7. Isolat fraksi 7 di uji kemurnian
dengan menggunakan kromatografi lapis tipis dengan variasi eluen
menghasilkan pola noda tunggal, sehingga dapat dilanjutkan
dengan uji fitokimia isolat.
 PENDAHULUAN
• Tanaman alpukat (Persea americana Mill) merupakan
salah satu tanaman yang memiliki manfaat sebagai obat
tradisional. Hampir semua bagian dari tanaman ini
memiliki khasiat sebagai sumber obat-obatan. Bagian
buah famili Lauraceae ini memiliki kandungan gizi yang
tinggi, bagian daun digunakan untuk ramuan obat
penyakit ginjal, hipertensi. Daun merupakan bagian
tanaman alpukat yang memiliki manfaat sebagai obat
tradisional. Berdasarkan penelitian, daun Persea
americana Mill memiliki aktifitas antioksidan dan
membantu dalam mencegah atau memperlambat
kemajuan berbagai oksidatif stres yang berhubungan
dengan penyakit (Owalabi dkk, 2010)
 METODE KERJA
• Pada tahap ekstraksi sampel berupa serbuk halus daun alpukat
diekstraksi dengan cara maserasi menggunakan pelarut metanol.
Tahap Maserasi dilakukan selama 4 x 24 jam, setiap 24 jam
dilakukan penyaringan dan dimaserasi kembali dengan memakai
metanol yang baru. Maserat yang diperoleh disatukan dan
dievaporasi pada suhu 30-400C dengan menggunakan alat
penguap vakum dan diperoleh ekstrak kental metanol.
• Tahap selanjutnya, ekstrak kental metanol disuspensi dengan
metanol-air dan dipartisi dengan pelarut n-heksan, diperoleh fraksi
n-heksan dan fraksi air. Fraksi n-heksan dievaporasi menghasilkan
ekstrak n-heksan. Fraksi air dipartisi dengan pelarut etil asetat
diperoleh fraksi air dan fraksi etil asetat. Hasil Partisi dari fraksi
fraksi dievaporasi pada suhu 30-40C sampai diperoleh ekstrak air
dan ekstrak etil asetat. Masing-masing ekstrak diuji fitokimia.
Skrining Fitokimia
Alkaloid

Flavanoid

Skrining Saponin

Steroid

Terpenoid
 Pemisahan & Pemurnian
• Ekstrak metanol yang akan dipisahkan terlebih dahulu dianalisis
dengan kromatografi lapis tipis (KLT) untuk mencari eluen yang
sesuai sebagai fasa gerak pada pemisahan kromatografi kolom.
• Selanjutnya ekstrak metanol sebanyak 4 gr di pisahkan dengan
kromatografi kolom dengan fase diam silika gel GF60 dan dielusi
berturut-turut menggunakan pelarut organik seperti n-heksan,
methanol, etil asetat dengan perbandingan tertentu.
• Fraksi-fraksi yang diperoleh dari tahapan kromatografi kolom
dilakukan proses kromatografi lapis tipis kembali untuk
mengabungkan fraksi-fraksi yang sama harga Rf-nya. Pola noda
akan terbentuk pada setiap fraksi. Jika isolat tetap menunjukan pola
noda tunggal, maka isolat telah murni.
Sekian & Terima Kasih