VALIDASI METODE ANALISIS HORMON PERTUMBUHAN

TANAMAN DALAM MEDIA KULTUR IN VITRO DENGAN

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

SKRIPSI

LILYANA RIZKI

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
2021 M / 1442 H
 VALIDASI METODE ANALISIS HORMON PERTUMBUHAN
TANAMAN DALAM MEDIA KULTUR IN VITRO DENGAN
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains

Program Studi Kimia
Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

Oleh:
LILYANA RIZKI
11140960000005

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
2021 M / 1442 H
 VALIDASI METODE ANALISIS HORMON PERTUMBUHAN
TANAMAN DALAM MEDIA KULTUR IN VITRO DENGAN
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains

Program Studi Kimia
Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

Oleh:
LILYANA RIZKI
11140960000005

Menyetujui,

Pembimbing I Pembimbing II

Nurhasni, M.Si Nurlaila, M.Si

NIP. 19740618 200501 2 005 NIP.19740704 199612 2 001

Mengetahui,

Ketua Program Studi Kimia

Dr. La Ode Sumarlin, M.Si

NIP.19750918 200801 1 007

iii
 PENGESAHAN UJIAN SKRIPSI

Skripsi yang berjudul “Validasi Metode Analisis Hormon Pertumbuhan

Tanaman dalam Media Kultur In Vitro dengan Kormatografi Cair Kinerja
Tinggi (KCKT)”. Setelah diuji dan dinyatakan lulus pada Sidang Munaqosah
Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah
Jakarta pada hari Senin, 26 April 2021. Skripsi telah diterima sebagai salah satu
syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains (S1) Program Studi Kimia.

Menyetujui,

Pembimbing I Pembimbing II

Nurhasni, M.Si Nurlaila, M.Si

NIP. 19740618 200501 2 005 NIP.19740704 199612 2 001

Penguji I Penguji II

Dr. Sandra Hermanto, M.Si Dr. Hendrawati, M.Si

NIP. 19750810 200501 1 005 NIP.19720815 200312 2 001

Mengetahui,

Dekan Fakultas Sains dan Teknologi Ketua Program Studi Kimia

Ir. Nashrul Hakiem, Ph.D Dr. La Ode Sumarlin, M.Si

NIP. 19710608 200501 1 005 NIP.19750918 200801 1 007

iv
v
 ABSTRAK

LILYANA RIZKI,Validasi Metode Analisis Hormon Pertumbuhan Tanaman

dalam Media Kultur In Vitro dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).
Dibawah bimbingan NURHASNI dan NURLAILA.

Validasi metode merupakan suatu proses analisis untuk membuktikan

bahwa metode tersebut memenuhi persyaratan untuk digunakan. Salah satu
instrumen analisis hormon pertumbuhan dalam media kultur in vitro adalah
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Parameter yang digunakan dalam
validasi metode meliputi uji kesesuaian sistem, presisi, akurasi, linieritas, batas
limit deteksi (LOD), batas limit kuantifikasi (LOQ) dan ketahanan (robustness).
Berdasarkan hasil penelitian, pada uji kesesuaian sistem semua standar uji
memenuhi syarat dimana nilai jumlah pelat teoritis (N) ≥ 1000, nilai HETP <1 dan
resolusi (R) > 1,5. Uji presisi masing-masing standar menunjukkan %RSD
(Relative Standar Deviation) ≤ 2% dan uji linieritas memenuhi syarat sebesar r2
0,999. Hasil uji presisi sampel memenuhi syarat %RSD dan rerata konsentrasi
tertinggi pada hormon ABA sebesar 0,78 ppm. Peroleh kembali (Recovery)
menunjukkan hasil yang tidak sesuai dengan persyaratan yaitu 90% - 107%.
Kekuatan dari metode ini cukup kuat dimana %RSD ≤ 2%. Tingkat sensitifitas
tertinggipada alat KCKT mampu mendeteksi hormon pertumbuhan, penentuan
batas deteksi (LOD) 0,73 ppm pada IBA dan batas kuantitasi (LOQ) 2,46 ppm
pada IBA.

Kata kunci: Hormon pertumbuhan, KCKT, Media in vitro, Validasi metode

vi
 ABSTRACT

LILYANA RIZKI. Validation Analiytical Method of Plant Growth Hormone In

Vitro Culture Media using High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Instruments. Supervise by NURHASNI and NURLAILA.

Method validation is an analysis process to prove that the method meets

the requirements for use. One of the growth hormone analysis methods in In Vitro
culture media is the High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
instruments. The parameters used in the validation of the method include system
suitability test, precision, accuracy, linearity, detection limit of detection (LOD),
limit of quantification (LOQ) and robustness. Based on the results of the study, in
the system suitability test all test standards met the requirements where the value
of the theoretical plate count (N) ≥ 1000, the value HETP < 1 and the resolution
(R)> 1.5. The precision test for each standard shows% RSD (Relative Standard
Deviation) ≤ 2% and the linearity test meets the requirements of r2 0.999. The
results of the sample precision test met the %RSD requirements and the highest
average concentration of the ABA hormone was 0,78 ppm. Recovery shows
results that are not in accordance with the requirements, namely 90% - 107%. The
strength of this method is quite strong where %RSD ≤ 2%. The sensitivity level of
the HPLC device was able to detect growth hormones determination of detection
limits (LOD)0,73 ppm on IBA and limits of quantitation (LOQ) 2,46 on IBA.

Key words:HPLC, In vitro media, Validation Methode, Growth hormone

vii
 KATA PENGANTAR

Assalamualaikum Wr. Wb

Alhamdulillahirobbil’alamin, segala puji dan syukur hanya dipanjatkan

kepada Allah SWT. Shalawat serta salam senantiasa kita panjatkan kepada Nabi

Muhammad SAW, keluarga dan para sahabat. Dengan rahmat dan karunia-Nya

kepada penulis, skripsi yang berjudul “Validasi Metode Analisis Zat Pengatur

Tumbuh (ZPT) dalam Media Kultur In Vitro Menggunakan Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi (KCKT)” telah dilaksanakan. Dalam pelaksanaan penyusunan

skripsiini, penulis mendapat banyak bantuan, bimbingan, dan arahan dari berbagai

pihak. Oleh karena itu penulis ini mengucapkan terimakasih kepada:

1. Nurhasni, M.Si, selaku Pembimbing I dan Sekretaris Program Studi Kimia

yang telah memberikan berbagai saran dan masukan dalam penulisan

skripsi.

2. Nurlaila, M.Si, selakuPembimbing II telah memberikan bimbingan melalui

diskusi dan arahan secara teknis penelitian.

3. Dr. La Ode Sumarlin, M.Si., selaku Ketua Program Studi Kimia.

4. Dr. Sandra Hermanto, M.Si. dan Dr. Hendrawati, M.Si., selaku penguji

Program Studi Kimia Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta

5. Ir. Nashrul Hakiem, Ph.D., selaku Dekan Fakultas Sains dan Teknologi

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

6. Keluarga yang telah membantu penulis secara materil, do’a maupun moril

viii
7. Alfinatul Jannah selaku rekan kerja, dan Nafa Fujiama Ragesta dan

teman-teman yang telah membantu perihal teknis dalam penyusunan

skripsi ini.

Semoga arahan, motivasi dan bantuan yang telah diberikan menjadi amal

ibadah bagi keluarga, bapak, dan rekan-rekan, sehingga memperoleh balasan yang

lebih baik dari Allah SWT dan penelitian ini dapat bermanfaat bagi

perkembangan ilmu pengetahuan

Wassalamua’laikum wr wb.

Tangerang, April 2021

Penulis

ix
 DAFTAR ISI

Halaman
KATA PENGANTAR ........................................................................................ viii
DAFTAR ISI ........................................................................................................ x
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... xiii
DAFTAR TABEL ............................................................................................... xiv
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xv
BAB I PENDAHULUAN .................................................................................... 1
1.1. Latar Belakang ............................................................................................... 1
1.2. Rumusan Masalah .......................................................................................... 6
1.3. Hipotesis ..................................................................................................... 6
1.4. Tujuan Penelitian ........................................................................................... 6
1.5. Manfaat Penelitian ......................................................................................... 7
BAB II TINJAUAN PUSTAKA......................................................................... 8
2.1 Validasi Metode Analisis ............................................................................... 8
2.1.1 Uji Kesesuaian Sistem .......................................................................... 8
2.1.2 Akurasi ................................................................................................. 9
2.1.3 Presisi ................................................................................................... 10
2.1.4 Ketahanan (Robustness) ....................................................................... 12
2.1.5 Linieritas ............................................................................................... 12
2.1.6 Batas Deteksi (Limit Of Detection, LOD) ............................................ 13
2.1.7 Batas Kuantifikasi (Limit Of Quantifiation, LOQ)............................... 14
2.2 Media Kultur In Vitro .................................................................................... 14
2.3 Hormon Pertumbuhan .................................................................................... 15
2.4 Kromatografi Cair kinerja tinggi (KCKT) ..................................................... 16
2.4.1 Prinsip Kerja KCKT ............................................................................. 17
2.4.2 Teknik Pemisahan KCKT..................................................................... 23
BAB III METODE PENELITIAN .................................................................... 24
3.1 Waktu dan Tempat ......................................................................................... 24
3.2 Alat dan Bahan ............................................................................................... 24
3.2.1 Alat ....................................................................................................... 24

x
 3.2.2 Bahan .................................................................................................... 24
3.3 Diagram alir ................................................................................................... 25
3.4 Prosedur Kerja ............................................................................................... 26
3.4.1 Preparasi Eluen .................................................................................... 26
3.4.2 Preparasi Standar .................................................................................. 26
3.4.3 Preparasi Sampel .................................................................................. 26
3.4.4 Kondisi Operasi KCKT ........................................................................ 27
3.4.5 Validasi Metode Analisis ..................................................................... 27
3.4.5.1 Penentuan Kesesuaian Sistem ................................................27
3.4.5.2 Penentuan Presisi .................................................................... 27
3.4.5.3 Penentuan Linieritas ............................................................... 28
3.4.5.4 Penentuan Ketahanan (Robustness) ....................................... 30
3.4.5.5 Penentuan Akurasi.................................................................. 30
3.4.5.6 Penentuan Batas Deteksi dan Kuantifikasi............................. 30
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................ 32
4.1 Hasil Ekstraksi ...............................................................................................32
4.2 Hasil Validasi Metode Analisis .................................................................... 33
4.2.1 Hasil Uji Kesesuaian Sistem ................................................................ 33
4.2.2 Hasil Uji Presisi Standar Hormon Pertumbuhan .................................. 34
4.2.3 Hasil Uji Linieritas Larutan Standar Hormon Pertumbuhan ................ 35
4.2.4 Hasil Uji Presisi Standar Campuran dan Konsentrasi Sampel Hormon
Pertumbuhan ......................................................................................... 36
4.2.5 Hasil Uji Akurasi ...................................................................................38
4.2.6 Hasil Uji Robustness Standar Hormon Pertumbuhan ............................40
4.2.7 Hasil Limit Deteksi (LOD) dan Limit Kuantifikasi (LOQ) standar
Hormon Pertumbuhan .......................................................................... 41
4.2.8 Hasil Analisis Kualitatif dan Kuantitatif Hormon Tumbuh dalam
Sampel Media In Vitro ......................................................................... 42
BAB V PENUTUP .............................................................................................. 46
5.1 Simpulan .......................................................................................................46
5.2 Saran ............................................................................................................46
DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 47

xi
LAMPIRAN .........................................................................................................51

xii
 DAFTAR GAMBAR

Halaman
Gambar 1. Diagram sistem KCKT ...................................................................... 18
Gambar 2. Skema pompa piston resiprok tunggal ............................................... 20
Gambar 3. Skema pompa dual-piston dengan pompa paralel ............................. 21
Gambar 4. Diagram alir preparasi sampel, standar hormon dan validasi metode
penelitian ........................................................................................... 25
Gambar 5. Kromatogram standar campuran dengan pengulangan injeksi tujuh
kali ...................................................................................................... 33
Gambar 6. Kromatorgram standar hormon pertumbuhan campuran ................... 43
Gambar 7. Kromatogram sampel media in vitro ................................................. 43
Gambar 8. Spektrum DAD standar ABA ............................................................ 45
Gambar 9. Spektrum DAD ABA pada sampel .................................................... 45

xiii
 DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 1. Persentasi perolehan kembali (recovery) yang diterima ........................ 10

Tabel 2. Nilai RSD yang diperbolehkan menurut Horwitz dan AOAC PVM ..... 12
Tabel 3. Model elusi (Gradien) ............................................................................ 27
Tabel 4. Komposisi uji linieritas Kinetin ............................................................. 29
Tabel 5. Komposisi uji linieritas ABA ................................................................. 29
Tabel 6. Komposisi uji linieritas IBA .................................................................. 29
Tabel 7. Komposisi uji linieritas IAA .................................................................. 29
Tabel 8. Komposisi uji linieritas NAA ................................................................. 30
Tabel 9. Hasil uji kesesuaian sistem .................................................................... 33
Tabel 10. Hasil uji presisi standar hormon pertumbuhan .................................... 35
Tabel 11. Hasil uji Linieritas standar hormon pertumbuhan ................................ 35
Tabel 12. Hasil uji presisi standar campuran hormon pertumbuhan .................... 37
Tabel 13. Hasil presisi konsentrasi sampel media in vitro ................................... 38
Tabel 14. Hasil uji akurasi sampel media in vitro ................................................ 39
Tabel 15. Hasil uji Robustness ............................................................................. 40
Tabel 16. Hasil limit deteksi dan limit kuantifikasi hormon pertumbuhan .......... 41
Tabel 17. Hasil analisis kuantitatif ....................................................................... 44

xiv
 DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Data Uji Kesesuaian Sistem ............................................................ 51

Lampiran 2. Data Presisi masing-masing Standar Hormon Pertumbuhan .......... 58
Lampiran 3. Data Linieritas Standar Hormon Pertumbuhan............................... 61
Lampiran 4. Data Linieritas Standar Hormon Pertumbuhan............................... 64
Lampiran 5. Data Presisi Standar campuran Hormon Pertumbuhan................... 67
Lampiran 6. Data Presisi Sampel Media In Vitro ............................................... 70
Lampiran 7. Data Akurasi Analit pada Sampel Media In Vitro .......................... 73
Lampiran 8. Data Robustness Standar ................................................................. 76
Lampiran 9. Data Limit Deteksi (LOD) dan Limit Kuantifikasi (LOQ) Standar
Hormon Pertumbuhan ...................................................................... 79
Lampiran 10. Data Persamaan Garis Limit Deteksi dan Limit Kuantifikasi
Standar Hormon Pertumbuhan......................................................... 81
Lampiran 11. Data Kromatogram ....................................................................... 84

xv
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Pengembangan metode analisis didasarkan pada literatur yang sudah ada

dengan menggunakan instrumen yang sama maupun berbeda. Pengembangan

suatu metode perlu adanya pendekatan dengan menghubungkan atau

membandingkan metode yang akan dikembangkan dengan metode yang telah ada

atau dengan metode standar, baik standar nasional maupun metode standar

internasional. Metode analisis dapat dioptimasi dengan berbagai variabel yang

akan ditentukan seperti resolusi, waktu retensi, faktor asimetri (dalam teknik

kromatografi cair kinerja tinggi) telah disesuaikan dengan kriteria yang

diharapkan, maka metode analisis yang telah dikembangkan selanjutnya akan

divalidasi untuk memastikan bahwa analisis sesuai dengan tujuannya (fit for

purpose) (Rohman, 2014).

International Conference on Harmonization (ICH) dalam Rohman (2014)

metode analisis harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa parameter-

parameter kinerja cukup mampu untuk mengatasi problem analisis dan metode

yang sudah baku direvisi untuk menyesuaikan perkembangan atau disebabkan

munculnya suatu masalah yang mengarah pada perevisian metode baku,

penjaminan mutu yang mengindikasikan bahwa metode baku telah berubah

seiring berjalannya waktu, metode baku digunakan di laboratorium dan dikerjakan

oleh analis yang berbeda atau dikerjakan dengan alat yang berbeda dan untuk

mendemonstrasikan kesetaraan dua metode, seperti antara metode baru dan

metode baku.

1
 Al Qur’an surat Al Mutaffifin, menerangkan mengenai manusia yang

berbuat curang dalam menimbang dan menakar.

○ َ‫طففينَ ○ الَّذينَ إذَا ا ْكتَالُوا َعلَى النَّاس يَ ْست َ ْوفُون‬ َ ‫َويْل ل ْل ُم‬
○ َ‫َوإذَا َكالُو ُه ْم أ َ ْو َوزَ نُو ُه ْم يُ ْخس ُرون‬
“Celakalah bagi orang-orang yang curang (dalam menakar dan menimbang)(1),
(Yaitu) orang-orang yang apabila menerima takaran dari orang lain mereka minta
dicukupkan (2), dan apabila mereka menakar atau menimbang (untuk orang lain),
mereka mengurangi(3)” (QS.Al Mutaffifin ayat 1-3).

Ayat tersebut menjelaskan bahwa Allah SWT melarang umatnya untuk

melakukan kecurangan dalam menakar, sehingga dalam penentuan validitas ini

data yang diperoleh dan ditunjukkan merupakan data yang sesungguhnya dari

hasil penelitian. Pada penelitian analisa kimia tidak diperbolehkan melakukan

manipulasi, hal tersebut dapat mempengaruhi hasil dalam jangka waktu panjang.

Karena metode analisa akan dipergunakan oleh peneliti lain sebagai acuan dalam

proses penelitian dan tidak dapat melihat kekurangan dari penelitian tersebut.

Sudah sewajarnya dalam penelitian ilmiah akan terjadi kesalahan baik pada data

maupun pada proses analisa.

Proses validasi analisa pada hormon pertumbuhan bertujuan untuk melihat

besarnya kadar konsentrasi yang diserap oleh tanaman dari media pertumbuhan.

Dari hasil proses validasi, akan menjadi acuan bagi peneliti lain dalam melakukan

analisa hormon pertumbuhan, mengingat hormon pertumbuhan tanaman sangat

penting khususnya dalam bidang pertanian yang menggunakan metode in vitro

yang tidak bergantung pada kondisi cuaca sekitar.

Analisa hormon pertumbuhan pada media agar bertujuan untuk

mengetahui kandungan hormon yang tersisa pada media tanam setelah dilakukan

2
penanaman selama 8 minggu. Sedangkan validasi metode Analisa kadar hormon

bertujuan untuk mengetahui apakah metode Analisa ini cocok untuk menganalisa

secara kuantitatif kadar hormon dalam media agar secara simultan.

Tanaman dapat berkembang biak secara generatif dan vegetatif, salah

satunya dengan teknik kultur jaringan secara vegetatif dengan menggunakan

media agar yang telah diberikan hormon pertumbuhan. Konsep dari teknik ini

adalah perbanyakan tanaman dengan menggunakan bagian dari tanaman yang

aktif dan di tumbuhkan pada media buatan (Rahardja dan Wiryana, 2003)

Media kultur in vitro merupakan salah satu faktor penentuan keberhasilan

perbanyakan tanaman secara kultur jaringan. Berbagai macam komposisi media

kultur telah diformulasikan dengan baik yang dapat mengoptimalkan

pertumbuhan dan perkembangan tanaman yang dikulturkan (Yusnita, 2003).

Kultur jaringan (tissue culture) merupakan suatu cara memperbanyak tanaman

dengan teknik mengisolasi pada bagian tertentu dari tanaman seperti sel,

protoplasma, jaringan dan organ dan menumbuhkannya pada media yang telah

diberi nutrisi pertumbuhan sehingga bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan

bergenerasi menjadi tanaman yang lengkap (Hendaryono dan Wijayani, 1994).

Keberhasilan penggunaan metode kultur sangat bergantung pada jenis media.

Media tidak hanya mengandung unsur hara makro maupun mikro, namun

beberapa hal penting seperti zat pengatur tumbuh. Analisa media kultur in vitro

bertujuan untuk melihat persentase konsentrasi hormon pertumbuhan yang diserap

oleh tanaman untuk tumbuh yang berasal dari media kultur in vitro. Media kultur

yang digunakan adalah media agar. Media agar tidak memiliki unsur hara secara

alami dalam proses penumbuhan tanaman, sehingga perlu adanya penambahan

3
hormon pertumbuhan sintetis dengan konsentrasi yang beragam sehingga dapat

membantu proses pertumbuhan.

Hormon pertumbuhan yang sering digunakan pada golongan auksin adalah

Indole-3-Acetic Acid (IAA), 1-Naphtalentacetic (NAA), Indole-3-Butiric Acid

(IBA) dan golongan sitokinin adalah Kinetin. Hormon tanaman merupakan

regulator penting yang diproduksi oleh tumbuhan, dan dapat terdeteksi pada

konsentrasi rendah dan dapat mengatur beberapa proses seperti pertumbuhan,

metabolisme, morfogenesis (Wu et al., 2009) dan dapat menjadi respon pelindung

terhadap tekanan biotik dan abiotik seperti anti patogen, serangga, kekeringan,

dingin dan panas (Forcat et al., 2008 dan Santner and Estelle, 2009).

Proses penentuan jenis hormon pertumbuhan, terdapat beberapa prosedur

analitik telah dikembangkan, di antaranya menggunakan teknik kromatografi cair

kinerja tinggi (KCKT). Pada penelitian Li et al(2014) validasi metode Ultra High

Performance Liquid Chromatography-Fluorometric Detection (HPLC-FLD)

menggunakan Dispersive Liquid-Liquid Microextraction (DLLME) pada buah-

buahan yang berasal dari toko buah lokal di Cina diambil secara acak. HPLC-FLD

memiliki tingkat selektifitas dan sensitifitas yang baik untuk menganalisis hormon

tanaman, ditambah dengan penggunaan DLLME yang dapat mengekstraksi secara

mikro sehingga dapat menghemat waktu dan lebih selektif terhadap hormon yang

diinginkan.

Isabel et al (2011) melakukan validasi metode analisis hormon tanaman

pada sayuran Zukini yang diperoleh dari rumah kaca yang terletak di provinsi

Almera (Spanyol Tenggara) menggunakan metode Ultra High Performance

Liquid Chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry (UHPLC-

4
MS/MS). Penggunaan UHPLC-MS/MS akan meningkatkan sensitifitas yang

tinggi dibandingan dengan HPLC-UV, sehingga analis memilih metode tersebut.

Prosedur yang dikembangkan menggunakan tujuh sampel Zukini. Hasil dari

metode tersebut menunjukkan %recovery berkisar pada 75-110% dengan variasi

konsentrasi (50, 100 dan 250 ppm) dan dari tujuh sampel sayur Zukini ditemukan

beberapa hormon tanaman salah satunya adalah NAA.

Perbedaan HPLC dengan UHPLC dapat dilihat dari tingkat resolusi,

tekanan, biaya dan jenis kolom yang digunakan. UHPLC memberikan tingkat

resolusi yang lebih baik dibandingkan dengan HPLC karena panjang kolom yang

lebih pendek dan partikel berukuran submikron. Sistem HPLC lebih terjangkau

dibandingkan UHPLC dan proses preparasi HPLC lebih mudah dilakukan

dibanding UHPLC. Pemanasan gesekan yang disebabkan oleh tekanan balik yang

tinggi terjadi pada UHPLC sehingga dapat menurunkan kualitas kolom lebih cepat

(Saul, 2018).

Penelitian Nehela et al (2016), analisis hormon tanaman menggunakan

metode Gas Chromatography - Mass Spectrometry (GC-MS) yang dimodifikasi

dengan proses derivatisasi pada sampel daun dan akar jeruk manis (Citrus sinensis

(L.) Osbeck). Ekstrak jaringan tanaman yang bersifat asam seperti auksin dan

ABA diderivatisasi dengan Methyl Chloroformate (MCF), sedangkan untuk

sitokinin dan GAS diderivatisasi dengan N-Methyl-N-(trimethylsilyl)

trifluoroacetamide(MSTFA) dengan suhu 85°C selama 45 menit kemudian

dilakukan pengukuran analisis dengan GC-MS.

Penggunaan metode KCKT-UV lebih mudah, akurat untuk validasi

metode hormon tanaman dan aman dari kerusakan hormon yang bersifat labil

5
pada suhu tinggi dan proses preparasi yang mudah dibandingkan dengan metode

UHPLC-MS/MS dengan ionisasi ESI selain instrumen yang masih jarang

ditemukan di Indonesia, preparasi dan metode tersebut terbilang sulit untuk

dilakukan terutama dalam proses analisis validasi meskipun tingkat sensitifitasnya

tinggi. Metode KCKT memiliki kelebihan pada proses preparasi yang lebih

mudah dibanding menggunakan instrument yang lebih rumit. Tingkat sensitifitas

metode ini juga terbilang tinggi, sehingga analisa sekecil hormon pertumbuhan

tanaman dapat dianalisa dengan preparasi yang mudah.

1.2 Rumusan Masalah

1. Apakah metode KCKT-UV mampu mendeteksi keberadaan hormon

pertumbuhan tanaman dalam media in vitro?

2. Bagaimana tingkat validitas metode ini dalam penentuan hormon

pertumbuhan dalam media kultur in vitrodengan instrumen KCKT?

1.3 Hipotesis

1. Semua jenis hormon tanaman seperti auksin, sitokinin, yang terkandung

dalam media kultur dan dapat terdeteksi dengan metode KCKT-UV.

2. Validasi metode ini dapat digunakan sebagai acuan penentuan hormon

pengatur tumbuh dengan beberapa parameter seperti batas deteksi, batas

kuantifikasi, presisi, akurasi, linieritas dan ketahanan.

1.4 Tujuan Penelitian

1. Menentukan kemampuan metode KCKT-UV dalam pengukuran hormon

pertumbuhan yang ada dalam media in vitro.

6
 2. Menguji tingkat validitas metode KCKT-UV dalam penentuan hormon

pertumbuhan dalam media kultur in vitroberdasarkan parameter seperti,

batas deteksi, batas kuantifikasi, presisi, akurasi, linieritas dan ketahanan.

1.5 Manfaat Penelitian

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan acuan dalam

pengembangan metode validasi hormon pertumbuhan pada media kultur in

vitromelalui metode KCKT-UV.

7
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Validasi Metode Analisis

Validasi metode analisis bertujuan untuk diperolehnya data yang sesuai

dengan tujuannya. Data yang valid sangat dibutuhkan oleh analis sehingga harus

memperhatikan proses-proses analisis (Rohman, 2014). Validasi diartikan sebagai

kegiatan konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang objektif.

Validasi metode merupakan suatu proses analisis tertentu untuk membuktikan

bahwa metode tersebut memenuhi persyaratan untuk digunakan. Validasi metode

juga dapat dilakukan jika terjadi perubahan kondisi antara analisis dan validasi

metode atau perubahan metode standar (Harmita, 2004). Kegiatan validasi

bermanfaat untuk mengevaluasi kerja suatu metode dan menjamin keakuratan data

pada prosedur analisis serta mengurangi penyimpangan (Wulandari, 2007).

Menurut ISO 17025: 2005, sebagai standar internasional untuk laboratorium dan

kalibrasi suatu metode analisis harus divalidasi jika:

1. Metode tidak baku, artinya belum diakui secara luas

2. Metode yang dikembangkan oleh laboratorium

3. Metode standar yang digunakan diluar lingkupnya

4. Perubahan dari metode standar

5. Gabungan dari dua metode atau lebih

Proses validasi meliputi pengujian beberapa parameter yaitu presisi,

akurasi, batas deteksi (LOD), batas kuantifikasi (LOQ), spesifisitas, linieritas,

kekasaran (Ruggedness) dan ketahanan (Robustness). Pada penelitian ini, 6

8
parameter yang akan menjadi acuan yaitu akurasi, presisi, linieritas, robustness

(ketahanan),limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ).

2.1.1 Uji Kesesuaian Sistem

Uji kesesuian sistem digunakan untuk memverifikasi bahwa sistem

kromatografi dapat diterapkan dalam analisis (Kuncoro et al., 2014). Uji

kesesuaian sistem yang digunakan dalam penelitian ini meliputi jumlah pelat

teoritis (N), High Equivalentof Theoretical Plate(HETP) dan Resolusi (R).Hasil

uji keseuaian sistem memenuhi standar apabila nila N ≥ 1000 (USP, 2012) HETP

< N, dan R > 1,5 (Synder et al., 1997).

Jumlah pelat teoritis (N) merupakan paramater yang digunakan untuk

menghitung efisiensi kromatografi. Efisiensi merupakan ukuran tingkat

penyebaran puncak dalam kolom. Efisiensi kolom dapat ditunjukkan dari jumlah

lempeng teoritikal atau theoritical plates (N) pada persamaan 1. Kolom dapat

dikatakan efisiensi jika kolom mampu menghasilkan pita sempit dan dapat

memisahkan analit dengan baik. Nilai lempeng akan semakin tinggi jika ukuran

kolom semakin panjang sehingga hal tersebut memperlihatkan proses pemisahan

yang semakin baik. Hubungan antara nilai lempeng dengan panjang kolom

disebut dengan nilai HETP seperti pada persamaan 2 (Synder et al., 1997).

𝑡𝑅
𝑁 = 16 ( 𝑤 )2................................................................................. (1)

Keterangan: tR : waktu retensi analit

w : lebar pada dasar puncak
L
HETP = N ...................................................................................... (2)

Keterangan: L : panjang kolom (mm)

N : jumlah pelat teoritis

9
 2(tR2−tR1)
𝑅= ................................................................................ (3)
(w1+w2)
Keterangan: tR : waktu retensi analit
w : lebar pada dasar puncak

2.1.2 Akurasi

Akurasi merupakan kedekatan antara nilai terukur (measured value)

dengan nilai sebenarnya yang diterima, baik nilai sebenarnya, maupun nilai

rujukan (Rohman, 2014). Menurut Ahuja dan Ramusses (2007), akurasi sebuah

metode analisis yang mencerminkan nilai atau harga dari yang diperoleh saat

penelitian dengan data yang sesungguhnya ditentukan dengan % recovery.

Akurasi memiliki tiga pendekatan yang umum digunakan, yaitu

menggunakan Standart Reference Material(SRM), melakukan spiking terhadap

plasebo atau metode simulasi, dan menggunakan metode penambahan standar

(standar addition method) (Rohman, 2014). Dalam metode simulasi, sejumlah zat

bahan murni, ditambahkan kedalam campuran bahan pembawa sediaan farmasi

(plasebo) dan kemudian campuran tersebut dianalisis hasilnya dan dibandngkan

dengan kadar zat yang sebenarnya sesuai pada persamaan 4. Dalam metode

penambahan standar atau baku, sampel yang dianalisis dengan jumlah tertentu dan

diketahui zatnya kemudian ditambahkan ke dalam sampel yang kemudian

dianalisis lagi (Harmita, 2004).

Perhitungan perolehan kembali dapat juga ditetapkan dengan rumus:

(Cf−CA)
% Perolehan kembali = X 100%.... .................................... (4)
Ca

Keterangan: Cf : konsentrasi total sampel yang diperoleh dari pengukuran

CA : konsentrasi sampel sebenarnya
Ca : konsentrasi analit yang ditambahkan

10
Akurasi yang dapat diartikan sebagai nilai perolehan kembali yang telah umum

kurang lebih 98-102 %. Jika perolehan kembali di luar kisaran yang telah

ditetapkan seperti pada Tabel 1, maka metode analisis harus diinvestigasi kembali.

Tabel 1. Persentasi perolehan kembali (recovery) yang diterima. (Gonzales et al.,

2010)
Analit (%) Satuan konsentrasi Rata-rata perolehan kembali (%)
100 100 % 98-102
10 10 % 98-102
1 1% 97-102
0,1 0,1 % 95-105
0,01 100 ppm 90-107
0,001 10 ppm 80-110
0,0001 1 ppm 80-110
0,00001 100 ppb 80-110
0,000001 10 ppb 60-115
0,0000001 1 ppb 40-120

2.1.3 Presisi

Presisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan dapat

dideskripsikan sebagai simpangan baku relatif (Relative Standard Deviation,

RSD) atau sering disebut dengan koefisien variasi (KV). Keseksamaan atau

keterulangan merupakan presisi yang dilakukan pada kondisi percobaan yang

sama secara berulang baik dari segi praktikan, peralatan, lokasi maupun waktu.

Dapat dikatan seksama jika metode menghasilkan simpangan baku relatif atau KV

2% atau kurang. Nilai KV tergantung pada kadar zat yang dianalisis. Terdapat dua

pilihan pengujian yang telah diakui oleh International Conference on

Harmonization (ICH) untuk mengamati keterulangan, yaitu pertama suatu

pengukuran sebanyak paling sedikit sembilan kali yang mencangkup kisaran yang

digunakan dalam prosedur analisis dan pengukuran sebanyak paling sedikit enam

kali pada konsentrasi 100% dari konsentrasi uji (Rohman, 2014).

11
 Menurut Rohman (2014) keterulangan presisi yang dilakukan pada

kondisis percobaan yang sama (berulang), baik praktikan, peralatannya, lokasi,

maupun waktu. Pengujian yang telah diizinkan oleh penggunaannya oleh ICH

untuk mengamati keterulangan yaitu, suatu pengukuran minimal sebanyak

sembilan kali yang mencangkup kisaran yang digunakan dalam prosedur analisis

(seperti dengan tiga konsentrasi yang berbeda pada kisaran konsentrasi, dengan

masing-masing dilakukan replikasi sebanyak tiga kali) dan suatu pengukuran

minimal sebanyak enam kali pada konsentrasi 100% dari konsentras uji. Harmita

(2004) menyebutkan untuk menetapkan presisi bahan campuran, formula berikut

ini dapat digunakan untuk menentukan metode ketertiruan yang tepat.

Rumus simpangan baku :

√( Σ(x –x′rata−rata)^2
𝑆𝐷 = ..................................................................(5)
n−1

Rumus %RSD:
𝑆𝐷
%RSD = 𝑅𝑒𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑋 100%............................................................(6)

Keterangan: c : konsentrasi analit sebagai fraksi desimal (contoh: 0,1% = 0,001)

x : banyaknya hasil analisis
x’: rata-rata dari jumlah hasil analisis

Menurut ketentuan Horwitzh dan AOAC PVM pada Tabel 2 merupakan

nilai RSD berdasarkan level analitnya. Sesuai dengan persentase perolehan

kembali yang telah diperbolehkan, nilai persentase RSD sebagai gambaran presisi

yang merupakan fungsi dari level analit dalam sampel.

12
Tabel 2. Nilai RSD yang diperbolehkan menurut Horwitz dan AOAC PVM
(Gonzales dan Herrador, 2007)
Analit (%) Horwizt (% RSD) AOAC PVM (% RSD)
100 2 1,3
10 2,8 1,8
1 4 2,7
0,1 5,7 3,7
0,01 8 5,3
0,001 11,3 7,4
0,0001 16 11
0,00001 22,6 15
0,000001 32 21
0,0000001 45,3 30

2.1.4 Ketahanan (Robustness)

Ketahanan merupakan metode yang berfungsi sebagai ketahanan dalam

pengaruh oleh adanya variasi paramater metode yang kecil. Ketahanan dapat

dievaluasi dengan melakukan variasi dari beberapa parameter metode seperti

pelarut organik, pH dan sebagainya. Validasi metode yang baik adalah dapat

mengevaluasi ketahanan dengan memvariasikan parameter-parameter penting

secara sistematis dan mengukur pengaruh pada pemisahan (Rohman,

2014).Godswill et al (2014) menyebutkan robustness harus diperhatikan dalam

pengembangan metode karena untuk mengukur besaran ketahanan terhadap

pengaruh oleh variasi metode parameter yang kecil.

2.1.5 Linieritas (Harmita, 2004)

Linieritas merupakan kemampuan metode analisis yang memberikan

respon yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang

baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Perlakuan matematik

dalam pengujian linieritas adalah melalui persamaan garis lurus dengan metode

kuadrat terkecil antara hasil analisis terhadap konsentrasi analit. Jumlah sampel

13
yang dianalisis sekurang-kurangnya delapan buah sampel blanko. Sebagai

parameter hubungan linier digunakan koefisien korelasi r pada analisis regresi

linier y = a + bx. Hubungan linier yang ideal dicapai jika nilai b = 0 dan r = +1

atau -1 bergantung pada arah garis. Nilai a menunjukkan kepekaan analisis

terutama instrumen yang digunakan.

Rohman (2014) menyebutkan linieritas dapat ditunjukkan secara langsung

dengan mengencerkan larutan baku yang dilakukan secara serial. Penyiapan

konsentrasi yang berbeda dengan menggunakan berat baku yang berbeda akan

menimbulkan kesalahan yang besar terhadap hasil analisis linieritas. Linieritas

yang baik dapat dievaluasi dengan pengamatan visual terhadap suatu plot yang

menyatkan hubungan antara fungsi konsentrasi analit dengan beberapa fungsi

lainnya (adsorbansi, luas puncak, tinggi puncak, luas bawah kurva dan

sebagainya). Uji linieritas menggunakan sedikitnya 5 konsentrasi yang berbeda.

2.1.6 Batas Deteksi (Limit of Detection, LOD) (Harmita, 2004)

Limit deteksi adalah jumlah terkecil suatu zat dalam sampel yang dapat

dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan blanko

(Harmita, 2004). Menurut Abdul (2014) batas deteksi dan batas kuantifikasi

merupakan suatu parameter yang digunakan untuk menggambarkan tingkat

sensitivitas suatu metode analisis. LOD biasanya menggunakan rasio 2 atau 3

banding 1 yang diekspresikan sebagai suatu konsentrasi pasa rasio sinyal terhadap

derau (signal to noise ratio). Limit ini dapat diukur secara statistik melalui garis

regresi linier dari kurva kalibrasi pada persamaan 7.

𝑠𝑦
3( )
𝑥
LOD = ...................................................................................(7)
𝑏

14
Keterangan: LOD :Limit of Detection
(sy/x) :Simpangan baku residual
b :Arah garis linear dari kurva antara respon terhadap
konsentrasi = slope (b pada persamaan garis y = a+bx)

2.1.7 Batas Kuantifikasi (Limit of Quantification, LOQ)

Batas kuantifikasi (LOQ) didefinisikan sebagai konsentrasi analit terendah

dalam sampel yang dapat ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat

diterima pada kondisi oprasional metode yang digunakan (Rohman, 2014).

Adapun menurut Harmita (2006) dan Gandjar (2009) batas kuantifikasi

merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil

suatu zat tertentu dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan

seksama. Limit ini dapat diukur berdasarkan regresi linier dan kurva kalibrasi.

LOQ dapat diartikan sebagai konsentrasi (dengan akurasi yang sesuai) dengan

rasio signal to noise 10:1 merupakan aturan yang umum digunakan seperti pada

persamaan 8.
𝑠𝑦
10( )
𝑥
LOQ = .................................................................................(8)
𝑏

Keterangan: LOQ :Limit of Quantification

(sy/x) :Simpangan baku residual
b :Arah garis linear dari kurva antara respon terhadap
konsentrasi = slope (b pada persamaan garis y = a+bx)

2.2 Media Kultur In Vitro

Kultur in vitro merupakan metode yang berfungsi mengisolasi bagian-

bagian tanaman seperti sel, jaringan ataupun organ yang ditumbuhkan pada

sebuah media secara aseptik, sehingga tanaman tersebut dapat memperbanyak diri

dan meregenerasi. Sebuah teori yang dikemukakan oleh ahli biologi yang berasal

15
dari German yaitu Schleiden dan Schwann bahwa prinsip pada kultur in vitro

terdapat pada teori sel. Teori tersebut menyatakan sel bersifat autonom yang

berarti dapat melakukan metabolisme, tumbuh dan berkembang secara

berkembang secara mandiri jika diisolasi tunas dari jaringan induknya, dan

totiopotensi diartikan sebagai kemampuan sel untuk tumbuh dan meregenerasi

menjadi tanaman yang lengkap (Indrianto, 2003).

Menurut Nurheti (2010) kultur in vitro memiliki keuntungan yaitu

pengadaan bibit tidak bergantung pada musim dan bibit yang dihasilkan sama dan

bebas terhadap penyakit. Adapun tujuan dari kultur in vitro adalah untuk

memperbanyak tanaman dengan waktu yang relatif singkat.

2.3 Hormon Pertumbuhan

Hormon pertumbuhan sangat penting dalam membantu mempercepat

pertumbuhan dan perkembangan tanaman baik secara in vitro maupun alami yang

disebut dengan Phytohormone.Hormon tanaman (Phytohormones) berasal dari

bahasa yunani yatu “phytos” yang artinya tanaman dan “hormanein” yang artinya

zat perangsang sehingga fitohormon dapat didefinisikan sebagai zat-zat yang

dapat merangsang pertumbuhan dan mengatur proses fisiologi tanaman. Hormon

pertumbuhan dapat dibagi menjadi 6 kelompok yaitu auksin, sitokinin, etilen,

giberelin brasinosteroid dan asam absisat (Teale et al., 2006).

Auksin berfungsi merangsang pertumbuhan akar, mengatur pembesaran

sel dan memicu perpanjangan sel tanaman, serta meningkatkan dominansi apikal

dan diferensi xylem. Auksin banyak ditemukan pada embrio benih dan jaringan

merismatik yang aktif tumbuh seperti tunas tanamana, ujung akar dan pucuk

16
ranting atau daun. Menurut Tsavkelova et al (2005) fitohormon auksin yang

banyak terdapat di alam dan paling aktif adalah Indole-3-Acetic Acid (IAA).

Selain auksin alami, terdapat auksin sintetik seperti Napthalene-3-Acetic Acid

(NAA), 2,4-Dicholrophenoxyacetic acid (2,4 D) dan Indole-3-Butyric Acid (IBA).

Sitokinin berperan penting dalam pengaturan pembelahan sel

morfogenesis. Sitokinin yang pertama kali ditemukan adalah kinetin. Kinetin

berkerjasama dengan auksin memberikan pengaruh interaksi terhadap diferensiasi

jaringan. Kinetin adalah N6-furfuril adenin suatu turunan dari basa adenin. Zeatin

merupakan salah satu jenis sitokinin yang terdapat pada hasil isolasi biji jagung

yang berfungsi sebagai unsur hara yang diperlukan oleh tanaman (Damiska et al.,

2015). Salah satu sitokinin sintesis adalan 6-Benzyl amino purine (BAP) (Alitalia,

2008). BAP merupakan sitokinin yang sering digunakan karena lebih efektif dan

lebih stabil (Yusnita, 2003). Wattimena (1988) menambahan bahwa BAP

merupakan turunan adenin yang disubtitusi pada posisi 6 yang strukturnya serupa

dengan kinetin.

Asam absidik (Abscisic Acid, ABA) merupakan memiliki peranan dalam

proses pertumbuhan dan perkembangan tanaman. ABA berinteraksi dengan zat-

zat pengatur tumbuh tanaman yang lain pada proses tersebut, biasanya interaksi

ini bersifat menghambat.

2.4 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi Cair kinerja tinggi (KCKT) atau biasa disebut juga dengan

High Perfomance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan teknik pemisahan

yang dapat dilakukan secara luas untuk analisis obat (Rohman, 2009). Metode ini,

17
berprinsip pada perbedaan molekul-molekul komponen diantara dua fasa, fasa

gerak dan fasa diam yang memiliki sifat kepolaran yang berbeda. Apabila molekul

komponen saling berinteraksi secara lemah dengan fasa diam, maka komponen

tersebut akan bergerak lebih cepat meninggalkan fasa diam. Oleh karena itu,

keberhasilan pemisahan bergantung pada daya interaksi antar komponen

campuran dengan fasa diam dan fasa gerak (Effendy, 2004). Menurut Rohman

(2007), penggunaan kromatografi cair membutuhkan penggabungan secara tepat

dari berbagai aspek seperti fase gerak, jenis kolom, panjang dan diameter kolom,

kecepatan alir fasa gerak, suhu kolom hingga ukuran sampel.

KCKT termasuk kromatografi kolom, sampel yang melalui kolom akan

mengalami pemisahan senyawa-senyawa didalamnya (Harvey, 2000). Effandy

(2004) menyebutkan bahwa, teknologi kolom didasarkan atas penggunaan kolom

yang berlubang dengan diameter 2 µm hingga 5µm dan isi kolom berupa partikel

kecil berukuran 3µm hingga 5 µm yang memungkinkan tercapainya

keseimbangan secara cepat antara fasa diam dan fasa gerak. Sistem pompa

bertekanan tinggi kepada fase gerak akan berpengaruh pada pencapaian laju alir

hingga beberapa mL per menit, sehingga metode tersebut dinamakan kromatografi

cair dengan kinerja tinggi.

2.4.1 Prinsip kerja KCKT

Prinsip kerja KCKT adalah fasa gerak yang dialirkan dengan bantuan

pompa melalui kolom dektektor yang di dalamnya sudah di masukkan sampel

dengan cara disuntik. Adanya perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut

terhadap fasa diam, sehingga terjadi pemisahan komponen-komponen cairan.

Menurut Gandjar dan Rohman (2007), pemisahan senyawa dalam KCKT diatur

18
oleh distribusi senyawa dalam fasa gerak dan fasa diam. Komponen dalam suatu

campuran, akan dideteksi oleh detektor dalam bentuk kromatogram.

Analisis menggunakan KCKT relatif lebih cepat, daya pemisahan yang

baik, tingkat sensitifitas yang tinggi hingga nanogram/mililiter, pemilihan kolom

yang bervariasi, kolom dapat digunakan kembali, dapat menganalisis senyawa

dengan ukuran bervariasi dan campuran yang memiliki titik didih yang tinggi

(Harmita, 2006). Sesuai pada Gambar 1, fasa gerak yang akan dialirkan menuju

kolom dengan bantuan pompa yang kemudian siap diinjeksikan dan data akan

muncul pada komputer.

Gambar 1. Diagram sistem KCKT. (a) wadah fasa gerak; (b) pompa; (c) injektor;
(d) kolom; (e) detektor; (f) sistem pendataan (Snyderet al., 2010).

a. Wadah Fasa gerak.

Wadah fasa gerak berisi fasa gerak yang berguna untuk memisahkan

komponen sampel. Wadah ini harus dalam keadaan bersih dan lembam (inert).

Dalam penentuan pelarut fasa gerak, sangat dianjurkan menggunakan pelarut

dengan tingkat kemurnian yang tinggi karena jika adanya zat pengotor, partikel

yang kecil akan terkumpul dalam kolom sehingga dapat mengakibatkan

kekosongan pada kolom yang kemudian dapat menyebabkan gangguan pada

sistem pembacaan kromatografi (Gandjar dan Rohman, 2007).

19
b. Fasa Gerak

Fasa gerak KCKT berupa zat cair atau disebut juga eluent atau pelarut.

Menurut Gandjar dan Rohman (2007), fasa gerak atau eluent biasanya terdiri dari

atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan

dalam daya elusi dan resolusi. Diperkuat oleh Kazakevich dan Lo Brutto (2007),

fasa gerak pada KCKT menggunakan fasa terbalik yaitu campuran hidro organik.

Senyawa organik yang umumnya digunakan adalah asetonitril dan metanol atau

campuran keduanya.

Persyaratan fasa gerak KCKT:

1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk sampel yang akan

dianalisis.

2. Zat cair harus murni sekali

3. Zat cair mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun

4. Zat cair tidak kental. Kekentalan tidak > 0,5 cp

5. Sesuai dengan detektor

6. Zat cair harus jernih sekali untuk menghindari penyumbatan pada kolom.

Biasanya pelarut disaring dengan saringan nilon berukuran diameter pori

0,45 µl.

Konsentrasi dari larutan organik dalam fase gerak merupakan faktor

dominan yang mempengaruhi retensi analit dalam sistem KCKT. Pertimbangan

dalam memilih solven fasa gerak meliputi kompabilitas antar solven, kelarutan

sampel dalam eluen, polaritas, transmisi cahaya, viskositas, stabilitas dan pH.

Pemilihan zat cair sebagai fasa gerak ini merupakan hal yang kritis dalam

keberhasilan pemisahan. Hingga saat ini pemilihan fasa gerak berdasarkan

20
eksperimen trial dan error karena belum ada teori yang pasti. Trial error

dilakukan hingga diperoleh kromatogram yang sesuai harapan analit.

c. Pompa

Pompa berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang

berisi serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan dalam KCKT harus memiliki

syarat sebagai berikut:

1. Menghasilkan tekanan hingga 5000 psi (pons/in2)

2. Keluaran bebas pulsa

3. Kecepatan alir berkisar antara 0,001 – 10 mL/menit

4. Bahan tahan korosi (Rohman, 2009)

Solvent keluar
Katup periksa

Segel piston
piston

Katup periksa
Motor

Solvent masuk

Gambar 2. Skema pompa piston resiprok tunggal (Ahuja dan Dong, 2005)

Pompa yang digunakan pada KCKT memiliki desain resiprok seperti pada

Gambar 2. Pada gambar tersebut dapat dilihat terdapat cam bermotor yang dapat

menjalankan piston kearah depan dan belakang untuk mengalirkan solven melalui

suatu vulva inlet dan outlet (Ahuja dan Dong, 2005).

21
Gambar 3. Skema pompa dual-piston dengan pompa paralel (Ahuja dan Dong,
2005)

Perkembangan model pompa yang telah dimodifikasi pada desain dual-

piston yang kini banyak digunakan seperti pada Gambar 3. Pompa ini memiliki

dua piston dijalankan oleh dua motor yang terpisah (Ahuja dan Dong, 2005).

d. Injektor

Sampel cair yang telah siap dianalisis disuntikan secara langsung kedalam

fasa gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom. Pada proses injeksi

hindari memasukkan sampel dalam jumlah yang banyak yang dapat

mengakibatkan ketidaktepatan pengukuran KCKT karena adanya keterulangan

pemasukkan. Maka disarankan untuk menggunakan sampel sedikit mungkin

(Gandjar dan Rohman, 2007).

e. Kolom

Kolom yang digunakan terbuat dari stainless steel atau gelas yang

berdinding tebal. Menurut Harvey (2000), kolom merupakan bagian KCKT yang

berisi fasa diam. Fasa diam pada KCKT berupa lapisan film cair yang terikat pada

basis partikel silika yang bertujuan untuk mencegah kemungkinan terjadinya

kebocoran cairan fasa. Partikel silika direaksikan dengan organochlorosilane atau

Si(CH3)2RCl, di mana R merupakan suatu alkil atau gugus alkil terdistribusi.

Kepolaran dari fasa diam bergantung pada jenis R, fasa diam dan gugus fungsi

harus memiliki sifat kepolaran yang sama.

22
f. Detektor

Detektor berfungsi sebagai mendeteksi sampel yang terdapat didalam

kolom analitik. Syarat suatu detektor harus memiliki tingkat sensitifitas yang

tinggi, stabil, cepat, reprodusibel dan mempunyai volume yang kecil sehingga

mampu meminimalkan pelebaran pita yang dihasilkan, kemudian tidak sensitif

terhadap perubahan suhu kecepatan alir fasa gerak (Rohman, 2009). Terdapat tiga

detektor, detektor umum memberi respon terhadap fasa gerak yang dimodulasi

dengan adanya sampel. Detektor spesifik memberi respon terhadap sampel yang

tidak dimiliki oleh fasa gerak. Detektor yang bersifat umum terhadap sampel

setelah fasa gerak dihilangkan dengan pengumpan. Menurut Kar (2005), salah

satu detektor yang populer digunakan adalah detektor UV-Vis. Prinsip dasar

detektor ini pada adanya penyerapan ultraviolet (UV) dan sinar tampak (Visible)

dengan kisaran panjang gelombang 190-800 nm yang dapat mendeteksi gugus-

gugus kromoforik.

Gandjar dan Rohman (2007) mengatakan, analisis kualitatif KCKT berupa

pengamatan waktu retensi (tR) pada senyawa baku yang baku dan senyawa dalam

suatu sampel yang belum diketahui dan membandigkannya dengan cara

kromatografi secara bergilir dengan kondisi alat yang stabil dengan rentang

perbedaan waktu pengoprasian antar keduanya sekecil mungkin. Analisis

kuantitatif pada KCKT dengan mengukur tinggi puncak sebagai garis dasar ke

puncak maksimum. Sedangkan luas puncak diukur sebagai hasil kali tinggi

puncak dan lebar pada setengah tinggi (W1/2). Menurut Harmita (2006), analisis

kualitatif KCKT dilihat dari kekhasan waktu retensi namun tidak spesifik, artinya

terdapat lebih dari satu komponen zat yang mempunyai waktu retensi yang sama

23
sehingga membutuhkan uji kemurnian puncak spektrofotometri dengan

menggunakan waktu relatif. Sedangkan untuk analisis kuantitatif spektrum hasil

dari serapan komponen-komponen campuran yang memiliki gugus kromofor

dengan memperhatikan panjang gelombang maksimum untuk menetapkan

komponen dan fasa gerak. Dasar perhitungan kuantitatif dengan mengukur luas

atau tinggi puncaknya.

2.4.2 Teknik Pemisahan KCKT

a. Sistem Isokratik

Merupakan suatu teknik pemisahan dimana komposisi fasa gerak dan fasa

diam tidak berubah sehingga polaritas dari eluen tersebut stabil hingga akhir

analisis.

b. Sistem Gradien

Merupakan suatu teknik pemisahan dimana terjadi perubahan komposisi

fasa gerak sehingga teknik ini dilakukan dengan bertujuan memisahkan campuran

dengan polaritas yang beragam (Harmita, 2006).

24
 BAB III

METODE PENELITIAN

3.1Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilakukan pada bulan November 2019 hingga Agustus 2020

di Balai Bioteknologi BPPT Puspiptek, Serpong. Media kultur in vitro berasal dari

Laboratorium Mikropropagasi Tanaman Balai Bioteknologi BPPT Puspiptek,

Serpong.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah neraca analitik (Denver),

tabung sentrifugasi, gelas beker, gelas ukur, mikropipet 1000 µL; 200 µL dan 20

µL, kertas saring (Waltman 45), evaporator (Heidolph Laborota 4000), micro

tube, pH meter (Mettler Toledo), konsentrator (Sakuma Ec-2000), dan instrumen

KCKT (Hitachi L-2130), kolom Phenomenex® Luna C18, 5 µm (250 x 4.6 mm),

sonikator (Tomy MX-301) dan hot plate (MTOPS).

3.2.2 Bahan

Bahan yang digunakan adalah sampel media agar yang berasal dari

perkebunan Balai Bioteknoogi, akuabides, etil asetat (Emsure), metanol untuk

analisis (Merck), asam format(APS Finechem), trietilamin (Sigma-Aldrich) dan

beberapa hormon standar seperti kinetin (Sigma), indole-3-asam asetat (Sigma),

asam absidik (Sigma), indol-3-asam butirik (Sigma), dan 1-naftalen asetat

(Sigma).

24
3.3 Diagram Alir

Media kultur
ditimbang 500 g
Etil
asetat Filtrat dipisahkan
Dimaserasi ± 24 dari media agar
jam

Disentrifuse selama
Filtrat dikeringkan
10 menit, kecepatan
dalam evaporator
3000 rpm
Metanol

Dikeringkan kembali
dengan konsentrator
selama ± 3 jam

Metanol
Standar hormon
Disentrifuse selama
pertumbuhan ditimbang
10 menit, kecepatan
1200 rpm
Metanol

Diinjeksikan pada alat KCKT

1. Uji kesesuaian sistem

2. Uji presisi
3. Uji akurasi
4. Uji linieritas
5. LOD dan LOQ
6. Robustness

Gambar 4. Diagram alir preparasi sampel, standar hormon dan

validasi metode penelitian

25
3.4 Prosedur Kerja

3.4.1 Preparasi Eluen (Li et al., 2016)

Larutan asam format 0,1 % pH 3,2 sebanyak 2 liter dibuat dengan

mengambil 2 mL asam format dalam 2 liter aquabides yang kemudian dilakukan

pengukuran pH dengan merubah sistem setting pada alat dengan mode manual

agar pH yang diinginkan dapat terukur dengan baik. Menambahkan trietilamin

(TEA) beberapa tetes hingga tercapai pH 3,2.

3.4.2 Preparasi Standar

Standar hormon tanaman masing-masing dibuat sebagai acuan dalam

pengukuran menggunakan konsentrasi 1000 ppm dengan cara menimbang setiap

standar (kinetin, IAA, ABA, IBA dan NAA) sebanyak 0.0010 g/mL dalam 1 mL

metanol. Kemudian dilakukan pengenceran kembali sebanyak lima kali, sehingga

mendapatkan konsentrasi 200 ppm.

3.4.3 Preparasi Sampel (Li et al., 2016)

Sampel media kultur in vitro dimaserasi menggunakan etil asetat hingga

sampel terendam, kemudian diaduk menggunakan magnetic stirer (dengan

kondisi suhu tidak menyala) selama kurang lebih 24 jam. Hasil maserasi disaring,

kemudian filtrat tersebut disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 3000

rpm. Filtrat yang telah disentrifugasi dipisahkan kemudian dievaporasi hingga

kering. Ekstrak hormon pertumbuhan yang telah kering kemudian dilarutkan

dengan metanol sebanyak 5 mL, lalu dipekatkan kembali dengan konsentrator

kurang lebih 3 jam hingga metanol habis. Hasil pemekatan kemudian

ditambahkan dengan metanol sebanyak 500 µL dan disentrifuse dengan kecepatan

1200 rpm selama 10 menit agar tidak ada gumpalan yang dapat menghambat

26
proses pada alat KCKT. Ekstrak sampel hormon pertumbuhan siap diinjeksikan

pada KCKT.

3.4.4 Kondisi Operasi KCKT(Li et al., 2016)

Analisis dilakukan dengan menggunakan KCKT HITACHI L 2130 dengan

kondisi sebagai berikut:

Fase gerak : (A) metanol : (B)0.1% asam format pH 3.2

Detektor : UV 200 nm
Kolom : Phenomenex® Luna C18, 5 µm (250 x 4.6 mm)
Laju alir : 1.44 mL/min
Model elusi : gradient (10 : 90)
Volum injeksi : 10 µL
Panjang gelombang : 200 nm
Tabel 3. Model elusi (Gradien)
MeOH 0,1% Asam Format Waktu retensi
(%) pH 3,2 (%) (min)
10 90 0
10 90 5
30 70 10
30 70 20
45 55 35
45 55 60
10 90 63
10 90 75

3.4.5 Validasi Metode Analisis (Rohman, 2014 dan Harmita, 2004)

3.4.5.1 Penentuan Kesesuian Sistem

Uji kesesuaian sistem dilakkukan dengan menghitung pelat teoritis (N),

High Equivalent of Theoritical Plate (HETP) dan resolusi (R) sebanyak 7 kali

pengulangan injeksi pada standar masing masing hormon tanaman dengan kondisi

yang telah disesuaikan, hingga diperoleh hasil dengan persyaratan tertentu pada

27
masing-masing parameter. Rumus perhitungan nilai pelat teoritis (N), HETP dan

resolusi (R) menggunakan rumus (1), (2) dan (3).

3.4.5.2 Penentuan Presisi

Standar hormon tanaman masing-masing diinjeksikan sebanyak 7 kali

pengulangan untuk mengetahui presisi pada masing-masing hormon tanaman.

Standar hormon campuran diinjeksikan juga sebanyak 10 kali dan sampel daun

anggrek diberi perlakuan jumlah injeksi yang sama yang selanjutnya dilakukan

perhitungan presisi menggunakan rumus (5) dan (6). Keberhasilan nilai RSD pada

penentuan presisi, dapat dilihat pada tabel 2 sebagai acuan (Harmita, 2014).

Konsentrasi standar hormon yang digunakan sebesar 200 ppm hasil

pengenceran dari larutan baku 1000 ppm. Penggunaan konsentrasi diharapkan

sekecil mungkin dikarenakan hormon dalam sampel memiliki kemungkinan

konsentrasi yang sangat rendah.

Proses injeksi menggunkan alat KCKT dibutuhkan waktu 75 menit setiap

standar hormon dan proses penentuan presisi harus dilakukan dalam satu waktu

yang sama setiap jenis hormon untuk mencegah pergeseran rentan waktu.

3.4.5.3 Penentuan Linieritas

Pengujian lineritas terhadap 5 standar hormon tanaman dapat diperoleh

hasil dengan mengukur deret standar yang dibuat dengan melakukan pengenceran

larutan standar induk. Pengukuran dilakukan satu persatu standar hormon tanaman

yaitu, kinetin, IAA, IBA, ABA dan NAA dengan konsentrasi induk sebesar 200

ppm dan dilakukan pengenceran dengan konsentrasi yang beragam seperti pada

Tabel 4-8.

28
Tabel 4. Komposisi uji linieritas Kinetin
Standar Kinetin Metanol Konsentrasi
(µL) (/100µL) (ppm)
- 100 -
12,5 87,5 25
25 75 50
50 50 100
75 25 150
100 - 200

Tabel 5. Komposisi uji linieritas ABA

Standar ABA Metanol Konsentrasi
(µL) (/100µL) (ppm)
- 100 -
12,5 87,5 25
25 75 50
50 50 100
75 25 150
100 - 200

Tabel 6. Komposisi uji linieritas IBA

Standar IBA Metanol Konsentrasi
(µL) (/100µL) (ppm)
- 100 -
5 95 10
10 90 20
15 85 30
20 80 40
25 75 50

Tabel 7. Komposisi uji linieritas IAA

Standar IAA Metanol Konsentrasi
(µL) (/100µL) (ppm)
- 100 -
10 90 20
20 80 40
40 60 80
62,5 37,5 125
100 - 150

29
Tabel 8. Komposisi uji linieritas NAA
Standar NAA Metanol Konsentrasi
(µL) (/100µL) (ppm)
- 100 -
2,5 97,5 5
5 95 10
7,5 92,5 15
10 90 20
12,5 87,5 25

3.4.5.4 Penentuan Ketahanan (Robustness)

Memvalidasi ketahanan suatu metode perlu dibuat perubahan metode yang

kecil dan terus menerus dan mengevaluasi respon analitik dan efek presisi dan

akurasi. Uji robustness dilakukan dengan mengubah komposisi perbandingan

terhadap fase gerak. Pada kondisi normal, fase gerak menggunakan perbandingan

metanol : asam format 0,1% pH 3,2 (10:90) yang kemudian dirubah dengan

perbandingan (15:85).

3.4.5.5 Penentuan Akurasi

Penentuan akurasi dilakukan dengan menambahkan spike (adisi standar)

terhadap sampel dengan perbandingan 50:50. Komposisi spike yang digunakan

terdiri dari kinetin 100 µL, IAA 100µL, GA 100 µL, BAP 100µL, 100 IBA 100

µL, ABA 100 µL, DPA 100 µL dan NAA 100 µL kemudian standar campuran

tersebut digunakan sebanyak 10µL dan larutan sampel 10 µL sehingga

menghasilkan faktor pengenceran sebanyak dua kali. Akurasi dinyatakan sebagai

persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Kriteria akurasi

bergantung kepada konsentrasi analit dalam matriks sampel dan pada

keseksamaan metode (RSD). Selisish kadar pada berbagai penentuan (Xd) harus

5% atau kurang pada setiap konsentrasi analit dan melakukan perhitungan

30
perolehan kembali (4). Keberhasilan akurasi suatu metode dapat dilihat pada tabel

1 sebagai acuan.

3.4.5.6 Penentuan Batas Deteksi(LOD) dan Batas Kuantifikasi (LOQ)

Penentuan batas deteksi dan kuantifikasi dapat dihitung secara statistik

melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi menggunakan rumus (4) dan (5).

Nilai pengukuran akan sama dengan nilai b pada persamaan garis linier y = a +

bx, sedangkan simpangan baku blanko sama dengan simpangan baku residual

(Sy/x)

31
 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Ekstraksi

Prepasi sampel merupakan satu hal yang penting dalam prosedur analisis

karena akan berpengaruh pada hasil analisis. Proses ekstraksi menggunakan

metode maserasi disebabkan atas sensitivitas senyawa hormon pertumbuhan

terhadap suhu tinggi sehingga proses maserasi dilakukan dalam suhu ruang.

Prinsip ekstraksi dengan metode maserasi adalah terjadinya proses difusi larutan

penyari ke dalam sel tumbuhan yang mengandung senyawa aktif. Difusi tersebut

mengakibatkan tekanan osmosis dalam sel menjadi berbeda dengan keadaan

diluar sel. Sehingga senyawa yang memiliki kepolaran yang sama dengan pelarut

kemudian terdorong keluar karena adanya perbedaan tekanan osmosis didalam sel

dan di luar sel (Dean, 2009).

Pelarut yang digunakan dalam proses maserasi adalah etil asetat hingga

sampel terendam dengan sempurna. Pemilihan pelarut etil asetat yang memiliki

sifat semi polar diharapkan dapat mengikat hormon pertumbuhan. Filtrat yang

telah didapatkan dilanjutkan dengan evaporasi pada suhu 80°C menggunakan alat

rotary vacum evaporator bertujuan memisahkan hormon pertumbuhan dengan

pelarut etil asetat yang memiliki titik didih 77,1°C. Penggunaan metanol dapat

melarutkan hormon pertumbuhan yang menempel pada labu evaporator yang

kemudian dimasukkan kedalam alat konsentrator yang akan mempekatkan hasil

ektraksi hormon pertumbuhan. Hasil dari konsentrator yang kemudian

ditambahkan metanol sebanyak 200 µL. Larutan hasil sentrifugasi dipisahkan dari

endapan dan siap dilakukan analisis pada alat KCKT.

32
4.2 Hasil Validasi Metode Analisis

4.2.1. Hasil Uji kesesuaian Sistem

Pengujian kesesuian sistem dilakukan hingga 7 kali pengulangan sehingga

diperoleh nilai yang sesuai dengan standar pada masing-masing parameter.

Berdasarkan hasil uji kesesuaian sistem pada gambar 5 dengan pengulangan

injeksi sebanyak tujuh kali, lima standar hormon tanaman memenuhi standar uji

kesesuaian dengan diperoleh nilai jumlah pelat teoritis (N) ≥ 1000, nilai HETP ≤ 1

dan resolusi (R) > 1,5.

Gambar 5. Kromatogram standar hormon campuran dengan pengulangan injeksi

tujuh kali

Tabel 9. Hasil uji kesesuaian sistem

Standar Rerata jumlah pelat Rerata Resolusi
Rerata HETP
Hormon teoritis (N) (R)
Kinetin 429.693 0,002
59,78
IAA 802.771 0,00037
88,25
ABA 1.577.660 0,00046
12,58
IBA 1.653.510 0,00012
23,78
NAA 222.657 0,0015

33
 Nilai HETP (High Equivalent of Theoretical Plate) merupakan hubungan antara

panjang kolom dengan nilai N sebagai nilai efisiensi kolom. Faktor keberhasilan yang

diperoleh terdapat pada panjang kolom yang digunakan dimana N akan semakin tinggi jika

ukuran semakin panjang (Synder et al., 1997) dan faktor resolusi dapat ditingkatkan

dengan ukuran kolom yang semakin panjang sehingga dapat mempengaruhi faktor

pemisahan yang semakin baik (Crowfod, 2019).Kromatogram dan contoh perhitungan

dapat dilihat pada lampiran 1.

Hasil penelitian pada tabel 9 menunjukkan rerata jumlah pelat teoritis dari masing-

masing standar hormon dan uji kesesuaian lainnya memenuhi standar dikarenakan proses

analisis menggunakan kolom sepanjang Phenomenex Luna C18 250 mm x 4,60 mm x 5

micron sehingga proses pemisahan semakin baik. Tabel 8 menunjukkan hasil resolusi

antara dua puncak yang saling berdampingan dengan melibatkan lebar dasar puncak

dengan waktu retensi. Rerata resolusi dengan hasil > 1,5 akan memnuhi syarat.

4.2.2. Hasil Uji Presisi Standar Hormon Pertumbuhan

Pengujian presisi standar pada hormon tanaman kinetin, IAA, ABA, IBA

dan NAA bertujuan untuk mengetahui kesesuaian dan efektifitas kondisi

operasional. Presisi dilakukan pada setiap standar hormon tanaman sebanyak

tujuh kali pengulangan injeksi sehingga dapat diperoleh hasil yang kemudian

dihitung nilai Relative Standard Deviation (%RSD) dengan standar ketelitian

RSD ≤ 2% (Sugihartini et al.,2014). Perolehan data dari masing-masing standar

hormon menunjukkan persyaratan tersebut terpenuhi seperti pada tabel 10. Data

dan contoh perhitungan pada lampiran 2.

34
Tabel 10. Hasil uji presisi standar hormon pertumbuhan
Standar Rata-Rata Parameter
Hormon Luas Area SD % RSD
Kinetin 12.041.005 24.395 0,20
IAA 22.450.928 334.473 1,49
ABA 2.837.012 13.208 0,47
IBA 3.237.541 19.318 0,60
NAA 2.067.531 16.258 0,79

4.2.3. Hasil Uji Linieritas Larutan Standar Hormon Pertumbuhan

Menurut Wirasnita (2010) linieritas menggambarakan kemampuan metode

analisis untuk memberikan respon terhadap konsentrasi analit dalam sampel.

Pengujian ini dilakukan dengan mengukur larutan standar menggunakan HPLC

pada berbagai konsentrasi mulai dari konsetrasi terkecil hingga konsentrasi

terbesar. Luas area dan konsentrasi diaplikasikan untuk memperoleh kurva

linieritas standar yang kemudian dibentuk persaman garis dan harga koefisien

relasi (r).

Tabel 11. Hasil uji linieritas standar hormon pertumbuhan

Standar Hormon Rata-rata Luas Nilai Koefisien
Pertumbuhan Area Determinasi (r2)
Kinetin 10.281.198 0,999
IAA 7.852.113 0,999
ABA 2.087.629 0,999
IBA 4.181.526 0,999
NAA 2.401.448 0,999

Standar hormon tanaman masing-masing dibuat sebanyak enam deret

standar dimana koefisien determinasi masing-masing standar hormon tanaman

memiliki nilai koefisien determinasi (r2) yang baik yaitu 0,999 dapat dilihat pada

Tabel 11. Nilai r2 tersebut menunjukkan bahwa metode analisis ini memiliki

perbandingan yang proposional dan bertujuan untuk menunjukkan hubungan

secara langsung atau tidak antara respon detektor dengan perubahan konsentrasi

analit. Pengukuran linieritas dilakukan secara individu, dimana masing-masing

35
standar memiliki konsentrasi linieritas yang berbeda. Hal tersebut disebabkan

karena besar puncak yang akan muncul berbeda beda, sehingga konsentrasi tidak

bisa disama ratakan satu sama lain. Jika pengolahan data linieritas menggunakan

standar campuran, dikhawatirkan pada konsentrasi tertentu terdapat standar

hormon pertumbuhan yang tidak muncul.

Pada penelitian Isabel et al (2011) menggunakan matriks bunga zukini

dengan metode UHPLC-MS, memperoleh nilai koefisien determinasi (r2) dimana

larutan standar hormon IAA dan NAA memperoleh 0,999. Penelitian Ngin et al

(2014) melakukan penelitian analisis hormon tanaman pada air buah kelapa

menggunakan metode Capillary Electrophoresis–Mass Spectrometry (CE-

MS/MS) menghasilkan koefisien determinasi (r2) pada standar IAA, ABA, IBA

dan NAA memperoleh rentang 0,991-0,994. Hasil penelitian Almaeda et al(2014)

menggunakan sampel bunga spesiesarabidopsis thaliana dengan metode HPLC-

MS/MS menunjukkan koefisien determinasi (r2) pada standar hormon tanaman

ABA adalah 0,998. Metode yang memiliki linieritas baik apabila persamaan kurva

memiliki koefisien korelasi r > 0,995 atau r2> 0,990 (Njoman dan Adarwulan,

2016), sehingga dapat disimpulkan uji linieritas ini memenuhi syarat standar

linieritas.

4.2.4. Hasil Uji Presisi Standar Campuran dan Konsentrasi Sampel Hormon
Pertumbuhan

Menurut Harmita (2014) presisi atau keseksamaan merupakan ukuran yang

dapat memunculkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual dan diukur

melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur tersebut diterapkan

secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen.

36
Keseksamaan dapat diukur sebagai simpangan baku atau simpangan relatif

(koefisien variasi).

Pada penelitian ini, keseksamaan dinyatakan sebagai keterulangan

(repeatability) yang dilakukan berulang kali oleh analis dan kondisi yang sama

dalam interval waktu yang pendek. Keterulangan dapat dinilai melalui pelaksaan

penetapan terpisah lengkap terhadap sampel identik yang terpisah dari batch yang

sama sehingga memberikan ukuran keseksamaan pada kondisi yang normal

(Harmita, 2014).

Proses pengujian presisi dilakukan sebanyak tujuh kali dengan konsentrasi

yang sama yaitu masing-masing 200 ppm sehingga terjadi sembilan kali

pengenceran. Hasil yang diperoleh pada uji presisi kemudian dilakukan

perhitungan %RSD. Penelitian memperoleh hasil nilai %RSD dari masing-masing

standar hormon pada rentang 0,69-3,68% pada tabel 12.

Tabel 12. Hasil uji presisi standar campuran hormon pertumbuhan

Parameter
Standar Hormon Rata-rata Luas Area
SD %RSD
Kinetin 705.771 8.570 1,21
IAA 1.879.845 12.929 0,69
IBA 692.044 6.001 0,87
ABA 106.511 3.915 3,68
NAA 7.115.091 86.753 1,22

Terdapat ketidak sesuaian hasil presisi pada standar hormon campuran

yaitu ABA dengan %RSD 3,68 tentu tidak sesuai dengan standar %RSD ≤ 2%.

Penyebab ketidak sesuaian dengan beragam kemungkinan seperti kesalahan

pengukuran pada human error, standar hormon yang sudah tidak segar atau

konsentrasi pada pelarut yang sudah tidak stabil. Pada penelitian Marilia et al

37
(2014) hasil uji presisi %RSD pada ABA menggunakan HPLC-MS sebesar

8,91%. Data dan contoh perhitungan pada lampiran 5.

Tabel 13. Hasil presisi konsentrasi sampel media in vitro

Rata rata Parameter
Sampel Standar
Konsentrasi (ppm) SD %RSD
Kinetin 0,0151 0,000206 1,36
Media IAA 0,0123 0,001158 9,35
pertumbuhan ABA 0,7777 0,005518 0,71
IBA 0,1575 0,000531 0,34

Hasil dari presisi sampel pada tabel 13 menunjukkan hormon IAA

memiliki %RSD sebesar 9,35 yang tidak memenuhi persyaratan. Penyebab

ketidak berhasilan hasil %RSD pada IAA diduga standar IAA sudah tidak stabil,

sehingga luas area yang dihasilkan tidak konsisten. Parameter %RSD hasil dari

rata-rata sampel memenuhi syarat. Penelitian Nehela et al (2016) dengan

menggunakan GC-MS dengan sampel daun jeruk menunjukkan %RSD pada IAA,

IBA dan ABA dengan masing-masing 0,049%, 0,098% dan 0,077%. Jurnal

tersebut menyebutkan bahwa ABA terdeteksi dalam daun dan akar.

4.2.5. Hasil Uji Akurasi

Konsentrasi standar campuran sebesar 25 ppm yang disebabkan oleh

faktor pengenceran, dimana dalam wadah terpisah dari sampel hormon standar

campuran masing-masing 200 ppm standar hormon dimasukkan sebanyak 100 µL,

sehingga terjadi pengenceran sebanyak delapan kali. Sehingga masing masing

standar hormon memiliki konsentrasi yang sama saat dimasukkan kedalam

sampel.

38
Tabel 14. Hasil uji akurasi sampel media in vitro
Sampel Jenis Hormon Luas Area Standar % Recovery
Kinetin 6020502 -7
IAA 11225464 4
Media in vitro ABA 1418506 -48
IBA 1618771 -77

%Recovery memiliki tujuan untuk melihat persentase penambahan

konsentrasi adisi pada sampel dan perolehan kembali pada uji akurasi dari

penelitian ini menunjukan tidak memenuhi hasil, hal tersebut diduga berasal dari

standar hormon yang sudah tidak stabil atau instrumen dalam kondisi tidak baik.

Faktor lain ketidak berhasilan perolehan kembali seperti pada tabel 14 adalah

rentang waktu analisa, dimana baik standar hormon tanaman maupun sampel yang

telah terlampau lama dapat mengurangi stabilitas konsentrasi yang akan

berpengaruh pada hasil akhir %recovery. Faktor tersebut berbanding lurus dengan

penelitian Li, et al (2016) melakukan pengujian stabilitas konsentrasi hormon

pertumbuhan dengan rentang waktu 10-50 jam yang menghasilkan tingkat

penurunan stabilitas konsentrasi.

Menurut Harmita (2014) akurasi merupakan ukuran yang menunjukkan

derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang sebenarnya yang dapat

dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan.

Hasil akurasi bergantung pada sebaran kesalahan sistematik dalam suatu tahapan

analisis sehingga untuk mencapai hasil akurasi yang tinggi hanya dapat dilakukan

dengan cara mengurangi kesalahan sistematik dalam tahapan analisi dengan

diperngaruhi beberapa faktor yaitu instrumen yang telah dikalibrasi, penggunaan

larutan yang segar dan pelaksanaan analisis yang cermat tentunya sesuai dengan

prosedur yang dianjurkan.

39
 Penelitian sebelumnya dilakukan oleh Maria et al (2011) mendapat hasil

recovery menggunakan pelarut metanol pada hormon tanaman menggunakan

metode UHPLC-MS/MS, hormon IAA dan NAA berturut-turut bernilai 48% dan

49%. Pada penelitian Li et al (2014) melakukan penelitian pada beberapa sampel

buah menggunakan metode HPLC mendapatkan hasil rentang 90-107%. Menurut

DEPTAN (2006) metode dianggap valid pada konsentrasi 100 ppm apabila hasil

% recovery berada pada rentang 80-110%.

4.2.6. Hasil Uji Robustness Standar Hormon Pertumbuhan

Uji robustness atau ketahanan merupakan kapasitas metode untuk melihat

pengaruh oleh adanya variasi parameter-parameter seperti persentase pelarut

organik (± 2 sampai 5%), pH (± 0,5 unit pH), kekutan ionik buffer, suhu kolom (±

1 sampai 5°C) dan sebagainya (Rohman, 2014). Menurut Godswill et al (2014)

evaluasi ketahanan (robustness) harus dipertimbangkan dalam pengembangan

metodeuntuk melihat ketidak terpengaruhnya perubahan variasi parameter yang

disengaja.

Tabel 15. Hasil uji Robustness

Standar Hormon Rata-rata Luas Parameter

Pertumbuhan Area SD %RSD
Kinetin 2.722.489 31.844,06 1,17
IAA 3.985.256 3.187,70 0,08
IBA 1.852.031 34.045,20 0,92
ABA 3.704.333 28.576,80 1,54
NAA 6.132.131 21.520,11 0,35
Pada penelitian ini, perubahan parameter yang digunakan adalah

perubahan pada persentase fase gerak, dimana berawal dari 10:90 (metanol : asam

format 0,1% pH 3,2) menjadi 15:85 (metanol : asam format 0,1% pH 3,2).

Perubahan persentase fase gerak menghasilkan nilai %RSD dari masing-masing

40
standar hormon terlihat pada tabel 15, hasil uji memenuhi persyaratan dimana

RSD ≤ 2%, meskipun terjadi pergeseran retention time (RT) namun terjadi

konsistensi waktu terhadap pengulangan. Data dan perhitungan selengkapnya

dapat dilihat pada lampiran 7.

4.2.7. Hasil Limit Deteksi (LOD) dan Limit Kuantitasi (LOQ) Standar
Hormon Pertumbuhan

Menurut Rohman (2014), limit deteksi atau Limit Of Detection (LOD) merupakan

parameter yang digunakan untuk menggambarkan sensitivitas suatu metode

analisis yang masih dapat dideteksi pada suatu alat. Menurut Sugihartini et al

(2014) limit kuantifikasi atau Limit Of Quantitation (LOQ) merupakan parameter

yang menggambarkan konsentrasi terendah analit dalam sampel yang dapat

dianalisis dengan presisi dan akurasi pada kondisi percobaan tertentu.

Tabel 16. Hasil Limit deteksi dan limit kuantifikasi standar hormon pertumbuhan
Standar Hormon
LOD (ppm) LOQ (ppm)
Pertumbuhan
Kinetin 4,69 15,63
IAA 1,57 5,24
ABA 5,84 19,47
IBA 0,73 2,46
NAA 2,10 7,00

Pada tabel 16, batas deteksi terendah adalah 0,73 ppm pada IBA. Data dan

contoh perhitungan pada lampiran 9 dan 10. Penelitian Li, et al (2016) LOD dan

LOQ dengan sampel alga menggunakan HPLC-MS mendapatkan hasil pada IAA

dan ABA dengan masing-masing LOD 0,69 ppm dan 3,89 ppm, dan masing-

masing LOQ 2,32 ppm dan 12,98 ppm. Terlihat ABA memiliki tingkat sensitifitas

yang sangat rendah dengan melihat besarnya konsentrasi yang dapat dideteksi

pada instrumen.

41
4.2.8. Hasil Analisis Kualitatif dan Kuantitatif Hormon Pertumbuhan
dalam Sampel Media In Vitro

Hasil analisis kualitatif pada pengukuran sampel hormon pertumbuhan

menghasilkan waktu retensi yang berbeda dibandingkan dengan waktu retensi

standar hormon pertumbuhan dan sampel spike pada uji akurasi. Sampel media in

vitro agar menunjukkan, terdapat empat hormon pertumbuhan yaitu kinetin, IAA,

ABA dan IBA yang terdekteksi. Hormon NAA kemungkinan tidak ada atau tidak

terdeteksi karena melewati batas deteksi pada sehingga tidak terbaca pada alat.

Perkembangan deteksi dalam validasi metode yang sangat sensitif dan

selektif sangat penting dalam penentuan hormon pertumbuhan secara akurat,

seperti konsentrasi yang sangat rendah. Beberapa hormon tanaman yang sedikit

penyerapan sinar Ultra Violet (UV) dan tidak ada penyerapan fluoresensi seperti

ABA sehingga pengukuran menggunakan instrumen yang lebih kompleks seperti

instrumen KCKT dengan detektor UV atau detektor diode array. Selain itu,

sebagian hormon petumbuhan dengan gugus karboksilat yang memiliki polaritas

yang kuat menyebabkan retensi menjadi lemah, sehingga proses pemisahan

dengan metode yang tradisional lebih sulit. Perkembangan analisis dengan teknik

dan metode yang terbaharukan seperti penggunaan KCKT, GC dengan detektor

UV, detektor diode array ataupun fluoresensi dalam analisis hormon tanaman

(Esparza, 2013).

Jenis kolom yang digunakan pada penelitian ini adalah kolom KCKT fase

terbalik. Kolom KCKT dengan fase terbalik yang sering digunakan adalah tipe

C18 yang tersusun oleh penyangga silika gel (SiO2). Permukaan silika tersebut

terdapat gugus hidroksil (-OH) sehingga silika gel bersifat polar. Fase diam

42
dengan penyusun silica memiliki rentang pH yang dapat ditoleransi pada pH 2-7

(Kazakevich dan Labruto, 2007).

Gambar 6. Kromatogram standar hormon pertumbuhan campuran

Gambar 7. Kromatogram sampel media in vitro

43
Tabel 17. Hasil analisis kuantitatif
Konsentrasi Konsentrasi Konsentrasi
Hormon masing-masing hormon hormon
pertumbuhan standar hormon pertumbuhan pertumbuhan pada
(ppm) campuran (ppm) sampel (ppm)
Kinetin 0,0151
IAA 0,0123
ABA 200 25 0,7777
IBA 0,1575
NAA -

Kromatogram memunculkan waktu retensi dan panjang gelombang yang

dapat menganalisis jenis hormon yang diinginkan. Gambar 6 menunjukkan

kromatogram standar hormon pertumbuhan sebagai acuan. Kromatogram pada

Gambar 6 memiliki delapan puncak, disebabkan awal penelitian terdapat delapan

hormon pertumbuhan yang akan dianalisa, sehingga terjadi faktor pengenceran

sebanyak delapan kali. Meskipun masing-masing hormon pertumbuhan memiliki

konsentrasi yang sama yakni 25 ppm, namun batas deteksi masing-masing

hormon pertumbuhan berbeda. Konsentrasi masing-masing dibuat sebesar 200

ppm. Pembuatan konsentrasi standar yang terlampau kecil dimaksudkan untuk

melihat tingkat sensitifitas alat, karena hormon pertumbuhan tanaman sangat

sedikit, sehingga menghindari analisa dalam jumlah yang sangat besar. Hasil

analisa konsentrasi pada sampel untuk masing-masing hormon pertumbuhan

menghasilkan konsentrasi yang beragam seperti pada tabel 17, kecuali pada NAA

yang tidak terdeteksi pada alat. Hal tersebut memiliki dua kemungkinan yaitu,

hormon NAA benar-benar tidak ada pada media pertumbuhan tersebut atau batas

deteksi NAA melampaui batas deteksi pada alat sehingga tidak terbaca.

44
 Gambar 8. Spektrum DAD standar ABA

Gambar 9. Spektrum DAD ABA pada sampel

Spektrum Diode Array Detector (DAD) dapat meyakinkan analis untuk

memutuskan nama hormon yang muncul dengan melihat panjang gelombang yang

dihasilkan. Seperti pada Gambar 8 spektrum DAD standar ABA yang menjadi

acuan panjang gelombang yang akan dicari pada sampel sebesar 256,1. Sampel

yang memiliki banyak kromatogram pada gambar 7 yang muncul sehingga dapat

membingungkan analis, dengan membaca spektrum DAD akan mudah

menentukan, seperti pada gambar 9 sampel pada menit 38,79 dianalisis spektrum

DAD dan menunjukkan panjang gelombang yang sama seperti pada standar ABA.

45
 BAB V

PENUTUP

5.1. Kesimpulan

1. Hasil uji menunjukkan hormon zat pengatur tumbuh dapat terdeteksi pada

media media kultur in vitro adalah kinetin, IAA, ABA dan IBA dengan

masing-masing rerata konsentrasi 0,015 ppm %RSD 1,36; 0,012 ppm

%RSD 9,35; 0,778 ppm %RSD 0,71 dan 0,158 ppm %RSD 0,34.

2. Hasil uji tingkat validitas metode dalam penentuan hormon dengan metode

kromatografi cair kinerja tinggi telah memenuhi syarat kecuali%Recovery.

5.2. Saran

Perlu dilakukan pengujian kembali dengan analisis yang lebih teliti

penggunaan instrumen yang baik, standar hormon yang segar, sampel yang segar,

konsentrasi eluen yang terjaga agar tidak rusak. Melakukan uji presisi atau uji

banding menggunakan instrumen dan anali yang berbeda dengan waktu yang

berbeda.

46
 DAFTAR PUSTAKA

Ahuja, S., dan Dong, M. 2005. Handbook of Pharmaceutical Analysis by HPLC.

Elsevier Academic Press: San Diego. 50-53.

Almeida, M, T., D, Gezimar., Edson, R., William, B., Axel, M. 2014. Validated
Methode for Phytohormone Quantification in Plants. Research Article.
Germany.

Ashari, S. 1995. Hortikultura Aspek Budidaya. UI-Press: Jakarta.

Chiwocha, S.D.S., Abrams, S.R., Ambrose, S.J., Cutler, A.J., Loewen, M., Ross,
A.R.S., Kermode, A.R. 2003. A Method for Profiling Classes of Plant
Hormones and their Metabolites Using Liquid Chromatography-
Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry: An Analysis of
Hormone Regulation of Thermodormancy of Lettuce (Lactuca sativa L.)
seeds. Plant J. 35: 405–417.
Crawford Scientific, The Theory of HPLC Chromatographic
Parameters.http://www.chromacademy.com. Diakses tanggal 20 November
2020.

Damiska, S. R., S. Wulandari dan H. Darwati. 2015. Penambahan Ragi dan

Ekstrak Biji Jagung Terhadap Pertumbuhan Tunas Manggis Secara In Vitro.
Jurnal Hutan Lestari. 3(1): 35-42.

Davies, P.J. 2010. Plant Hormones: Biosynthesis, Signal Transduction, Action!

Third Edition. Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, The Netherlands.

Dean, J. R., Dean J. A., 2009. Extraction Techniques in Analytical Science. John
Wiley & Sons. Ltd, United Kingdom: p. 49.

Effendy. 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi dalam Bidang Farmasi. USU
Esparza, X., Moyano, E., Cosialls, J., Galceran, M. 2013. Analitica Chimica Acta.
782: 28–36.

Forcat, S., Bennett, M. H., Mansfield, J. W., Grant, M. R. 2008. Plant Methods.4:
1–8.

Gandjar, I.G. dan Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis.Yogyakarta: Pustaka

Pelajar.
Godswill, N. N., Frank, N. E. G., Edson, M. Y. J., Emmanuel, Y., Martin, B.
J.,Hermine, N. B., Kingsley, T. N., Constant, L. N. B., & Arman, N. M.
2014. GC-FID Method Development and Validation Parameters of Analysis
of Palm Oil Fatty Acid Composition. Research Plant in Sciences. 2(3):53-
66.

47
Gussakovskaya, M. A., Blintsov, A. N. 2007. Biochemistry: Moscow. 72: 339
Han, Z., Liu, G., Rao, Q., Bai, B., J. 2012. Chromatogram.881: 83–89.

Harmita. 2004. Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya.

Majalah Ilmu Kefarmasian: Jakarta. 1 (3): 117-135.

Harmita. 2006. Buku Ajar Analisis Fisikokimia Departemen Farmasi FMIPA.

Universitas Indonesia: Depok. 40-59.

Harvey, D. 2000. Modern Analytical Chemistry. The McGraw-Hill Companies,

Inc: USA
ICH. 2005. Validation of Analytical Proceduires: Text and Methodology. ICH
Hamonised Tripartite Guideline

Indrianto, A. 2003. Kultur Jaringan Tumbuhan. Fakultas Biologi Universitas

Gadjahmada: Yogyakarta.

Isabel, M., Romero, R., Garrido, A., Luis, J. 2011. QuEChERS-based Extraction
Procedure for Multifamily Analysis of Phytohormones in Vegetables by
UHPLC-MS/MS. Department of Analytical Chemistry. Research article.
University Almeria: Spain.34: 1517-1524.

Iswanto, H. 2002. Petunjuk Perawatan Anggrek. AgroMedia Pustaka: Jakarta

Kar, A. 2005. Pharmaceutical Drug Analysis. New Ager Publications: India. 454,
462.

Kazakevich, Y., and LoBrutto, R. 2007. HPLC for Pharmaceutical Scientists.

John Wiley & Sons, Inc.: New Jersey.

Kazakevich,Y., and Lobrutto, R., 2007. More Practical Problem Solving in

HPLC.Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA Weinheim: Germany. 34.

Lambers, H., Chapin, F. S., Pons, T. L. 2008. Plant Physiological Ecology.

Springer: New York.

Li, G., Lu, S., Wu, H., Chen, G., Liu, S., Kong, X., Kong, W., You, J. 2014.
Determination of Multiple Phytohormones in Fruits by High-Performance
Liquid Chromatography with Fluorescence Detection Using Dispersive
Liquid–Liquid Microextraction Followed by Precolumn Fluorescent
Labeling. Research Articel : China. 00: 1-10.
Li, Yun., Chengxu, Z., Xiaojun, Y., Jinrong, Z., Jilin, Xu,. 2016. Simultaneous
Analysis of Ten Phytohormones In Sargassum Horneri by High-
Performance Liquid Chromatography with Electrospray Ionization Tandem
Mass Spectrometry. Journal Of Separation Science, Research Article.
Ningbo University: China. 39: 1804-1813.

48
Nehela, Y., Hijaz, F., Elzaawely, A., El-Zahaby, H., Killiny, N. 2016.
Phytohormone Profiling of the Sweet Orange (Citrus sinensis (L.) Osbeck)
Leaves and Roots Using GC–MS-Based Method. Department ofAgricultural
Botany. Article in Journal of plant physiology: Egyp. 199: 12-17.

Ngin, T, S., Jean, W., and Liya, G. 2014. ArticelAnalyses of Phytohormones in

Coconut (Cocos Nucofera L.) Water Using Capillary Electrophoresis-
Tandem Mass Spectrometry. Nanyang Technological University and
Singapore University of Technology and Design. 1:211-226
Njoman, M. F., & Andarwulan, N. 2016. Validasi Metode Analsis Asam Lemak
Trans dalam Makanan Berdasarkan AOCS Official Method Ce 1h-05. Jurnal
Teknologi dan Industri Pangan Universitas IPB. Bogor: 27(1): 40-50.

Nurheti. 2010. Kultur Jaringan Tanaman Skala Rumah Tangga. Lily Publisher:
Yogyakarta.

Rahardja. P. C. dan W. Wiryanta. 2003. Aneka Cara Memperbanyak Tanaman.

AgroMedia Pustaka.

Rohman, A. 2009. Kromatografi Untuk Analisis Obat. Graha Ilmu: Yogyakarta.

111, 113, 115

Rohman, A. 2014. Validasidan Penjaminan Mutu Metode Analisis Kimia. UGM

Press: Yogyakarta. 102-107.

Santner,A., and Estelle,M. 2009. Recent Advances and Emerging Trends In

Planthormones Ignalling. Nature. 459: 1071-1078.

Saul, Louise. 2018. High-Performance Liquid Chromatography vs Ultra-High

Performance Liquid Chromatography. Articel. Sheffield Hallam University.

Schneider, A., Hommel, G., Blettner, M. 2010. Linear Regression Analysis.

Deutsches Arzteblatt International: Germany.
Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Glajch, J. L. 1997. Practical HPLC Method
Development. 2nd Edition. New York: John Willey & Sons, Inc.
Sugihartini, N., Fudholi, A., Pramono, S., & Sismindari. (2014). Validasi Metode
Analisis Penetapan Kadar Epigalokatekin Galat Dengan KCKT. Jurnal
Teknik Farmasi Universitas Gadjah Mada. 4(2): 111-115.

Suryana, A. 2005. Prospek dan Arah Pengembangan Agribisnis Anggrek. Badan

Penelitian dan Pengembangan Pertanian: Jakarta.

Synder, L., Kirkland, J., and Dolan, J. 2010. Introduction to Modern Liquid
Chromatography Third Edition. John Wiley & Sons, Inc.: New Jersey. 307

49
Teale W. D., A. P. Ivan and P. Klaus. 2006. Auxin in Action: Signaling, Transport
and the Control of Plant Growth and Development. Institut für Biologie
II/Botanik, Schänzlestrasse, 79104 Freiburg: Germany.

Tsavkelova, E.A., T.A. Cherdyntseva, and A.I. Netrusov. 2005. Auxin Production
by Bacteria Associated with Orchid Roots. Microbiology. 74 (1): 46-53.

Tucker, G.A., Roberts, J.A. 2000. Plant Hormone Protocols. Humana Press Inc.:
Totowa, NJ, USA.

Wattimena, G. A. 1988. Bioteknologi Tanaman 1. Institut Pertanian Bogor:

Bogor

Widyastuti, Y.E. 1993. Flora Fauna Maskot Nasional dan Propinsi. Penebar
Swadaya: Jakarta.
Wirasnita, R. (2010). Validasi Metode Modifikasi Metilasi Minyak Nabati Untuk
Penentuan Kandungan Asam Lemak Secara Kromatografi
Gas.SkripsiFMIPA. Depok: Universitas Indonesia.

Wu, Y., Hu, B., J. 2009. Chromatography. Acta. 1216: 7657–7663.

Yusnita. 2003. Kultur Jaringan Cara Memperbanyak Tanaman Secara Efisien.

Agro Media Pustaka: Jakarta.

50
Lampiran 1. Data Uji Kesesuaian Sistem

a. Injek 1

A. Jumlah pelat teoritis (N)

𝑡𝑅
𝑁 = 16( 𝑤 )2 , dimana tR: waktu retensi analit dan w: lebar pada dasar puncak
1. Kinetin 4. IBA
20,41 39,47
𝑁 = 16( 0,1 )2 = 666.508 𝑁 = 16( 0,1 )2 = 2.492.609
2. IAA 5. NAA
27,35 46,51
𝑁 = 16( 0,1 )2 = 1.196.836 𝑁 = 16( 0,3 )2 = 384.565
3. ABA
38,15
𝑁 = 16( 0,1 )2 = 2.325.8676
B. HETP (High Equivalent of Theoretical Plate)
𝐿
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 𝑁 , dimana L: panjang kolom (mm) dan N: jumlah pelat teoritis
1. Kinetin 4. IBA
250 250
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 666.508 = 0,000375 𝐻𝐸𝑇𝑃 = 2.492.609 = 0,0001003
2. IAA 5. NAA
250 250
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 1.196.836 = 0,000209 𝐻𝐸𝑇𝑃 = 384.565 = 0,0006501
3. ABA
250
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 2.325.8676 = 0,000107
C. Resolusi (R)
2 (𝑡𝑅2−𝑡𝑅1)
𝑅 = (𝑊1+𝑊2) , dimana tR: waktu retensi (min) dan w: lebar dasar puncak
1. IAA – Kinetin 3. IBA – ABA
2 (27,35−20,41) 2 (39,47−38,15)
𝑅= = 69,4 𝑅= = 13,2
(0,1+0,1) (0,1+0,1)
2. ABA – IAA 4. NAA – IBA
2 (38,15−27,35) 2 (46,51−39,47)
𝑅= = 108 𝑅= = 35,2
(0,1+0,1) (0,3+0,1)

51
Lampiran 1. Data Uji Kesesuaian Sistem (Lanjutan)

b. Injek 2

A. Jumlah pelat teoritis (N)

𝑡𝑅
𝑁 = 16( 𝑤 )2 , dimana tR: waktu retensi analit dan w: lebar pada dasar puncak
1. Kinetin 4. IBA
20,25 39,47
𝑁 = 16( 0,1 )2 = 656.100 𝑁 = 16( 0,1 )2 = 2.492.609
2. IAA 5. NAA
27,08 46,19
𝑁 = 16( 0,1 )2 = 1.173.322 𝑁 = 16( 0,3 )2 = 379.291
3. ABA
37,99
𝑁 = 16( 0,1 )2 = 2.309.184
B. HETP (High Equivalent of Theoretical Plate)
𝐿
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 𝑁 , dimana L: panjang kolom (mm) dan N: jumlah pelat teoritis
1. Kinetin 4. IBA
250 250
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 656.100 = 0,000381 𝐻𝐸𝑇𝑃 = 2.492.609 = 0,0001003
2. IAA 5. NAA
250 250
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 1.173.322 = 0,000213 𝐻𝐸𝑇𝑃 = 379.291 = 0,000659
3. ABA
250
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 2.309.184 = 0,0001082
C. Resolusi (R)
2 (𝑡𝑅2−𝑡𝑅1)
𝑅 = (𝑊1+𝑊2) , dimana tR: waktu retensi (min) dan w: lebar dasar puncak
1. IAA – Kinetin 3. IBA – ABA
2 (27,08−20,25) 2 (39,47−37,99)
𝑅= = 68,3 𝑅= = 14,8
(0,1+0,1) (0,1+0,1)
2. ABA – IAA 4. NAA – IBA
2 (37,99−27,08) 2 (46,19−39,47)
𝑅= = 109,1 𝑅= = 33,6
(0,1+0,1) (0,3+0,1)

52
Lampiran 1. Data Uji Kesesuaian Sistem (Lanjutan)

c. Injek 3

A. Jumlah pelat teoritis (N)

𝑡𝑅
𝑁 = 16( 𝑤 )2 , dimana tR: waktu retensi analit dan w: lebar pada dasar puncak
1. Kinetin 4. IBA
20,18 39,38
𝑁 = 16( 0,1 )2 = 40.723 𝑁 = 16( 0,1 )2 = 2.481.255
2. IAA 5. NAA
26,95 46,02
𝑁 = 16( 0,15 )2 = 516.481 𝑁 = 16( 0,3 )2 = 376.504
3. ABA
37,91
𝑁 = 16( 0,15 )2 = 1.021.986
B. HETP (High Equivalent of Theoretical Plate)
𝐿
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 𝑁 , dimana L: panjang kolom (mm) dan N: jumlah pelat teoritis
1. Kinetin 4. IBA
250 250
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 40.723 = 0,000614 𝐻𝐸𝑇𝑃 = 2.481.255 = 0,0001007
2. IAA 5. NAA
250 250
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 516.481 = 0,000484 𝐻𝐸𝑇𝑃 = 376.504 = 0,0006640
3. ABA
250
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 1.021.986 = 0,000245
C. Resolusi (R)
2 (𝑡𝑅2−𝑡𝑅1)
𝑅 = (𝑊1+𝑊2) , dimana tR: waktu retensi (min) dan w: lebar dasar puncak
1. IAA – Kinetin 3. IBA – ABA
2 (26,95−20,18) 2 (39,38−37,91)
𝑅 = (0,15+0,1) = 56,16 𝑅 = (0,1+0,15) = 11,76
2. ABA – IAA 4. NAA – IBA
2 (37,91−26,95) 2 (46,02−39,38)
𝑅= = 73,06 𝑅= = 33,2
(0,15+0,15) (0,3+0,1)

53
Lampiran 1. Data Uji Kesesuaian Sistem (Lanjutan)

d. Injek 4

A. Jumlah pelat teoritis (N)

𝑡𝑅
𝑁 = 16( 𝑤 )2 , dimana tR: waktu retensi analit dan w: lebar pada dasar puncak
1. Kinetin 4. IBA
20,18 39,38
𝑁 = 16( 0,1 )2 = 40.723 𝑁 = 16( 0,1 )2 = 2.481.255
2. IAA 5. NAA
26,95 46,02
𝑁 = 16( 0,15 )2 = 516.481 𝑁 = 16( 0,3 )2 = 376.504
3. ABA
37,91
𝑁 = 16( 0,15 )2 = 1.021.986
B. HETP (High Equivalent of Theoretical Plate)
𝐿
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 𝑁 , dimana L: panjang kolom (mm) dan N: jumlah pelat teoritis
1. Kinetin 4. IBA
250 250
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 40.723 = 0,000614 𝐻𝐸𝑇𝑃 = 2.481.255 = 0,0001007
2. IAA 5. NAA
250 250
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 516.481 = 0,000484 𝐻𝐸𝑇𝑃 = 376.504 = 0,0006640
3. ABA
250
𝐻𝐸𝑇𝑃 = = 0,000245
1.021.986
C. Resolusi (R)
2 (𝑡𝑅2−𝑡𝑅1)
𝑅 = (𝑊1+𝑊2) , dimana tR: waktu retensi (min) dan w: lebar dasar puncak
1. IAA – Kinetin 3. IBA – ABA
2 (26,95−20,18) 2 (39,38−37,91)
𝑅 = (0,15+0,1) = 56,16 𝑅 = (0,1+0,15) = 11,76
2. ABA – IAA 4. NAA – IBA
2 (37,91−26,95) 2 (46,02−39,38)
𝑅= = 73,06 𝑅= = 33,2
(0,15+0,15) (0,3+0,1)

54
Lampiran 1. Data Uji Kesesuaian Sistem (Lanjutan)

e. Injek 5

A. Jumlah pelat teoritis (N)

𝑡𝑅
𝑁 = 16( 𝑤 )2 , dimana tR: waktu retensi analit dan w: lebar pada dasar puncak
1. Kinetin 4. IBA
20,25 39,47
𝑁 = 16( 0,1 )2 = 656.100 𝑁 = 16( 0,1 )2 = 2.492.609
2. IAA 5. NAA
27,08 46,19
𝑁 = 16( 0,1 )2 = 1.173.322 𝑁 = 16( 0,3 )2 = 379.291
3. ABA
37,99
𝑁 = 16( 0,1 )2 = 2.309.184
B. HETP (High Equivalent of Theoretical Plate)
𝐿
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 𝑁 , dimana L: panjang kolom (mm) dan N: jumlah pelat teoritis
1. Kinetin 4. IBA
250 250
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 656.100 = 0,000381 𝐻𝐸𝑇𝑃 = 2.492.609 = 0,0001003
2. IAA 5. NAA
250 250
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 1.173.322 = 0,000213 𝐻𝐸𝑇𝑃 = 379.291 = 0,000659
3. ABA
250
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 2.309.184 = 0,0001082
C. Resolusi (R)
2 (𝑡𝑅2−𝑡𝑅1)
𝑅 = (𝑊1+𝑊2) , dimana tR: waktu retensi (min) dan w: lebar dasar puncak
1. IAA – Kinetin 3. IBA – ABA
2 (27,08−20,25) 2 (39,47−37,99)
𝑅= (0,1+0,1)
= 68,3 𝑅= (0,1+0,1)
= 14,8
2. ABA – IAA 4. NAA – IBA
2 (37,99−27,08) 2 (46,19−39,47)
𝑅= = 109,1 𝑅= = 33,6
(0,1+0,1) (0,3+0,1)

55
Lampiran 1. Data Uji Kesesuaian Sistem (Lanjutan)

f. Injek 6

A. Jumlah pelat teoritis (N)

𝑡𝑅
𝑁 = 16( 𝑤 )2 , dimana tR: waktu retensi analit dan w: lebar pada dasar puncak
1. Kinetin 4. IBA
20,25 39,47
𝑁 = 16( 0,1 )2 = 656.100 𝑁 = 16( 0,15 )2 = 1.107.826
2. IAA 5. NAA
27,08 46,19
𝑁 = 16( 0,15 )2 = 5.221.476 𝑁 = 16( 0,3 )2 = 379.291
3. ABA
37,99
𝑁 = 16( 0,15 )2 = 1.026.304
B. HETP (High Equivalent of Theoretical Plate)
𝐿
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 𝑁 , dimana L: panjang kolom (mm) dan N: jumlah pelat teoritis
1. Kinetin 4. IBA
250 250
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 656.100 = 0,000381 𝐻𝐸𝑇𝑃 = 1.107.826 = 0,000226
2. IAA 5. NAA
250 250
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 5.221.476 = 0,000479 𝐻𝐸𝑇𝑃 = 379.291 = 0,000591
3. ABA
250
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 1.026.304 = 0,000244
C. Resolusi (R)
2 (𝑡𝑅2−𝑡𝑅1)
𝑅 = (𝑊1+𝑊2) , dimana tR: waktu retensi (min) dan w: lebar dasar puncak
1. IAA – Kinetin 3. IBA – ABA
2 (27,08−20,25) 2 (39,47−37,99)
𝑅 = (0,15+0,1) = 54,64 𝑅 = (0,15+0,15) = 9,87
2. ABA – IAA 4. NAA – IBA
2 (37,99−27,08) 2 (46,19−39,47)
𝑅 = (0,15+0,15) = 72,73 𝑅 = (0,3+0,15) = 29,87

56
Lampiran 1. Data Uji Kesesuaian Sistem (Lanjutan)

g. Injek 7

A. Jumlah pelat teoritis (N)

𝑡𝑅
𝑁 = 16( 𝑤 )2 , dimana tR: waktu retensi analit dan w: lebar pada dasar puncak
1. Kinetin 4. IBA
20,25 39,47
𝑁 = 16( 0,15 )2 = 291.600 𝑁 = 16( 0,1 )2 = 2.492.609
2. IAA 5. NAA
27,08 46,19
𝑁 = 16( 0,15 )2 = 5.221.476 𝑁 = 16( 0,35 )2 = 278.663
3. ABA
37,99
𝑁 = 16( 0,15 )2 = 1.026.304
B. HETP (High Equivalent of Theoretical Plate)
𝐿
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 𝑁 , dimana L: panjang kolom (mm) dan N: jumlah pelat teoritis
1. Kinetin 4. IBA
250 250
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 291.600 = 0,000857 𝐻𝐸𝑇𝑃 = 2.492.609 = 0,0001002
2. IAA 5. NAA
250 250
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 5.221.476 = 0,000479 𝐻𝐸𝑇𝑃 = 278.663 = 0,000897
3. ABA
250
𝐻𝐸𝑇𝑃 = 1.026.304 = 0,000244
C. Resolusi (R)
2 (𝑡𝑅2−𝑡𝑅1)
𝑅 = (𝑊1+𝑊2) , dimana tR: waktu retensi (min) dan w: lebar dasar puncak
1. IAA – Kinetin 3. IBA – ABA
2 (27,08−20,25) 2 (39,47−37,99)
𝑅 = (0,15+0,15) = 45,53 𝑅 = (0,1+0,15) = 11,84
2. ABA – IAA 4. NAA – IBA
2 (37,99−27,08) 2 (46,19−39,47)
𝑅 = (0,15+0,15) = 72,73 𝑅 = (0,35+0,1) = 29,87

57
 Lampiran 2. Data Presisi masing masing Standar Hormon Pertumbuhan

uji presisi standar Kinetin Uji Presisi Standar IAA Uji Presisi ABA
Konsentrasi Retention Konsentrasi Retention Konsentrasi Retention
Ulangan Ulangan Ulangan Luas
standar time Luas Area standar time Luas Area standar time
inject inject inject Area
(ppm) (min) (ppm) (min) (ppm) (min)
1 19,95 12.023.409 1 27,31 22.371.965 1 38,62 2.832.421
2 19,93 12.039.155 2 27,31 23.202.145 2 38,62 2.840.841
3 19,95 12.058.312 3 27,31 22.364.830 3 38,62 2.850.240
200 4 19,95 12.039.842 200 4 27,31 22.301.235 200 4 38,62 2.845.062
5 19,95 12.026.266 5 27,31 22.258.501 5 38,62 2.849.204
6 19,93 12.014.129 6 27,31 22.283.919 6 38,62 2.814.037
7 19,93 12.085.921 7 27,31 22.373.900 7 38,62 2.827.280
Rata - rata 12.041.005 Rata - rata 22.450.928 Rata - rata 2.837.012
SD 24.395,8 SD 334.473,8 SD 13.208,13
%RSD 0,20% %RSD 1,49% %RSD 0,47%

58
Lampiran 2. Data Presisi masing masing Standar Hormon Pertumbuhan (Lanjutan)
Uji Presisi Standar IBA Uji Presisi Standar NAA
Konsentrasi
Ulangan Retention Konsentrasi Ulangan Retention
standar Luas Area Luas Area
inject time (min) standar (ppm) inject time (min)
(ppm)
1 44,55 3.260.488 1 46,48 2.078.992
2 44,55 3.252.282 2 46,47 2.041.580
3 44,59 3.219.689 3 46,43 2.068.828
200 4 44,55 3.245.619 200 4 46,48 2.084.046
5 44,55 3.251.693 5 46,47 2.049.153
6 44,59 3.220.154 6 46,48 2.080.335
7 44,55 3.212.865 7 46,43 2.069.780
Rata - rata 3.237.541 Rata - rata 2.067.531
SD 19.318,82 SD 16.258,27
%RSD 0,60% %RSD 0,79%

Contoh perhitungan standar kinetin 200 ppm

Perhitungan rata-rata luas area :

𝑥1 + 𝑥2 + 𝑥3 + 𝑥4 + 𝑥5 + 𝑥6 + 𝑥7
𝑅𝑎𝑡𝑎 − 𝑟𝑎𝑡𝑎 =
𝑛
12023409+12039155+12058312+12039842+12026266+12014129+12085921
𝑅𝑎𝑡𝑎 − 𝑟𝑎𝑡𝑎 = 7
= 12.041.005

59
Lampiran 2. Data Presisi masing masing Standar Hormon Pertumbuhan (Lanjutan)

Perhitungan Standar Deviasi (SD):

(∑(𝑥−𝑥𝑟𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎))2
SD = √ 𝑛−1

(12023409−12041005)2 +(12039155−12041005)2 +(12058312−12041005)2 +(12039842−12041005)2 +(12026266−12041005)2 +

SD= √ 7−1

(12014129−12041005)2 +(12085921−12041005)2
√
7−1

= 24.395

Perhitungan %RSD:

𝑆𝐷 24395,8
%𝑅𝑆𝐷 = 𝑅𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑋100% = 12041005 = 0,20 %

Dimana :

x = luas area standar

n = banyaknya pengulangan injek

60
Lampiran 3. Data Linieritas Standar Hormon Pertumbuhan

Linieritas Standar Kinetin

5000000
y = 19967,89389x - 33657,71579
4000000
R² = 0,999
3000000
luas area

2000000

1000000

0
0 50 100 150 200 250
-1000000
konsentrasi (ppm)

Linieritas Standar IAA

3000000
y = 18541,69114x + 26218,52958
2500000 R² = 0,999
2000000
luas area

1500000

1000000

500000

0
0 50 100 150 200
konsentrasi (ppm)

61
Lampiran 3. Data Linieritas Standar Hormon Pertumbuhan (Lanjutan)

Linieritas Standar ABA

900000
800000 y = 3947,292211x + 2550,098246
R² = 0,999
700000
600000
luas area 500000
400000
300000
200000
100000
0
0 50 100 150 200 250
konsentrasi (ppm)

Linieritas Standar IBA

1600000
y = 26989,70286x + 22178,42857
1400000
R² = 0,999
1200000
1000000
luas area

800000
600000
400000
200000
0
0 10 20 30 40 50 60
konsentrasi (ppm)

62
Lampiran 3. Data Linieritas Standar Hormon Pertumbuhan (Lanjutan)

Linieritas Standar NAA

900000
y = 31025,53143x + 12422,19048
800000
R² = 0,999
700000
600000
luas area
500000
400000
300000
200000
100000
0
0 5 10 15 20 25 30
konsentrasi (ppm)

63
Lampiran 4. Data Linieritas Standar Hormon Pertumbuhan

Volume Larutan Konsentrasi WT Intercept

L. Area (y) x.y x2 Y2 slope (b) r r2
Standar MeOH (ppm) (x) (menit) (a)
Kinetin
0 100 0 0 0 0 0 0
12,5 87,5 25 20,06 473.975 11.849.375 625 224.652.300.625
25 75 50 20,44 883.248 44.162.400 2.500 780.127.029.504
19.968 -33.658 0,9992 0,9984
50 50 100 20,37 1.987.273 198.727.300 10.000 3.949.253.976.529
75 25 150 20,37 2.993.556 449.033.400 22.500 8.961.377.525.136
100 0 200 20,41 3.943.146 788.629.200 40.000 15.548.400.377.316
IAA
- 100 - - 0 0 0 0
10 90 20 26,09 408.825 8.176.500 400 167.137.880.625
20 80 40 26,11 787.620 31.504.800 1.600 620.345.264.400
18.542 26.219 0,9998 0,9996
40 60 80 26,11 1.510.474 120.837.920 6.400 2.281.531.704.676
62,5 37,5 125 26,17 2.350.618 293.827.250 15.625 5.525.404.981.924
100 - 150 26,47 2.794.576 419.186.400 22.500 7.809.655.019.776
ABA
- 100 0 0 0 0 0 0
12,5 87,5 25 38,09 100.575 2.514.375 625 10.115.330.625
25 75 50 38,17 206.000 10.300.000 2.500 42.436.000.000
3.947 2.550 0,9999 0,9998
50 50 100 37,65 393.799 39.379.900 10.000 155.077.652.401
75 25 150 37,93 595.850 89.377.500 22.500 355.037.222.500
100 - 200 37,93 791.405 158.281.000 40.000 626.321.874.025

64
 Lampiran 4. Data Linieritas Standar Hormon Pertumbuhan (Lanjutan)

Volume Larutan Konsentrasi WT Intercept

L. Area (y) x.y x2 Y2 slope (b) r r2
Standar MeOH (ppm) (x) (menit) (a)
IBA
- 100 0 0 0 0 0 0
5 95 10 42,89 307.340 3.073.400 100 94.457.875.600
10 90 20 42,81 573.231 11.464.620 400 328.593.779.361
26.990 22.178 0,9992 0,9984
15 85 30 42,77 842.124 25.263.720 900 709.172.831.376
20 80 40 42,73 1.097.316 43.892.640 1.600 1.204.102.403.856
25 75 50 42,68 1.361.515 68.075.750 2.500 1.853.723.095.225
NAA
- 100 0 0 0 0 0 0
2,5 97,5 5 47,09 177.209 886.045 25 31.403.029.681
5 95 10 47,07 325.028 3.250.280 100 105.643.200.784
31.026 12.422 0,999 0,998
7,5 92,5 15 47,03 483.745 7.256.175 225 234.009.225.025
10 90 20 46,02 637.476 12.749.520 400 406.375.650.576
12,5 87,5 25 46,97 777.990 19.449.750 625 605.268.440.100

65
Lampiran 4. Data Linieritas Standar Hormon Pertumbuhan (Lanjutan)

Contoh perhitungan slope (b) dan intersept (a) pada hormon Kinetin

𝑛.∑ 𝑥𝑦−∑ 𝑥.𝑦 (∑ 𝑦)−(𝑏.∑ 𝑥)

Slope (b) = 𝑛.∑ 𝑥 2 −(∑ 𝑥)2 Intercept (a)= 𝑛
(6 x 1492401675)− (525 x 10281198) (10281198)−(19968 𝑥 525)
= =
6 𝑥 75625)−(525)2 6

= 19.968 = -33.658

Sehingga diperoleh persamaan regresi : y = a + bx

y = -33.658 + 19.968x

𝑛.∑ 𝑥𝑦−∑ 𝑥.𝑦

r=
√𝑛.∑ 𝑥 2 −(∑ 𝑥)2 .√𝑛.∑ 𝑦 2 −(∑ 𝑦)2

(6 x 1492401675)− (525 x 10281198)

=
√(6 𝑥 75625)−(525)2 .√(6 𝑥 29463811209110)−(10281198)2

r2 = (0,9984)2

𝑟 = 0,9992

66
 Lampiran 5. Data Presisi Standar Campuran Hormon Pertumbuhan

Uji presisi standar kinetin padastandar Uji Presisi Standar IAA padastandar
campuran campuran Uji Presisi standar ABA pada standar campuran
Konsentrasi Retention Konsentrasi Retention Konsentrasi Retention
Ulangan Luas Ulangan Ulangan
standar time standar time Luas Area standar time Luas Area
inject Area inject inject
(ppm) (min) (ppm) (min) (ppm) (min)
1 20,41 699.382 1 27,35 1.893.018 1 38,15 681.841
2 20,25 707.476 2 27,08 1.878.561 2 37,99 697.099
3 20,18 717.051 3 26.95 1.882.883 3 37,91 690.213
25 4 20,18 713.240 25 4 26,95 1.854.078 25 4 37,91 699.741
5 20,25 691.366 5 27,08 1.879.603 5 37,99 695.775
6 20,25 704.146 6 27,08 1.892.213 6 37,99 689.720
7 20,25 707.739 7 27,08 1.878.561 7 37,99 689.917
Rata - rata 705.771 Rata - rata 1.879.845 Rata - rata 692.044
SD 8.570,962 SD 12.929,42 SD 6.001,334
%RSD 1,21% %RSD 0,69% %RSD 0,87%

67
Lampiran 5. Data Presisi Standar Campuran Hormon Pertumbuhan (Lanjutan)

Uji Presisi Standar IBA pada standar campuran Uji Presisi Standar NAA pada standar campuran
Konsentrasi Ulangan Retention Konsentrasi Ulangan Retention
Luas Area Luas Area
standar (ppm) inject time (min) standar (ppm) inject time (min)
1 39,68 109.895 1 46,51 7.123.242
2 39,47 110.053 2 46,19 7.029.444
3 39,38 109.359 3 46,02 7.077.637
25 4 39,38 108.799 25 4 46,02 7.039.578
5 39,47 100.784 5 46,19 7.289.799
6 39,47 102.402 6 46,19 7.121.660
7 39,47 104.283 7 46,19 7.124.275
Rata - rata 106.511 Rata - rata 7.115.091
SD 3.915,56 SD 86.753,72
%RSD 3,68% %RSD 1,22%

Contoh perhitungan standar campuranNAA 25 ppm

Perhitungan rata-rata luas area :

𝑥1 + 𝑥2 + 𝑥3 + 𝑥4 + 𝑥5 + 𝑥6 + 𝑥7
𝑅𝑎𝑡𝑎 − 𝑟𝑎𝑡𝑎 =
𝑛
7123242+7029444+7077637+7039578+7289799+7121660+7124275
𝑅𝑎𝑡𝑎 − 𝑟𝑎𝑡𝑎 = = 7.115.091
7

68
Lampiran 5. Data Presisi Standar Campuran Hormon Pertumbuhan (Lanjutan)

Perhitungan Standar Deviasi (SD):

(∑(𝑥−𝑥 𝑟𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎))2
SD = √ 𝑛−1

(7123242−7115091)2 +(7029444−7115091)2 +(7077637−7115091)2 +(7039578−7115091)2 +(7289799−7115091)2 +

SD = √ 7−1

(7121660−7115091)2 +(7124275−7115091)2
√
7−1

= 8.6753,72

Perhitungan %RSD:

𝑆𝐷 86753,72
%𝑅𝑆𝐷 = 𝑅𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑋100% = = 1,22 %
7115091

Dimana :

x = luas area standar

n = banyaknya pengulangan injek

69
Lampiran 6. Data Presisi Analit pada Sampel Media In Vitro

Presisi pengukuran Kinetin pada sampel

Volume W Retention
Ulangan Luas Konsentrasi
pelarut sampel time
sampel Area Sampel (ppm)
(ml) (gram) (min)
1 21,06 115.029 0,014892528
2 21,06 116.484 0,015038261
3 21,06 114.536 0,014843149
4 1 500 21,06 116.484 0,015038261
5 21,06 119.943 0,015384716
6 21,06 119.214 0,015311699
7 21,06 118.218 0,015211939
Rata – rata konsentrasi 0,015
SD 0,000206
%RSD 1,36%

Presisi pengukuran IAA pada sampel

Volume W
Ulangan Retention Luas Konsentrasi
pelarut sampel
sampel time (min) Area Sampel (ppm)
(ml) (gram)
1 27,87 164.317 0,014895696
2 27,87 142.165 0,01250631
3 27,87 139.233 0,012190055
4 1 500 27,87 137.518 0,01200507
5 27,87 136.070 0,011848884
6 27,87 131.860 0,011394779
7 27,87 136.165 0,011859131
Rata – rata Konsentrasi 0,0124
SD 0,00116
%RSD 9,35%

70
Lampiran 6. Data Presisi Analit pada Sampel Media In Vitro(Lanjutan)

Presisi pengukuran ABA pada sampel

Volume W Retention Konsentrasi
Ulangan Luas
pelarut sampel time Sampel
sampel Area
(ml) (gram) (min) (ppm)
1 38,79 1.552.041 0,7851
2 38,79 1.546.406 0,7822
3 38,79 1.545.159 0,7816
4 1 500 38,79 1.536.535 0,7773
5 38,79 1.530.507 0,7742
6 38,79 1.523.600 0,7707
7 38,79 1.526.573 0,7722
Rata – rata Konsentrasi 0,7778
SD 0,0052
%RSD 0,71%

Presisi pengukuran IBA pada sampel

Volume W Retention
Ulangan Luas Konsentrasi
pelarut sampel time
sampel Area Sampel (ppm)
(ml) (gram) (min)
1 45,00 2.139.543 0,1569
2 45,00 2.142.713 0,1571
3 45,00 2.139.543 0,1569
4 1 500 45,00 2.151.549 0,1578
5 45,00 2.150.072 0,1577
6 45,00 2.157.818 0,1582
7 45,00 2.152.940 0,1579
Rata – rata Konsentrasi 0,1575
SD 0,00053
%RSD 0,34%

71
Lampiran 6. Data Presisi Analit pada Sampel Media In Vitro(Lanjutan)
Perhitungan konsentrasi IBA pada Sampel:
LuasArea−intercept VolumePelarut (mL)
Konsentrasi = ( )X( )
Slope Beratsampel (gr)

2139543−22178 1
=(
26990
) x (500)
= 0,158 ppm

Perhitungan rata rata luas area Sampel pada IBA

𝑥1 + 𝑥2 + 𝑥3 + 𝑥4 + 𝑥5 + 𝑥6 + 𝑥7
𝑅𝑎𝑡𝑎 − 𝑟𝑎𝑡𝑎 =
𝑛
0,1569+0,1571+0,1569+0,1578+0,1577+0,1583+0,1579
𝑅𝑎𝑡𝑎 − 𝑟𝑎𝑡𝑎 = = 0,1575
7

Perhitungan Standar Deviasi (SD):

(∑(𝑥−𝑥 𝑟𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎))2
SD = √ 𝑛−1

(0,1569−0,1575)2 +(0,1571−0,1575)2 +(0,1569−0,1575)2 +(0,1578−0,1575)2 +

SD = √ 7−1

+(0,1577−0,1575)2 +(0,1583−0,1575)2 +(0,1579−0,1575)2

√
7−1

= 0,00053

Perhitungan %RSD:

𝑆𝐷 0,1575
%𝑅𝑆𝐷 = 𝑅𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎 𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑋100% = 0,00053 = 0,34 %

Dimana :
x = luas area standar
n = banyaknya pengulangan injek

72
Lampiran 7. Data Akurasi pada Sampel Media In Vitro
% Recovery sampel Kinetin pada Sampel
L area L area
Ulangan L area L area
sampel sampel %recovery
injek standar teoritis
adisi tanpa adisi
1 229250 624550 -395300 -7%

2 227716 627325 -399609 -7%

3 221519 627843 -406324 -7%

4 225088 623060 6020502,4 -397972 -7%

5 221243 626306 -405063 -7%

6 225749 624281 -398532 -7%

7 229403 632576 -403173 -7%

rata rata -7%

% Recovery sampel IAA pada Sampel

L area L area
ulangan L area L area
sampel sampel %recovery
inject standar teoritis
adisi tanpa adisi
1 669301 197490 471811 4%

2 660319 195646 464673 4%

3 665516 193758 471758 4%

4 661804 194279 11225464 467525 4%

5 665516 190816 474700 4%

6 665989 191750 474239 4%

7 660782 193202 467580 4%

rata rata 4%

73
Lampiran 7. Data Akurasi pada Sampel Media In Vitro (Lanjutan)

% Recovery sampel ABA pada Sampel

L area L area
ulangan L area L area
sampel sampel %recovery
inject standar teoritis
adisi tanpa adisi

1 777549 1475734 -698185 -49%

2 772688 1468397 -695709 -49%
3 773238 1462880 -689642 -49%
4 770319 1445869 1418506,071 -675550 -48%
5 785694 1446818 -661124 -47%
6 779378 1438065 -658687 -46%
7 771255 1458556 -687301 -48%
rata rata -48%

% Recovery sampel IBA pada Sampel

L area L area
ulangan L area L area
sampel sampel %recovery
inject standar teoritis
adisi tanpa adisi
1 871960 2143297 -1271337 -79%

2 874775 2139917 -1265142 -78%

3 870963 2141682 -1270719 -78%

4 870988 2142389 1618771 -1271401 -79%

5 877587 2139917 -1262330 -78%

6 876519 2087351 -1210832 -75%

7 873489 2053984 -1180495 -73%

rata rata -77%

74
Lampiran 7. Data Akurasi pada Sampel Media In Vitro (Lanjutan)
Contoh perhitungan akurasi pada IAA:

Luas area teoritis (a) = L. Area sampel adisi std – L. Area sampel tanpa adisi std

= 669301– 197490 = 471811

L.area standar mix (data presisi)

Luas area standar (b) = 2

22450928
= = 11225464
2

Penentuan % recovery:

𝑎
%recovery = 𝑏 𝑥 100%

471811
= 11225464 𝑥100%

= 4%

75
Lampiran 8. Data Robustness Standar (MeOH : asam format 0,1% pH 3,2 (15:85))

KINETIN IAA ABA

Konsentrasi Retention Konsentrasi Konsentrasi
Ulangan Luas Ulangan Retention Luas Ulangan Retention
standar time standar standar Luas Area
inject Area inject time (min) Area inject time (min)
(ppm) (min) (ppm) (ppm)
1 17,49 2.746.508 1 19,39 3.991.340 1 32,10 1.877.999
2 17,70 2.731.017 2 20.86 3.982.534 2 32,10 1.837.238
3 17,49 2.751.154 3 20.86 3.982.375 3 32,10 1.819.709
200 4 17,49 2.710.764 200 4 20,86 3.983.329 200 4 32,57 1.894.526
5 17,70 2.729.866 5 20,86 3.987.007 5 32,57 1.852.459
6 17,70 2.731.504 6 19,39 3.985.945 6 32,10 1.819.709
7 17,70 2.656.612 7 19,39 3.984.261 7 32,10 1.862.576
Rata - rata 2.722.489 Rata - rata 3.985.256 Rata - rata 1.852.031
SD 31.844,06 SD 3.187,70 SD 28.576,79
%RSD 1,17% %RSD 0,08% %RSD 1,54%

76
Lampiran 8. Data Robustness Standar (MeOH : asam format 0,1% pH 3,2 (15:85)) (Lanjutan)

IBA NAA
Konsentrasi Konsentrasi
Ulangan Retention Luas Ulangan Retention Luas
standar standar
inject time (min) Area inject time (min) Area
(ppm) (ppm)
1 37,07 3.738.018 1 38,22 6.114.994
2 37,07 3.762.360 2 38,22 6.164.081
3 37,07 3.704.927 3 38,22 6.148.547
200 4 37,05 3.683.937 200 4 38,22 6.144.511
5 37,05 3.692.422 5 38,60 6.129.387
6 37,05 3.681.204 6 38,60 6.101.724
7 37,05 3.667.462 7 38,60 6.121.674
Rata - rata 3.704.333 Rata - rata 6.132.131
SD 34.045,20 SD 21.520,12
%RSD 0,92% %RSD 0,35%

Perhitungan rata rata luas area Kinetin

𝑥1 + 𝑥2 + 𝑥3 + 𝑥4 + 𝑥5 + 𝑥6 + 𝑥7
𝑅𝑎𝑡𝑎 − 𝑟𝑎𝑡𝑎 =
𝑛
2746508+2731017+2751154+2710764+2729866+2731504+2656612
𝑅𝑎𝑡𝑎 − 𝑟𝑎𝑡𝑎 = = 2.722.489
7

Perhitungan Standar Deviasi (SD):

(∑(𝑥−𝑥 𝑟𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎))2
SD = √ 𝑛−1

77
Lampiran 8. Data Robustness Standar (MeOH : asam format 0,1% pH 3,2 (15:85))
(Lanjutan)

(2746508−2722489)2 +(2731017−2722489)2 +(2751154−2722489)2 +(2710764−2722489)2 +(2729866−2722489)2 +

SD = √ 7−1

(2731504−2722489)2 +(2656612−2722489)2
√
7−1

= 31.844,06

Perhitungan %RSD:
𝑆𝐷 2722489
%𝑅𝑆𝐷 = 𝑅𝑎𝑡𝑎−𝑟𝑎𝑡𝑎𝑎𝑟𝑒𝑎 𝑋100% = 31844,06 = 1,17%

Dimana :
x = luas area standar
n = banyaknya pengulangan injek

78
 Lampiran 9. Data Limit Deteksi (LOD) dan Limit Kuantifikasi (LOQ) Standar Hormon Pertumbuhan

Volume (µL) Analit

Yi (Y-Yi)2 Σ(Y-Yi)2 S(y/x)2 S(y/x) LOD LOQ
MeOH Standar ppm RT (menit) Luas area (Y)
Kinetin
0 0 0 0 0 0 0
90 10 20 19,06 251.119 258.742 58.110.129
85 15 30 19,49 390.851 385.762 25.897.921
1.183.715.333 394.571.778 19.863,83 4,69 15,64
80 20 40 19,43 524.787 512.782 144.120.025
75 25 50 20,44 659.095 639.802 372.219.849
70 30 60 20,63 742.669 766.822 583.367.409
IAA
95 5 10 28,44 204.894 197.991 47.651.409
90 10 20 25,96 390.684 387.551 9.815.689
85 15 30 26,55 585.861 577.111 76.562.500 296.283.759 98.761.253 9.937,87 1,57 5,24
80 20 40 25,57 754.115 766.671 157.653.136
75 25 50 25,71 958.376 956.231 4.601.025
ABA
90 10 20 39,12 152.354 175.092 517.016.644
85 15 30 38,17 243.153 259.052 252.778.201
80 20 40 38,99 326.024 343.012 288.592.144 1.336.298.737 267.259.745 16.348,08 5,84 19,47
75 25 50 39,11 413.244 426.972 188.457.984
70 30 60 38,44 501.474 510.932 89.453.764

79
 Lampiran 9. Data Persamaan Garis Limit Deteksi dan Limit Kuantifikasi Standar Hormon Pertumbuhan (Lanjutan)

Volume (µL) Analit

Yi (Y-Yi)2 Σ(Y-Yi)2 S(y/x)2 S(y/x) LOD LOQ
MeOH Standar ppm RT (menit) Luas area (Y)
IBA
96 4 8 43,61 151.865 151.932 4.489
94 6 12 43,39 217.945 227.248 86.545.809
92 8 16 43,53 299.138 302.564 11.737.476 107.284.242 21.456.846 4.632,15 0,74 2,46
90 10 20 43,13 379.118 377.880 1.532.644
88 12 24 42,81 450.464 453.196 7.463.824
NAA
96 4 8 51,21 148.901 171.044 490.312.449
94 6 12 51,07 237.829 253.516 246.081.969
92 8 16 50,81 328.784 335.988 51.897.616 1.043.715.254 208.743.049 14.447,94 2,10 7,01
90 10 20 50,49 409.928 418.460 72.795.024
88 12 24 50,56 487.418 500.932 182.628.196

Data Limit Deteksi (LOD) dan Limit Kuantifikasi (LOQ) pada IBA:
∑(𝑌−𝑌𝑖)2 107284242
Yi = a + bx S (y/x)2 = = = 21.456.846,4
𝑛−2 5−2

= 13.00 + 18.829 (8) = 151.932 S (y/x) = √21456846,4 = 4.632,15

(Y-Yi)2 = (15.865-151.932)2 = 4.489

3. S (y/x) 3 𝑥 4632,1535 10. S (y/x) 10 𝑥 4632,1535

LOD = = = 0,73 LOQ = = = 2,46
𝑏 18829 𝑏 18829

80
Lampiran 10. Data Persamaan Garis Limit Deteksi dan Limit Kuantifikasi Standar
Hormon Pertumbuhan
LOD LOQ Standar Kinetin
1000000
y = 12702x + 4702.4
800000
R² = 0.9968
luas area

600000

400000

200000

0
0 10 20 30 40 50 60 70
konsentrasi (ppm)

LOD LOQ Standar IAA

1200000
1000000 y = 18956x + 8413.1
R² = 0.9994
800000
luas area

600000
400000
200000
0
0 10 20 30 40 50 60
konsentrasi (ppm)

81
Lampiran 10. Data Persamaan Garis Limit Deteksi dan Limit Kuantifikasi Standar
Hormon Pertumbuhan (Lanjutan)

LOD LOQ Standar ABA

600000

500000
y = 8396.4x - 7172.4
400000 R² = 0.9991
luas area

300000

200000

100000

0
0 10 20 30 40 50 60 70
-100000
konsentrasi (ppm)

LOD LOQ Standar IBA

500000
y = 18829x - 1300.9
400000 R² = 0.9995
300000
luas area

200000

100000

0
0 5 10 15 20 25 30
-100000
konsentrasi (ppm)

82
Lampiran 10. Data Persamaan Garis Limit Deteksi dan Limit Kuantifikasi Standar
Hormon Pertumbuhan (Lanjutan)

LOD LOQ Standar NAA

600000

500000
y = 20618x - 6100.4
400000 R² = 0.9988
luas area

300000

200000

100000

0
0 5 10 15 20 25 30
-100000
konsentrasi (ppm)

83
Lampiran 11. Data Kromatogram

Presisi masing-masing standar hormon tumbuh, fasa gerak metanol : asam format 0,1%

pH 3,2 (10:90)

1. Kinetin 200 ppm

2. IAA 200 ppm

84
Lampiran 11. Data Kromatogram (Lanjutan)

3. ABA 200 ppm

4. IBA 200 ppm

85
Lampiran 11. Data Kromatogram (Lanjutan)

5. NAA 200 ppm

6. Pelarut Metanol

86
Lampiran 11. Data Kromatogram (Lanjutan)

Presisi standar hormon pertumbuhan campuran

1. Kinetin 200 ppm

2. IAA 200 ppm

3. ABA 200 ppm

4. IBA 200 ppm

5. NAA 200 ppm

Injek 1

87
Lampiran 11. Data Kromatogram (Lanjutan)

Linieritas standar masing-masing standar hormon

1. Kinetin 25 ppm

2. IAA 20 ppm

88
Lampiran 11. Data Kromatogram (Lanjutan)

3. ABA 50 ppm

4. IBA 10 ppm

89
Lampiran 11. Data Kromatogram (Lanjutan)

5. NAA 5 ppm

90
Lampiran 11. Data Kromatogram (Lanjutan)

Sampel 1 (tanpa adisi standar)

%Recovery (Sampel adisi standar)

91
Lampiran 11. Data Kromatogram (Lanjutan)

Spektrum DAD (Diode Aray Detector)

1. Kinetin

Spektrum DAD standar kinetin

Spektrum DAD kinetin pada sampel (tanpa adisi)

92
Lampiran 11. Data Kromatogram (Lanjutan)

Spektrum DAD kinetin pada sampel adisi standar

2. IAA

Spektrum DAD standar IAA

93
Lampiran 11. Data Kromatogram (Lanjutan)

Spektrum DAD IAA pada sampel (tanpa adisi)

Spektrum DAD IAA pada sampel adisi standar

94
Lampiran 11. Data Kromatogram (Lanjutan)

3. ABA

Spektrum DAD standar ABA

Spektrum DAD ABA pada sampel (tanpa adisi)

95
Lampiran 11. Data Kromatogram (Lanjutan)

Spektrum DAD ABA pada sampel adisi standar

4. IBA

Spektrum DAD standar IBA

96
Lampiran 11. Data Kromatogram (Lanjutan)

Spektrum DAD IBA pada sampel (tanpa adisi)

Spektrum DAD IBA pada sampel adisi standar

97
Lampiran 11. Data Kromatogram (Lanjutan)

5. NAA

Spektrum DAD standar NAA

Spektrum DAD NAA pada sampel (tanpa adisi)

98
Lampiran 11. Data Kromatogram (Lanjutan)

Spektrum DAD NAA pada sampel adisi standar

99
Lampiran 11. Data Kromatogram (Lanjutan)

Robustness standar, fase gerak metanol : asam format 0,1 % pH 3,2 (15:85)

1. Kinetin 200 ppm

2. IAA 200 ppm

100
Lampiran 11. Data Kromatogram (Lanjutan)

3. ABA 200 ppm

4. IBA 200 ppm

101
Lampiran 11. Data Kromatogram (Lanjutan)

5. NAA 200 ppm

102
Lampiran 11. Data Kromatogram (Lanjutan)

Limit Kuantifikasi dan Limit Deteksi (LOD LOQ)

a. Kinetin 20 ppm

b. IAA 10 ppm

103
Lampiran 11. Data Kromatogram (Lanjutan)

c. ABA 20 ppm

d. IBA 8 ppm

104
Lampiran 11. Data Kromatogram (Lanjutan)

e. NAA 8 ppm

105